Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 7901:2008 - ISO 8553:2004

Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 7901:2008 về Sữa - Định lượng vi sinh vật - Kỹ thuật sử dụng que cấy vòng định lượng ở 300C quy định phương pháp định lượng vi sinh vật trong sữa nguyên liệu bằng kỹ thuật sử dụng que cấy vòng định lượng ở 300C. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 7901:2008 ISO 8553:2004 SỮA - ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT - KỸ THUẬT SỬ DỤNG QUE CẤY VÒNG ĐỊNH LƯỢNG Ở 300C Milk - Enumeration of microorganisms - Plate-loop technique at 30 0C Lời nói đầu TCVN 7901:2008 hoàn toàn tương đương với ISO 8553:2004; TCVN 7901:2008 Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học Công nghệ công bố SỮA - ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT - KỸ THUẬT SỬ DỤNG QUE CẤY VÒNG ĐỊNH LƯỢNG Ở 300C Milk - Enumeration of microorganisms - Plate-loop technique at 30 0C Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy định phương pháp định lượng vi sinh vật sữa nguyên liệu kỹ thuật sử dụng que cấy vòng định lượng 30 0C Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm cơng bố áp dụng phiên nêu Đối với tài liệu viện dẫn không ghi năm cơng bố áp dụng phiên nhất, bao gồm sửa đổi TCVN 4884 (ISO 4833), Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi - Phương pháp định lượng vi sinh vật đĩa thạch - Kỹ thuật đếm khuẩn lạc 30 0C TCVN 6263 (ISO 8261), Sữa sản phẩm sữa Hướng dẫn chung chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh TCVN 6404 (ISO 7218), Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi - Yêu cầu chung hướng dẫn kiểm tra vi sinh vật ISO/TS 11133-1, Microbiology of food and animal feeding stuffs - Guidelines on preparation and production of culture media - Part 1: General guidelines on quality assurance for the preparation of culture media in the laboratory (Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi - Hướng dẫn chuẩn bị tạo môi trường cấy - Phần 1: Các hướng dẫn chung đảm bảo chất lượng cho việc chuẩn bị mơi trường cấy phòng thử nghiệm) ISO/TS 11133-2, Microbiology of food and animal feeding stuffs - Guidelines on preparation and production of culture media - Part 2: Practical guidelines on performance testing of culture media (Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi - Hướng dẫn chuẩn bị tạo môi trường cấy Phần 2: Các hướng dẫn thực hành thử tính môi trường cấy) Thuật ngữ định nghĩa Trong tiêu chuẩn áp dụng thuật ngữ định nghĩa sau đây: 3.1 Vi sinh vật (microorganisms) Các vi khuẩn, nấm men, nấm mốc hình thành khuẩn lạc đếm điều kiện quy định tiêu chuẩn Nguyên tắc 4.1 Chuẩn bị đĩa thạch, sử dụng môi trường cấy quy định lượng xác định mẫu thử lấy que cấy vòng hiệu chuẩn 4.2 Ủ ẩm đĩa điều kiện hiếu khí 300C 72h 4.3 Tính số lượng vi sinh vật mililit mẫu thử từ số lượng khuẩn lạc thu đĩa (xem điều 10) Dịch pha lỗng, mơi trường nuôi cấy thuốc thử 5.1 Yêu cầu chung Xem TCVN 6404 (ISO 7218) ISO/TS 11133-1 5.2 Dung dịch pha lỗng Xem TCVN 6263 (ISO 8261) 5.3 Mơi trường nuôi cấy - Thạch sữa đếm đĩa 5.3.1 Thành phần Dịch chiết nấm men 2,5 g Sản phẩm thủy phân casein enzym 5,0 