Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 8904:2011 quy định phương pháp enzym để xác định hàm lượng tổng số của axit D- và L-lactic cùng các muối lactat trong nước rau quả và các sản phẩm có liên quan. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.
TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8904:2011 EN 12631:1999 NƯỚC RAU QUẢ – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AXIT D- VÀ L-LACTIC (LACTAT) BẰNG ENZYM – PHƯƠNG PHÁP ĐO PHỔ NAD Fruit and vegetable juices – Enzymatic determination of D- and L-lactic acid (lactate) content – NAD spectrometric method Lời nói đầu TCVN 8904:2011 hoàn toàn tương đương với EN 12631:1999; TCVN 8904:2011 Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F10 Rau sản phẩm rau biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Công nghệ công bố NƯỚC RAU QUẢ – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AXIT D- VÀ L-LACTIC (LACTAT) BẰNG ENZYM – PHƯƠNG PHÁP ĐO PHỔ NAD Fruit and vegetable juices – Enzymatic determination of D- and L-lactic acid (lactate) content – NAD spectrometric method Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy định phương pháp enzym để xác định hàm lượng tổng số axit D- Llactic muối lactat nước rau sản phẩm có liên quan Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm cơng bố áp dụng phiên nêu Đối với tài liệu viện dẫn khơng ghi năm cơng bố áp dụng phiên nhất, bao gồm sửa đổi, bổ sung (nếu có) TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987), Nước dùng để phân tích phòng thí nghiệm – u cầu kĩ thuật phương pháp thử Kí hiệu chữ viết tắt 3.1 Kí hiệu Trong tiêu chuẩn sử dụng kí hiệu sau: c nồng độ chất; ρ nồng độ khối lượng; φ phần thể tích; g gia tốc trọng trường bề mặt trái đất (9,81 m/s2) 3.2 Chữ viết tắt Trong tiêu chuẩn sử dụng chữ viết tắt sau: GPT Glutamat-pyruvat-transaminaza; L-LDH L-lactat dehydrogenaza; D-LDH D-lactat dehydrogenaza; NAD β-Nicotinamit-adenin-dinucleotit; NADH β-Nicotinamit-adenin-dinucleotit, dạng khử; IU đơn vị quốc tế (IU) hoạt độ enzym xúc tác chuyển đổi µmol chất phút 25 oC điều kiện chuẩn Nguyên tắc Axit L-lactic (lactat) bị oxy hóa nicotinamit-adenin-dinucleotit (NAD) có mặt Llactat dehydrogenaza (L-LDH), tạo thành pyruvat Axit D-lactic (lactat) bị oxy hóa theo cách tương tự có mặt D-lactat dehydrogenaza (D-LDH) L-lactat + NAD+ L - LDH D-lactat + NAD+ D - LDH pyruvat + NADH + H+ (1) pyruvat + NADH + H+ (2) Điểm cân phản ứng (1) (2) nằm gần hồn tồn phía lactat Tuy nhiên, cách cho pyruvat tham gia phản ứng với enzym glutamat-pyruvat-transaminaza (GPT) làm xúc tác có mặt L-glutamat (phản ứng 3), điểm cân thay đổi theo chiều tạo pyruvat NADH: Pyruvat + L-glutamat GPT L-alanin + α-xetoglutarat (3) Lượng NADH tạo thành (đo độ tăng độ hấp thụ bước sóng 