Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 8905:2011 quy định phương pháp enzym để xác định hàm lượng tổng số của axit axetic cùng các muối axetat trong nước rau quả và các sản phẩm có liên quan. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.
TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8905:2011 EN 12632:1999 NƯỚC RAU QUẢ – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AXIT AXETIC (AXETAT) BẰNG ENZYM – PHƯƠNG PHÁP ĐO PHỔ NAD Fruit and vegetable juices – Enzymatic determination of acetic acid (acetate) content – NAD spectrometric method Lời nói đầu TCVN 8905:2011 hồn tồn tương đương với EN 12632:1999; TCVN 8905:2011 Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F10 Rau sản phẩm rau biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Công nghệ công bố NƯỚC RAU QUẢ – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AXIT AXETIC (AXETAT) BẰNG ENZYM – PHƯƠNG PHÁP ĐO PHỔ NAD Fruit and vegetable juices – Enzymatic determination of acetic acid (acetate) content – NAD spectrometric method Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy định phương pháp enzym để xác định hàm lượng tổng số axit axetic muối axetat nước rau sản phẩm có liên quan Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm cơng bố áp dụng phiên nêu Đối với tài liệu viện dẫn khơng ghi năm cơng bố áp dụng phiên nhất, bao gồm sửa đổi, bổ sung (nếu có) TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987), Nước dùng để phân tích phòng thí nghiệm – u cầu kĩ thuật phương pháp thử Kí hiệu chữ viết tắt 3.1 Kí hiệu Trong tiêu chuẩn sử dụng kí hiệu sau: c nồng độ chất; ρ nồng độ khối lượng; g gia tốc trọng trường bề mặt trái đất (9,81 m/s2) 3.2 Chữ viết tắt Trong tiêu chuẩn sử dụng chữ viết tắt sau: ACS Axetyl coenzym A synthetaza; CoA Coenzym A; ATP Adenosin-5'-tri-phosphat; AMP Adenosin-mono-phosphat; CS Xitrat synthaza; NAD β-Nicotinamit-adenin-dinucleotit; NADH β-Nicotinamit-adenin-dinucleotit, dạng khử; MDH Malat-dehydrogenaza; IU đơn vị quốc tế (IU) hoạt độ enzym xúc tác chuyển đổi µmol chất phút 25 oC điều kiện chuẩn Nguyên tắc Axit axetic (axetat) chuyển hóa thành axetyl-CoA (phản ứng 1) có mặt enzym axetylcoenzym A-synthetaza (ACS) với adenosin-5'-tri-phosphat (ATP) coenzym A (CoA): Axetat + ATP + CoA ACS axetyl-CoA + AMP + pyrophosphat (1) Axetyl-CoA phản ứng với oxaloaxetat sinh xitrat, có mặt xitrat synthaza (CS) (phản ứng 2): Axetyl-CoA + oxaloaxetat + H2O CS xitrat + CoA (2) Oxaloaxetat cần cho phản ứng (2) tạo thành từ malat nicotinamit-adenin dinucleotit (NAD) có mặt malat dehydrogenaza (MDH) (phản ứng 3) Trong phản ứng này, NAD khử thành NADH Malat + NAD+ MDH oxaloaxetat + NADH + H+ (3) Phép xác định dựa tạo thành NADH, đo độ tăng độ hấp thụ bước sóng 340 nm, 334 nm 365 nm Do sử dụng phản ứng thị trước, lượng NADH tạo thành tỉ lệ với nồng độ axit axetic khơng phải hàm tuyến tính Thuốc thử 5.1 Yêu cầu chung Chỉ sử dụng thuốc thử tinh khiết phân tích nước loại nêu TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987) CHÚ THÍCH: Phép xác định thực cách sử dụng kit thử phức hợp có bán sẵn thị trường 5.2 Trietanolamin hydroclorua 5.3 Axit L-malic 5.4 Magie clorua, MgCl2.6H2O 5.5 Dung dịch kali hydroxit, c(KOH) = mol/l 5.6 Nicotinamit-adenin dinucleotit (khoảng 98 %) 5.7 Coenzym A 5.8 Muối dinatri adenosin-5'-triphosphat, ATP-Na2H2 5.9 Natri hydrocacbonat, NaHCO3 5.10 Malat dehydrogenaza, huyền phù amoni sulfat, c(MDH) = 3,2 mol/l, hoạt độ riêng khoảng 200 IU/mg 5.11 Xitrat synthaza, huyền phù amoni sulfat, c(CS) = 3,2 mol/l, hoạt độ riêng khoảng 110 IU/mg 5.12 Axetyl-CoA synthetaza, dạng đông khô 5.13 Amoni sulfat, (NH4)2SO4 5.14 Natri axetat, CH3COONa.3H2O 5.15 Dung dịch đệm, pH = 8,4 Hoà tan 7,59 g trietanolamin hydroclorua (5.2), 420 mg axit malic (5.3) 210 mg magie clorua (5.4) khoảng 70 ml nước Chỉnh pH dung dịch tới ph 8,4 với khoảng 21 ml dung dịch kali hydroxit (5.5) thêm nước đến 100 ml Dung dịch đệm pha bền tuần + oC 5.16 Dung dịch nicotinamit-adenin dinucleotit/Coenzym A Hòa tan 144 mg NAD (5.6) 30 mg CoA (5.7) ml nước Dung dịch pha bền tuần + oC 5.17 Dung dịch adenosin-5'-triphosphat Hoà tan 300 mg ATP-Na2H2 (5.8) 300 mg natri hydrocacbonat (5.9) ml nước Dung dịch pha bền tuần + oC 5.18 Huyền phù malat dehydrogenaza/xitrat synthaza Trộn 0,6 ml huyền phù MDH (5.10) 0,6 ml huyền phù CS (5.11) Huyền phù pha bền năm + oC 5.19 Huyền phù axetyl-CoA synthetaza Hoà tan 20 mg ACS dạng đông khô (5.12) 0,5 ml dung dịch amoni sulfat (5.20) Huyền phù pha bền tuần + oC 5.20 Dung dịch amoni sulfat, c((NH4)2SO4) = mol/l Hoà tan 13,2 g amoni sulfat (5.13) khoảng 80 ml nước, chỉnh đến pH 7,3 khoảng 0,2 ml dung dịch kali hydroxit (5.5) thêm nước đến 100 ml Dung dịch pha bền năm 20 oC đến 25 oC 5.21 Dung dịch chuẩn axetat, c(CH3COO–) = mmol/l Hòa tan 68 mg natri axetat (5.14) 100 ml nước Chuẩn bị dung dịch trước sử dụng Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thơng thường cụ thể sau: 6.1 Pipet dùng để thử nghiệm enzym, có chia vạch dọc thân pipet đầu tip phân phối dài, không chia vạch 6.2 Pipet, có độ xác tương đương 6.1 (thay cho 6.1), ví dụ thay đổi dung tích pipet 6.3 Cuvet, làm thạch anh, thủy tinh nhựa, có chiều dài đường quang cm có độ hấp thụ khơng đáng kể bước sóng 334 nm, 340 nm 365 nm 6.4 Máy đo quang đơn phổ, có đèn thủy ngân màng lọc đo bước sóng 334 nm 365 nm 6.5 Máy đo quang phổ, (bước sóng thay đổi) để đo 340 nm (thay cho 6.4) 6.6 Máy li tâm, tạo gia tốc li tâm 3000g ống li tâm (6.8) CHÚ THÍCH: Tần số quay cần thiết để tạo gia tốc li tâm xác tính từ cơng thức sau: a = 11,18 x r x (n/1 0002) (4) đó: a gia tốc li tâm; r bán kính máy li tâm, tính centimet (cm), đo từ trung điểm (trên trục li tâm) đến đáy ống li tâm quay; n số vòng quay phút 6.7 Thiết bị lọc màng, với màng lọc có cỡ lỗ 0,45 µm 6.8 Ống li tâm Cách tiến hành 7.1 Chuẩn bị mẫu thử Pha loãng nước cho hàm lượng axit axetic cuvet có khoảng từ µg đến 30 µg Hàm lượng tương đương với 10 mg đến 300 mg axit axetic lít mẫu thử (dạng dung dịch) Nếu nồng độ axit axetic mẫu thử (dạng dung dịch) nhỏ 10 mg/l, thể tích mẫu cho vào cuvet tăng đến 1,5 ml Trong trường hợp này, thể tích nước thêm vào phải giảm cho thể tích cuối cuvet khơng đổi Sử dụng mẫu (đã pha loãng), kể mẫu có màu nhạt Việc phân tích theo phương pháp phải thực dựa vào đơn vị thể tích, kết biểu thị theo lít mẫu thử Việc phân tích mẫu đặc thực dựa theo thể tích sau pha lỗng đến tỉ trọng tương đối biết Trong trường hợp này, phải đưa tỉ trọng tương đối Dựa lượng mẫu cân đưa hệ số pha lỗng phân tích vào phép tính, kết biểu thị theo kilogam sản phẩm Đối với sản phẩm có độ nhớt cao và/hoặc có hàm lượng tế bào cao (ví dụ thịt quả), việc xác định dựa lượng mẫu thử cân theo quy trình thơng thường Đối với mẫu đục trộn kĩ trước pha loãng Làm mẫu dạng đục có nồng độ axit axetic thấp cách lọc qua màng lọc 0,45 µm (6.7) li tâm 7.2 Tiến hành thử 7.2.1 Yêu cầu chung Phép xác định phải thực điều kiện nhiệt độ không đổi, khoảng từ 20 oC đến 25 o C Có thể sử dụng nhiệt độ không đổi khoảng từ 25 oC đến 37 oC, với điều kiện thu kết tương đương NADH có độ hấp thụ cực đại bước sóng 340 nm Khi sử dụng máy đo phổ thay đổi bước sóng (6.5), đo bước sóng hấp thụ cực đại Khi sử dụng máy đo quang phổ đơn dùng đèn hóa thủy ngân, đo bước sóng 334 nm 365 nm Không sử dụng pipet vạch để hút dung dịch Các dung dịch enzym, coenzym đệm lấy pipet tự động thích hợp Chỉ sử dụng pipet dùng để thử nghiệm enzym (6.1) dụng cụ tương đương (6.2) để lấy dung dịch mẫu thử Sử dụng dung dịch chuẩn axit axetic dãy phân tích 7.2.2 Dung dịch mẫu trắng Xem thêm quy trình lấy dung dịch mẫu thử pipet 7.2.3 Dùng pipet lấy 1,00 ml dung dịch đệm (5.15), 0,10 ml dung dịch NAD/CoA (5.16), 0,10 ml dung dịch ATP (5.17) 2,00 ml nước cho vào cuvet Trộn đọc độ hấp thụ A0 sau Thêm 0,02 ml dung dịch MDH/CS (5.18), trộn đọc độ hấp thụ A1 sau Thêm 0,01 ml huyền phù ACS (5.19), trộn đọc độ hấp thụ A2 sau 10 đến 15 7.2.3 Dung dịch thử axit axetic Dùng pipet lấy 1,00 ml dung dịch đệm (5.15), 0,10 ml dung dịch NAD/CoA (5.16), 0,10 ml dung dịch ATP (5.17), 0,10 ml dung dịch mẫu thử (7.1) 1,90 ml nước cho vào cuvet Trộn đọc độ hấp thụ A0 sau Thêm 0,02 ml dung dịch MDH/CS (5.18), trộn đọc độ hấp thụ A1 sau Thêm 0,01 ml huyền phù ACS (5.19), trộn đọc độ hấp thụ A2 sau phản ứng kết thúc (khoảng 10 đến 15 min) Kiểm tra phản ứng kết thúc hay chưa cách sau khoảng thời gian 10 min, đọc độ hấp thụ cuối Nếu cần, điều chỉnh phản ứng "phụ" (giá trị tăng lên không đổi) cách ngoại suy độ hấp thụ thời điểm thêm MDH/CS (xem Phụ lục B) Bảng Dùng pipet cho vào cuvet Mẫu trắng, Mẫu thử, ml ml Dung dịch đệm (5.15) 1,00 1,00 Dung dịch NAD/CoA (5.16) 0,10 0,10 Dung dịch ATP (5.17) 0,10 0,10 – 0,10 2,00 1,90 Dung dịch mẫu thử (7.1) Nước Trộn đọc độ hấp thụ A0 dung dịch sau khoảng min, sau thêm: Dung dịch MDH/CS (5.18) 0,02 0,02 Trộn đọc độ hấp thụ A1 dung dịch sau khoảng Bắt đầu phản ứng cách thêm: Huyền phù ACS (5.19) 0,01 0,01 Trộn sau phản ứng kết thúc (khoảng 15 min), đọc độ hấp thụ A2 mẫu trắng mẫu thử Nếu phản ứng chưa kết thúc sau 15 min, sau tiếp tục đọc độ hấp thụ, độ hấp thụ tăng 10 Chỉnh phản ứng "phụ" xảy cách ngoại suy độ hấp thụ thời điểm thêm ACS (xem Phụ lục B) Xác định chênh lệch độ hấp thụ mẫu trắng mẫu thử (A1 – A0) (A2 – A0) Với phản ứng thị trước, khơng có mối quan hệ tuyến tính chênh lệch độ hấp thụ đo nồng độ axit axetic Cơng thức sau dùng để tính ΔAaxit axetic: Tính kết Hàm lượng axit axetic, ρ, biểu thị miligam lít (mg/l) tính theo công thức sau: V1 M F x V2 A (6) Trong đó: V1 thể tích cuối cùng, tính mililit (ml); M khối lượng phân tử axit axetic (60,05 g/mol); F hệ số pha loãng dung dịch mẫu thử; V2 thể tích dung dịch mẫu thử, tính mililit (ml); chiều dài đường quang cuvet, tính centimet (cm); ε hệ số hấp thụ NADH bước sóng 340 nm, ε = 6,3 [l × mmol– × cm– 1]; bước sóng 365 nm, ε = 3,4 [l × mmol– × cm– 1]; bước sóng 334 nm, ε = 6,18 [l × mmol– × cm– 1] Nếu khơng thay đổi thể tích 7.2.2 7.2.3, tính hàm lượng axit axetic miligam lít (mg/l) mẫu theo cơng thức sau: 3,23 60,05 0,1 A 1940 A (7) Khi sử dụng kit thử phức hợp có bán sẵn thị trường, hệ số 940 cơng thức (7) nêu thay đổi Trong phần tính kết quả, cần tính đến hệ số pha lỗng mối tương quan giá trị với thể tích khối lượng Nếu sản phẩm đặc pha lỗng đến nồng độ đơn ghi lại tỉ trọng tương đối mẫu nồng độ đơn Tính hàm lượng axit axetic theo miligam lít đến số nguyên theo miligam kilogam, phụ thuộc vào việc chuẩn bị mẫu (7.1) Độ chụm Chi tiết phép thử liên phòng thử nghiệm độ chụm phương pháp đưa Phụ lục A Các giá trị thu từ phép thử liên phòng khơng áp dụng cho dải nồng độ chất khác với dải nồng độ chất nêu Phụ lục A 9.1 Độ lặp lại Chênh lệch tuyệt đối hai kết thử riêng rẽ thu sử dụng phương pháp, tiến hành vật liệu thử giống hệt nhau, người thực hiện, sử dụng thiết bị, khoảng thời gian ngắn, không % trường hợp vượt giá trị độ lặp lại r Giá trị độ lặp lại: r = 19 mg/l 9.2 Độ tái lập Chênh lệch tuyệt đối hai kết thử riêng rẽ thu sử dụng phương pháp, tiến hành thử vật liệu giống thử hệt nhau, phòng thử nghiệm khác nhau, người khác thực hiện, sử dụng thiết bị khác nhau, không % trường hợp vượt giá trị độ tái lập R Giá trị độ tái lập: R = 49 mg/l 10 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ: – thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu thử (loại mẫu, nguồn gốc mẫu, tên gọi); – viện dẫn tiêu chuẩn này; – ngày phương pháp lấy mẫu, biết; – ngày nhận mẫu; – ngày thử nghiệm; – kết thử đơn vị biểu thị kết quả; – độ lặp lại, kiểm tra; – điểm ngoại lệ quan sát thực phép thử; – thao tác không quy định phương pháp tùy chọn mà ảnh hưởng đến kết PHỤ LỤC A (Tham khảo) Kết thống kê phép thử liên phòng thử nghiệm Theo ISO 5725:1986*, thơng số sau xác định phép thử liên phòng thử nghiệm (Thư mục tài liệu tham khảo) Phép thử tiến hành Intermational Federal of Fruit Juice Producers (IFU), Paris, Pháp Năm tiến hành thử