g Bột sữa gầy a 1,0 g Glucoza, khan (C6H12O6) 1,0 g Thạch g đến 18 gb Nước 000 ml a Bột sữa gầy không chứa chất gây ức chế b Tùy thuộc vào sức đông thạch 5.3.2 Chuẩn bị 5.3.2.1 Chuẩn bị từ mơi trường khơ có bán sẵn Theo hướng dẫn nhà sản xuất, trường hợp nên bổ sung bột sữa gầy nhà sản xuất cho không cần thiết Chỉnh pH cho sau khử trùng pH 7,0 ± 0,2 250C, cần 5.3.2.2 Chuẩn bị từ thành phần khơ Hòa tan nước theo thứ tự sau: dịch chiết nấm men, dịch thủy phân casein enzym, glucoza cuối bột sữa gầy Để hòa tan nên đun nóng nước Thêm thạch đun đến sôi khuấy thạch tan hết Chỉnh pH cho sau khử trùng pH 7,0 ± 0,2 250C, cần 5.3.2.3 Phân phối, khử trùng bảo quản Phân phối môi trường vào ống nghiệm (6.8) với lượng từ 12 ml đến 15 ml vào bình cầu chai (6.9) có dung tích khơng 500 ml Khử trùng 15 nồi hấp áp lực (6.11) 1210C Nếu môi trường sử dụng ngay, làm nguội nồi cách thủy (6.6) đặt 44 0C đến 470C trước sử dụng Nếu không, bảo quản môi trường nơi tối 30C ± 20C không ba tháng điều kiện không làm thay đổi thành phần đặc tính mơi trường Trước kiểm tra vi sinh để tránh chậm trễ rót mơi trường, nên làm tan chảy hồn tồn mơi trường bảo quản, làm nguội nồi cách thủy (6.6) nhiệt độ từ 44 0C tới 470C trước sử dụng (xem 9.2.4) Về việc kiểm tra nhiệt độ môi trường yêu cầu khác, xem TCVN 6404 (ISO 7218) 5.3.3 Kiểm tra hiệu việc đảm bảo chất lượng môi trường nuôi cấy Kiểm tra hiệu môi trường theo ISO/TS 11133-2 5.4 Dung dịch tẩy trùng Sử dụng dung dịch natri hypoclorit chứa từ 50 mg/l đến 100 mg/l clo hoạt tính hỗn hợp etanol (96%) axeton với tỉ lệ 1:1 Chuẩn bị dung dịch tẩy trùng ngày Thiết bị dụng cụ thủy tinh Sử dụng thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm vi sinh thơng thường [xem TCVN 6404 (ISO 7218)] cụ thể sau: 6.1 Dụng cụ thủy tinh Có thể dùng dụng cụ sử dụng lần thay cho dụng cụ thủy tinh sử dụng nhiều lần đáp ứng yêu cầu tương tự Dụng cụ thủy tinh sử dụng nhiều lần phải chịu việc khử trùng nhiều lần phải trơ mặt hóa học 6.2 Dụng cụ cấy vòng 6.2.1 Các phận cấu thành Bộ dụng cụ hồn chỉnh khơng có bán sẵn, lắp ráp từ phận liệt kê 6.2.1.1 đến 6.2.1.3 Cũng sử dụng dụng cụ tự động 6.2.1.1 Que cấy vòng cấy platin, hiệu chuẩn đến 0,001 ml, gắn vào kim tiêm Luerlock Uốn cong 300 đoạn từ mm đến mm tính từ vòng cấy, có đầu mở vòng hướng tâm CHÚ THÍCH: Các vòng cấy platin thích hợp có bán sẵn từ Gerber Instruments K Schneider & Co AG, Thụy sỹ1) Cách khác, sử dụng vòng platin, platin-rodi platin-iridi có đường kính từ 0,4 mm đến 0,5 mm, gắn với que cấy dài từ 60mm đến 70 mm hiệu chuẩn đến 0,001 ml Được uốn cong 300 đoạn từ 3mm đến 4mm tính từ vòng cấy Đoạn cuối que thắt nút vài chỗ Lắp đầu thắt nút que vào kim tiêm Luer-lock, cỡ 13, cưa đoạn từ 24mm đến 26mm từ điểm ống lót đưa vào ống bọc, đến điểm uốn khoảng 12mm đến 14mm tính từ cuối ống lót Định kỳ hiệu chuẩn vòng độ xác quy trình cách phân tích 25 mẫu kép kỹ thuật đếm đĩa chuẩn [xem TCVN 4884 (ISO 4833)] kỹ thuật sử dụng que cấy vòng định lượng Các mẫu cần cho số đếm từ 10 đến 300 tùy thuộc vào số đếm đĩa chuẩn (dung dịch pha loãng thập phân thứ ba) Các trung bình số đếm thu từ hai phương pháp không khác ±10% 6.2.1.2 Pipet liên tục, có