334 nm, 340 nm 365 nm) tương đương với lượng axit D- L-lactic có mẫu thử Thuốc thử 5.1 Yêu cầu chung Chỉ sử dụng thuốc thử tinh khiết phân tích nước loại nêu TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987) CHÚ THÍCH: Việc xác định thực cách sử dụng kit thử phức hợp có bán sẵn thị trường 5.2 Glyxylglyxin 5.3 Axit L-glutamic 5.4 Dung dịch natri hydroxit 5.4.1 Dung dịch natri hydroxit, c(NaOH) = 10 mol/l 5.4.2 Dung dịch natri hydroxit, c(NaOH) = 10 mmol/l 5.5 Nicotinamit-adenin dinucleotit 5.6 Glutamat-pyruvat transaminaza, dạng huyền phù, ρ(GPT) = 10 mg/l, hoạt độ riêng khoảng 80 IU/mg 5.7 L-lactat dehydrogenaza, dung dịch glyxerol, φ(L-LDH) = 50 %, hoạt độ riêng khoảng 550 IU/mg 5.8 D-lactat dehydrogenaza, dạng huyền phù, c(D-LDH) = 3,2 mol/l, hoạt độ riêng khoảng 300 IU/mg 5.9 Dung dịch chuẩn axit L-lactic, c(axit L-lactic) = 1,0 mol/l 5.10 Muối liti D-lactat 5.11 Dung dịch đệm, pH = 10,0 Hòa tan 4,75 g glyxylglyxin (5.2) 0,88 g axit L-glutamic (5.3) khoảng 50 ml nước Chỉnh đến pH 10,0 khoảng 4,6 ml natri hydroxit (5.4.1) thêm nước đến 60 ml Dung dịch đệm bền tháng + oC 5.12 Dung dịch nicotinamit-adenin dinucleotit Hòa tan 420 mg NAD (5.5) 12 ml nước Dung dịch pha bền tuần + oC 5.13 Huyền phù glutamat-pyruvat transaminaza Li tâm ml huyền phù GPT (5.6) 10 với tốc độ khoảng 000 r/min Hút bỏ 1,0 ml dịch trong, lắc kĩ huyền phù trước sử dụng Huyền phù pha bền năm + o C 5.14 Dung dịch L-lactat dehydrogenaza Sử dụng dung dịch L-LDH (5.7) khơng pha lỗng Dung dịch bền năm + oC 5.15 Huyền phù D-lactat dehydrogenaza Sử dụng huyền phù D-LDH (5.8) khơng pha lỗng Huyền phù bền năm + oC 5.16 Dung dịch chuẩn axit L-lactic, c(CH3CHOHCOOH) = 0,5 mmol/l Pha loãng 000 lần dung dịch chuẩn axit L-lactic (5.9) natri hydroxit (5.4.2) Chuẩn bị dung dịch trước sử dụng 5.17 Dung dịch chuẩn axit D-lactic, c(CH3CHOHCOOLi) = 0,5 mmol/l Hòa tan 48 mg muối liti D-lactat (5.10) 100 ml nước Pha loãng dung dịch nước với tỉ lệ 1:9 (thể tích) Chuẩn bị dung dịch trước sử dụng Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thơng thường cụ thể sau: 6.1 Pipet dùng để thử nghiệm enzym, có chia vạch dọc thân pipet đầu tip phân phối dài, khơng chia vạch 6.2 Pipet, có độ xác tương đương 6.1 (thay cho 6.1), ví dụ thay đổi thể tích pipet 6.3 Cuvet, làm thủy tinh nhựa, có chiều dài đường quang cm có độ hấp thụ khơng đáng kể bước sóng 334 nm, 340 nm 365 nm 6.4 Máy đo quang đơn phổ, có đèn thủy ngân màng lọc đo bước sóng 334 nm 365 nm 6.5 Máy đo quang phổ, (bước sóng thay đổi) để đo 340 nm (thay cho 6.4) 6.6 Máy li tâm, tạo gia tốc li tâm 3000g ống li tâm (6.8) CHÚ THÍCH: Tần số quay cần thiết để tạo gia tốc li tâm xác tính từ cơng thức sau: a = 11,18 x r x (n/1 000)2 (4) Trong đó: a gia tốc li tâm; r bán kính máy li tâm, tính