nghiệm: 1991/1 1991/2 Số lượng phòng thử nghiệm tham gia: 22 21 Số lượng mẫu thử: 2 Bảng A.1 Mẫu A B C D Số lượng phòng thử nghiệm lại sau trừ ngoại lệ 19 16 21 20 Số lượng ngoại lệ (phòng thử nghiệm) Số lượng kết chấp nhận – 77 65 83 80 Giá trị trung bình ( x ) (mg/l) 252 325 249 215 Độ lệch chuẩn lặp lại (sr) (mg/l) 7,65 8,28 5,30 5,11 Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại (RSDr) (%) 3,0 2,6 2,1 2,4 Giới hạn lặp lại (r) (mg/l) 22 23 15 14 18,69 23,62 11,69 15,55 Độ lệch chuẩn tương đối tái lập (RSDR) (%) 7,4 7,3 4,7 7,2 Giới hạn tái lập (R) (mg/l) 53 66 33 44 Độ lệch chuẩn tái lập (sR) (mg/l) Tên mẫu: A – nước cà chua, B – nectar anh đào, C – nước táo, D – nước cam PHỤ LỤC B (Tham khảo) Thông tin cách xử lí phản ứng "phụ" * ISO 5725:1986 hủy, thay ISO 5725 (gồm có phần) biên soạn thành TCVN 6910 (gồm có phần) Các phản ứng "phụ" nói chung tác dụng phụ enzym, có mặt enzym khác chất mẫu thử, tương tác thành phần chất với thuốc thử phản ứng enzym Trong phản ứng thông thường, độ hấp thụ thu giá trị không đổi sau khoảng thời gian xác định, thông thường từ 10 đến 20 min, phụ thuộc vào tốc độ phản ứng enzym cụ thể Tuy nhiên, phản ứng xảy ra, mà độ hấp thụ không đạt giá trị không đổi mà tăng theo thời gian dạng phản ứng gọi chung phản ứng "phụ" Nếu có phản ứng "phụ" xuất hiện, độ hấp thụ dung dịch phải đo khoảng thời gian cách (2 đến min) sau thời gian cần thiết để dung dịch đạt độ hấp thụ cuối Khi độ hấp thụ tăng theo tỉ lệ không đổi (dA/dt = số), đọc từ lần đến lần sau ngoại suy, dùng biểu đồ dùng phép tính, để thu độ hấp thụ dung dịch thời điểm cuối enzym thêm vào (To) Chênh lệch độ hấp thụ ngoại suy thời điểm (Af – Ai) sử dụng để tính nồng độ chất Hình B.1 – Phản ứng phụ THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] ISO 5725:1986 Precision of test methods – Determination of repeatability and reproducibility for a standard test method by inter-laboratory tests (Độ chụm phương pháp thử – Xác định độ lặp lại độ tái lập phương pháp thử thử nghiệm liên phòng) [2] Determination of acetic acid: Enzymatic method, No 66,1996, Analyses [Collection] International Federation of Fruit Juice Producers Loose-leaf edition, as of 1996 Zug: Swiss Fruit Union [3] Determination of acetic acid: Enzymatic method, Methods of biochemical analysis and food analysis using single reagents Boehringer Mannheim ... 1) có mặt enzym axetylcoenzym A-synthetaza (ACS) với adenosin-5'-tri-phosphat (ATP) coenzym A (CoA): Axetat + ATP + CoA ACS axetyl-CoA + AMP + pyrophosphat (1) Axetyl-CoA phản ứng với oxaloaxetat... mol/l 5.6 Nicotinamit-adenin dinucleotit (khoảng 98 %) 5.7 Coenzym A 5.8 Muối dinatri adenosin-5'-triphosphat, ATP-Na2H2 5.9 Natri hydrocacbonat, NaHCO3 5.10 Malat dehydrogenaza, huyền phù amoni... Malat-dehydrogenaza; IU đơn vị quốc tế (IU) hoạt độ enzym xúc tác chuyển đổi µmol chất phút 25 oC điều kiện chuẩn Nguyên tắc Axit axetic (axetat) chuyển hóa thành axetyl-CoA (phản ứng 1) có mặt enzym