dung tích 2ml, có nối Luer-lock (ví dụ xyranh tự điền đầy Socorex Cornwall1) điều chỉnh để phân phối 1,0 ml 6.2.1.3 Ống nối cao su silicon, đường kính 3,0 mm có đủ độ dài để đáp ứng trình cấy, gắn với xyranh nối dài vào vật chứa dịch pha lỗng có đậy nắp CHÚ THÍCH: Đoạn ống nối cao su silicon, ấn kim tiêm cung cấp theo phụ kiện chuẩn với xyranh có bán sẵn 6.2.2 Lắp ráp trùng dụng cụ cấy vòng Gắn kim tiêm với vòng cấy platin (6.2.1.1) vào pipet liên tục (xyranh tự điền đầy) (6.2.1.2) Nối ống cao su silicon (6.2.1.3) vào van lấy xyranh tự điền đầy Kéo dài đầu cuối với ấn gắn vào vật chứa dịch pha loãng (6.3) Đổ dịch pha lỗng thích hợp (5.2) vào vật chứa dịch pha lỗng (6.3) đến 50% đến 80% dung tích vật chứa Khử trùng dụng cụ pipet lắp ráp 15 nồi hấp áp lực (6.11) 121 0C Để nguội 6.3 Dụng cụ chứa dịch pha loãng có nắp đậy, dung tích tối đa 1000ml (ví dụ: chai SchottDuran có nắp vặn polypropylen) Trên nắp phải có lỗ nhỏ để lắp ống cao su silicon Nên gắn ống nghiệm phận thích hợp khác vào dụng cụ để giữ bảo vệ vòng cấy q trình khử trùng 6.4 Tủ ấm, trì nhiệt độ 300C ± 10C 6.5 Máy đo pH, có độ xác hiệu chuẩn ± 0,1 đơn vị pH 250C 6.6 Nồi cách thủy, có khả trì nhiệt độ từ 440C đến 470C 1) Vòng cấy platin Gerber Instruments, Socorex xyranh tự điền đầy Cornwall chai Schott-Duran có nắp vặn polypropylene ví dụ sản phẩm có bán sẵn Thơng tin đưa tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn, ISO không ấn định phải sử dụng chúng 6.7 Dụng cụ đếm khuẩn lạc, ví dụ: gồm có phơng đen chiếu sáng, gắn với thấu kính khuếch đại với độ phóng đại 1,5 lần đếm đếm điện tử Cách khác, sử dụng thiết bị phân tích vi sinh tự động (máy phân tích hình ảnh) 6.8 Ống nghiệm, dung tích khoảng 20 ml, có nắp đậy thích hợp 6.9 Bình cầu chai, có dung tích thích hợp khơng lớn 500 ml, có nắp đậy thích hợp 6.10 Đĩa Petri, thủy tinh chất dẻo, khử trùng, đường kính từ 90 mm đến 100 mm 6.11 Nồi hấp áp lực, trì nhiệt độ 1210C ± 10C Lấy mẫu Điều quan trọng mẫu gửi đến phòng thử nghiệm mẫu đại diện không bị hư hỏng thay đổi trình vận chuyển bảo quản Việc lấy mẫu khơng quy định tiêu chuẩn Nên lấy mẫu theo TCVN 6400 (ISO 707) Chuẩn bị 8.1 Chuẩn bị mẫu thử 8.1.1 Chuẩn bị mẫu thử tránh ánh sáng mặt trời ý đảm bảo vô trùng thông thường cần 8.1.2 Làm ấm mẫu thử trạng thái lạnh từ 150C đến 200C trước thử nghiệm 8.1.3 Lắc mạnh kỹ mẫu thử Để trộn kỹ chai đựng mẫu khơng nên q đầy (khoảng trống lại phía khoảng 10mm đủ) 8.1.4 Để yên cho bọt tan hết trộn lại cách lật chiều chai đựng mẫu hai ba lần trước chuyển sang bước (9.2.1) Thời gian tính từ bắt đầu trình làm ấm (8.1.2) đến bắt đầu cấy (9.2.1) không 20 8.2 Chuẩn bị dụng cụ cấy vòng 8.2.1 Ấn nhanh miệng hút xyranh dụng cụ cấy vòng vơ trùng (6.2.2) vài lần để mồi xyranh thủy tinh (được điều chỉnh để phân phối 1ml) 8.2.2 Trước bắt đầu chuyển để kiểm tra loạt mẫu, nhấn chìm vòng cấy 30s dung dịch tẩy trùng (5.4) Hút loại bỏ năm lần, lần ml dịch pha loãng sau lấy 1ml cho vào đĩa Petri vơ trùng (6.10) Dán nhãn đĩa "Kiểm chứng dụng cụ vô trùng" Cách tiến hành 9.1 Yêu cầu chung Không thực thao tác quy định 9.2 trực tiếp ánh sáng mặt trời Chú ý đảm bảo vô trùng thông thường cần 9.2 Ni cấy ủ 