centimet (cm), đo từ trung điểm (trên trục li tâm) đến đáy ống li tâm quay; n số vòng quay phút 6.7 Thiết bị lọc màng, với màng lọc có cỡ lỗ 0,45 µm 6.8 Ống li tâm Cách tiến hành 7.1 Chuẩn bị mẫu thử Pha loãng nước cho hàm lượng axit D- L-lactic cuvet có khoảng từ µg đến 35 µg Hàm lượng tương đương với 20 mg đến 350 mg axit lactic lít mẫu thử (dạng dung dịch) Nếu nồng độ axit lactic mẫu thử (dạng dung dịch) nhỏ 20 mg/l, thể tích mẫu cho vào cuvet tăng đến 1,5 ml Trong trường hợp này, thể tích nước thêm vào phải giảm cho thể tích cuối cuvet khơng đổi Sử dụng mẫu (đã pha lỗng), kể mẫu có màu nhạt Việc phân tích theo phương pháp phải thực dựa vào đơn vị thể tích, kết biểu thị theo lít mẫu thử Việc phân tích mẫu đặc thực theo thể tích sau pha loãng đến tỉ trọng tương đối biết Trong trường hợp này, phải đưa tỉ trọng tương đối Dựa lượng mẫu cân đưa hệ số pha lỗng phân tích vào phép tính, kết biểu thị theo kilogam sản phẩm Đối với sản phẩm có độ nhớt cao và/hoặc có hàm lượng tế bào cao (ví dụ thịt quả), việc xác định dựa lượng mẫu thử cân theo quy trình thơng thường Đối với mẫu đục trộn kĩ trước pha lỗng Làm mẫu đục có hàm lượng axit D- L-lactic thấp cách lọc qua màng lọc 0,45 µm trước li tâm 7.2 Tiến hành thử 7.2.1 Yêu cầu chung Phép xác định phải thực điều kiện nhiệt độ không đổi, khoảng từ 20 oC đến 25 o C Có thể sử dụng nhiệt độ khơng đổi khoảng từ 25 oC đến 37 oC, với điều kiện thu kết tương đương NADH có độ hấp thụ cực đại bước sóng 340 nm Khi sử dụng máy đo phổ thay đổi bước sóng (6.5), đo bước sóng hấp thụ cực đại Khi sử dụng máy đo quang vạch đơn dùng đèn hóa thủy ngân, đo bước sóng 334 nm 365 nm Khơng sử dụng pipet vạch để hút dung dịch Các dung dịch enzym, coenzym đệm lấy pipet tự động thích hợp Chỉ sử dụng pipet dùng để thử nghiệm enzym (6.1) dụng cụ tương đương (6.2) để lấy dung dịch mẫu thử Sử dụng dung dịch chuẩn axit D- L-lactic dãy phân tích 7.2.2 Dung dịch mẫu trắng Xem thêm tiến trình lấy dung dịch mẫu thử pipet 7.2.3 7.2.4 Dùng pipet lấy 1,00 ml dung dịch đệm (5.11), 0,20 ml dung dịch NAD (5.12), 1,50 ml nước 0,02 ml huyền phù GPT (5.13) cho vào cuvet Trộn đọc độ hấp thụ A1 sau Thêm 0,02 ml dung dịch L-LDH (5.14) 0,05 ml dung dịch D-LDH (5.15) (tương ứng với việc xác định axit L-lactic hay axit D-lactic) Trộn đọc độ hấp thụ A2 sau 20 7.2.3 Dung dịch thử axit L-lactic Dùng pipet lấy 1,00 ml dung dịch đệm (5.11), 0,20 ml dung dịch NAD (5.12), 1,40 ml nước, 0,02 ml huyền phù GPT (5.13) 0,10 ml dung dịch mẫu thử (7.1) cho vào cuvet Trộn đọc độ hấp thụ A1 sau Thêm 0,02 ml dung dịch L-LDH (5.14) Trộn đọc độ hấp thụ A2 sau 20 Kiểm tra phản ứng kết thúc hay chưa cách sau khoảng thời gian 10 min, đọc độ hấp thụ cuối Nếu cần, điều chỉnh phản ứng "phụ" (giá trị tăng lên không đổi) cách ngoại suy độ hấp thụ thời điểm thêm L-LDH (xem Phụ lục B) Bảng Dùng pipet cho vào cuvet Mẫu trắng Mẫu thử Dung dịch đệm (5.11) 1,00 ml 1,00 ml Dung dịch NAD (5.12) 0,20 ml 0,20 ml Huyền phù GPT (5.13) Dung dịch mẫu thử (7.1) Nước 0,02 ml 0,02 ml – 0,10 ml 1,50 ml 1,40 ml Trộn đọc độ hấp thụ A1 dung dịch sau khoảng Thực phản ứng cách thêm: Dung dịch L-LDH (5.14) 0,02 ml 0,02 ml Trộn sau phản ứng kết thúc (khoảng 20 min), đọc độ hấp thụ A2 mẫu trắng mẫu thử Kiểm tra xem phản ứng kết thúc chưa cách sau khoảng 10 min, đọc độ hấp thụ thu Tính chênh lệch độ hấp thụ trước sau phản ứng (A2 – A1) dung dịch thử trắng dung dịch mẫu thử Lấy chênh lệch độ hấp thụ mẫu thử trừ chênh lệch độ hấp thụ mẫu trắng: ΔA = ΔAMẫu – ΔAMẫu trắng (5) 7.2.4 Dung dịch thử axit D-lactic Dùng pipet lấy 1,00 ml dung dịch đệm (5.11), 0,20 ml dung dịch NAD (5.12), 1,40 ml nước, 0,02 ml huyền phù GPT (5.13) 0,10 ml dung dịch mẫu thử (7.1) cho vào cuvet Trộn đọc độ hấp thụ A1 sau Thêm 0,05 ml dung dịch D-LDH (5.15) Trộn đọc độ hấp thụ A2 sau 30 Nếu dung dịch ủ 37 oC, độ hấp thụ đọc sau 20 Kiểm tra xem phản ứng kết thúc chưa cách sau khoảng 10 min, đọc độ hấp thụ thu Nếu cần, điều chỉnh phản ứng "phụ" (giá trị tăng lên không đổi) cách ngoại suy độ hấp thụ thời điểm thêm D-LDH (xem Phụ lục B) Bảng Dùng pipet cho vào cuvet Mẫu trắng Mẫu thử Dung dịch đệm (5.11) 1,00 ml 1,00 ml Dung dịch NAD (5.12) 0,20 ml 0,20 ml Huyền phù GPT (5.13) 0,02 ml 0,02 ml – 0,10 ml 1,50 ml 1,40 ml Dung dịch mẫu thử (7.1) Nước Trộn đọc độ hấp thụ A1 dung dịch sau khoảng Thực phản ứng cách thêm: Huyền phù D-LDH (5.15) 0,05 ml 0,05 ml Trộn sau phản ứng kết thúc (khoảng 30 min), đọc độ hấp thụ A2 mẫu trắng mẫu thử Để thúc đẩy phản ứng, dung dịch ủ 37 oC Trong trường hợp này, phản ứng kết thúc sau 20 Kiểm tra xem phản ứng kết thúc chưa cách sau khoảng 10 min, đọc độ hấp thụ thu Tính chênh lệch độ hấp thụ trước sau phản ứng (A2 – A1) dung dịch thử trắng dung dịch mẫu thử Lấy chênh lệch độ hấp thụ mẫu thử trừ chênh lệch độ hấp thụ mẫu trắng: ΔA = ΔMẫu – ΔAMẫu trắng (6) Tính kết Hàm lượng axit lactic, ρ, biểu thị miligam lít (mg/l) tính theo cơng thức sau: V1 M F x V2 A (7) đó: V1 thể tích cuối cùng, tính mililit (ml); M khối lượng phân tử axit lactic (90,1 g/mol); F hệ số pha loãng dung dịch mẫu thử; V2 thể tích dung dịch mẫu thử, tính mililit (ml); chiều dài đường quang cuvet, tính centimet (cm); ε hệ số hấp thụ NADH bước sóng 340 nm, ε = 6,3 [l × mmol– × cm– 1]; bước sóng 365 nm, ε = 3,4 [l × mmol– × cm– 1]; bước sóng 334 nm, ε = 6,18 [l × mmol– × cm– 1] Nếu khơng thay đổi thể tích 7.2.3 7.2.4 tính hàm lượng axit L-lactic axit Dlactic miligam lít (mg/l) theo cơng thức sau: – Đối với hàm lượng axit L-lactic: axitL lactic 2,74 90,1 0,1 A 2469 A 2469 A (8) – Đối với hàm lượng axit D-lactic: axitD lactic 2,77 90,1 0,1 A (9) Khi sử dụng kit thử phức hợp có bán sẵn thị trường, hệ số 469 496 công thức (8) (9) nêu thay đổi Trong phần tính kết quả, cần tính đến hệ số pha lỗng mối tương quan giá trị với thể tích khối lượng Nếu sản phẩm cô đặc pha lỗng đến nồng độ đơn ghi lại tỉ trọng tương đối mẫu nồng độ đơn Tính hàm lượng axit lactic theo miligam lít đến số nguyên theo miligam kilogam, phụ thuộc vào việc chuẩn bị mẫu (7.1) Độ chụm Chi tiết phép thử liên phòng thử nghiệm độ chụm phương pháp đưa Phụ lục A Các giá trị thu từ phép thử liên phòng không áp dụng cho dải nồng độ chất khác với dải nồng độ chất nêu Phụ lục A 9.1 Độ lặp lại Chênh lệch tuyệt đối hai kết thử riêng rẽ thu sử dụng phương pháp, tiến hành vật liệu thử giống hệt nhau, người thực hiện, sử dụng thiết bị, khoảng thời gian ngắn, không % trường hợp vượt giá trị độ lặp lại r Giá trị độ lặp lại: r = 11 % axit D-lactic axit L-lactic 9.2 Độ tái lập Chênh lệch tuyệt đối hai kết thử riêng rẽ thu sử dụng phương pháp, tiến hành thử vật liệu giống thử hệt nhau, phòng thử nghiệm khác nhau, người khác thực hiện, sử dụng thiết bị khác nhau, không % trường hợp vượt giá trị độ tái lập R Giá trị độ tái lập: R = 32 % axit D-lactic axit L-lactic 10 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ: – thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu thử (loại mẫu, nguồn gốc mẫu, tên gọi); – viện dẫn tiêu chuẩn này; – ngày phương pháp lấy mẫu, biết; – ngày nhận mẫu; – ngày thử nghiệm; – kết thử đơn vị biểu thị kết quả; – độ lặp lại, kiểm tra; - điểm ngoại lệ quan sát thực phép thử; - thao tác không quy định phương pháp tùy chọn mà ảnh hưởng đến kết PHỤ LỤC A (Tham khảo) Kết thống kê phép thử liên phòng thử nghiệm * Theo ISO 5725:1986 , thông số sau xác định phép thử liên phòng thử nghiệm (xem Thư mục tài liệu tham khảo) Phép thử tiến hành Intermational Federal of Fruit Juice Producers (IFU), Paris, Pháp Năm tiến hành thử nghiệm: 1991 1990 (nước cà chua) Số lượng phòng thử nghiệm tham gia: 19 21 Số lượng mẫu thử: Tên mẫu: A – nước cam, B – nước táo, C – nectar anh đào, D – nước cà chua Bảng A.1 – Axit L-lactic Mẫu A B C D Số lượng phòng thử nghiệm lại sau trừ ngoại lệ 17 17 18 19 Số lượng ngoại lệ (phòng thử nghiệm) 2 * ISO 5725:1986 hủy, thay ISO 5725 (gồm có phần) biên soạn thành TCVN 6910 (gồm có phần) Số lượng kết chấp nhận 69 68 71 92 Giá trị trung bình ( x ) (mg/l) 182 141 268 149 Độ lệch chuẩn lặp lại (sr) (mg/l) 9,24 5,10 12,80 4,52 Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại (RSDr) (%) 5,1 3,6 4,8 3,0 Giới hạn lặp lại (r) (mg/l) 26 14 36 13 Độ lệch chuẩn tái lập (sR) (mg/l) 18,91 18,20 36,07 12,63 Độ lệch chuẩn tương đối tái lập (RSDR) (%) 10,4 12,9 13,5 8,5 59 51 101 35 A B C D Số lượng phòng thử nghiệm lại sau trừ ngoại lệ 19 19 19 21 Số lượng ngoại lệ (phòng thử nghiệm) – – – – Số lượng kết chấp nhận 77 75 76 108 Giá trị trung bình ( x ) (mg/l) 179 136 233 91 Độ lệch chuẩn lặp lại (sr) (mg/l) 6,97 4,91 7,80 4,18 Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại (RSDr) (%) 3,9 3,6 3,3 4,6 Giới hạn lặp lại (r) (mg/l) 20 14 22 12 Độ lệch chuẩn tái lập (sR) (mg/l) 20,02 16,58 30,50 9,50 Độ lệch chuẩn tương đối tái lập (RSDR) (%) 11,2 12,2 13,1 10,4 56 46 85 27 Giới hạn tái lập (R) (mg/l) Bảng A.2 – Axit D-lactic Mẫu Giới hạn tái lập (R) (mg/l) PHỤ LỤC B (Tham khảo) Thơng tin cách xử lí phản ứng "phụ" Các phản ứng "phụ" nói chung tác dụng phụ enzym, có mặt enzym khác chất mẫu thử, tương tác thành phần chất với thuốc thử phản ứng enzym Trong phản ứng thông thường, độ hấp thụ thu giá trị không đổi sau khoảng thời gian xác định, thông thường từ 10 đến 20 min, phụ thuộc vào tốc độ phản ứng enzym cụ thể Tuy nhiên, phản ứng phụ xảy ra, độ hấp thụ không đạt giá trị không đổi mà tăng theo thời gian dạng phản ứng gọi chung phản ứng "phụ" Nếu phản ứng "phụ" xuất hiện, độ hấp thụ dung dịch phải đo khoảng thời gian cách (2 đến min) sau thời gian cần thiết để dung dịch đạt độ hấp thụ cuối Khi độ hấp thụ tăng theo tỉ lệ không đổi (dA/dt = số), đọc từ lần đến lần sau ngoại suy, dùng biểu đồ dùng phép tính, để thu độ hấp thụ dung dịch thời điểm cuối mà enzym thêm vào (To) Chênh lệch độ hấp thụ ngoại suy thời điểm (Af – Ai) sử dụng để tính nồng độ chất Hình B.1 – Phản ứng phụ THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] ISO 5725:1986 Precision of test methods – Determination of repeatability and reproducibility for a standard test method by inter-laboratory tests (Độ chụm phương pháp thử – Xác định độ lặp lại độ tái lập phương pháp thử thử nghiệm liên phòng) [2] Determination of lactic acid: Enzymatic method: No 53,1983 In: Analyses [Collection]/International Federation of Fruit Juice Producers Loose-leaf edition, as of 1995 Zug: Swiss Fruit Union [3] Determination of L-lactic acid/D-lactic acid: Enzymatic method In: Methods of biochemical analysis and food analysis, using single reagents Boehringer Mannheim ... dehydrogenaza (L-LDH), tạo thành pyruvat Axit D-lactic (lactat) bị oxy hóa theo cách tương tự có mặt D-lactat dehydrogenaza (D-LDH) L-lactat + NAD+ L - LDH D-lactat + NAD+ D - LDH pyruvat + NADH... vị quốc tế (IU) hoạt độ enzym xúc tác chuyển đổi µmol chất phút 25 oC điều kiện chuẩn Nguyên tắc Axit L-lactic (lactat) bị oxy hóa nicotinamit-adenin-dinucleotit (NAD) có mặt Llactat dehydrogenaza... tham gia phản ứng với enzym glutamat-pyruvat-transaminaza (GPT) làm xúc tác có mặt L-glutamat (phản ứng 3), điểm cân thay đổi theo chiều tạo pyruvat NADH: Pyruvat + L-glutamat GPT L-alanin + α-xetoglutarat