9.2.1 Nhúng vòng cấy vơ trùng (xem 8.2.2) vào mẫu thử chuẩn bị (xem 8.1.4) đến đoạn uốn cong cán que (đoạn uốn thường đánh dấu vạch chia cho phép lấy vòng theo hướng thẳng đứng) Đưa vòng cấy sang ngang mẫu sữa độ sâu với khoảng cách 20 mm rút từ từ với tốc độ khoảng cm/s Tốc độ lấy vòng khỏi bề mặt sữa cần kiểm soát cẩn thận điều ảnh hưởng đến thể tích phần mẫu thử Việc lấy vòng chậm làm 0,001 ml mẫu thử bám vào; lấy vòng mạnh làm nhiều 0,001 ml mẫu thử bám vào Cần sử dụng chai đựng mẫu miệng rộng rọi sáng để tạo thuận lợi cho trình thực 9.2.2 Nhấc nắp đĩa Petri vơ trùng (6.10) Nhúng vòng cấy ấn pittơng để lấy 1ml dịch pha lỗng vơ trùng chảy qua vòng nạp, làm lượng mẫu đong cho vào đĩa Không ấn pittông nhanh không làm cho dịch pha loãng chảy qua cán qua vòng CHÚ THÍCH: Thơng thường, lượng sót lại vòng sau xả mẫu không đáng kể Tuy nhiên, mối hàn khơng tốt bề mặt kim loại khơng trơn trường hợp vòng cũ, bị hư hỏng làm cho việc tráng rửa khơng Thay vòng bị hỏng Chú ý sau dãy 20 phép thử mẫu cần khử trùng vòng dung dịch tẩy rửa (5.4) Khơng khử trùng vòng lửa giảm đáng kể thời hạn sử dụng vòng Trước tiến hành tiếp cần hút xả năm lần, lần ml dung dịch tẩy rửa 9.2.3 Ngay sau dãy mẫu thử trước rửa khử trùng vòng, nên hút nhả ml chất đệm vô trùng cho vào đĩa Petri Ghi nhãn đĩa "Kiểm chứng việc tráng rửa" Trong q trình ủ (9.2.6) khơng có nhiều hai khuẩn lạc phát triển đĩa thạch Ngồi ra, rót mơi trường thạch (5.3) vào đĩa Petri vô trùng Dán nhãn "Thạch kiểm chứng" 9.2.4 Cho từ 10 ml đến 12 ml môi trường tan chảy (xem 5.3.2.3) nhiệt độ từ 44 0C đến 470C vào đĩa cấy Thời gian tính từ hút nhả vòng đến rót môi trường vào đĩa không 15min 9.2.5 Sau rót xong, trộn cách xoay đĩa đủ để thu khuẩn lạc phân tán sau ủ Để môi trường đông để đĩa Petri mặt phẳng nằm ngang, mát 9.2.6 Lập úp đĩa chuẩn bị Đặt vào tủ ấm (6.4) 30 0C 72 h ± h Không chồng cao sáu đĩa Để chồng đĩa tách riêng để cách xa thành tủ ấm [xem TCVN 6404 (ISO 7218)] 9.3 Đếm khuẩn lạc 9.3.1 Đếm khuẩn lạc đĩa sử dụng dụng cụ đếm khuẩn lạc (6.7) Kiểm tra khuẩn lạc ánh sáng dịu Đếm xác khuẩn lạc 9.3.2 Đếm mắt thường khuẩn lạc mọc lan Các khuẩn lạc mọc lan coi khuẩn lạc đơn lẻ Nếu có nửa đĩa mọc dày khuẩn lạc mọc lan, đếm khuẩn lạc phần đĩa khơng bị ảnh hưởng nhân số đếm với để có số lượng khuẩn lạc tồn đĩa Nếu có nhiều nửa đĩa có khuẩn lạc mọc lan loại bỏ đĩa khơng đếm 9.3.3 Về nguyên tắc, sử dụng đĩa có số đếm từ 10 đến 300 để ghi lại kết 10 Tính tốn biểu thị kết Nhân số đếm đĩa với 1000 để thu số đếm plate-loop (PLC) mililit mẫu thử Nếu số đếm 10, báo cáo kết PLC "ít 10 000 mililit" Nếu số đếm vượt 300, báo cáo kết "PLC ước tính mililit" Xem TCVN 6404 (ISO 7218) 11 Độ chụm 11.1 Yêu cầu chung Đối với thông tin giới hạn tin cậy việc ước tính số lượng nhỏ vi sinh vật, xem TCVN 6404 (ISO 7218) CHÚ THÍCH: Khơng có số liệu chi tiết độ chụm thu từ nghiên cứu liên phòng thử nghiệm Các số đưa kết thực nghiệm 11.2 Độ lặp lại Chênh lệch tuyệt đối hai kết thử độc lập, riêng lẻ, thu sử dụng phương pháp, vật liệu thử giống hệt nhau, tiến hành phòng thử nghiệm, người thực sử dụng thiết bị, khoảng thời gian ngắn, không lớn 50% mức 100 000 vi sinh vật mililit (nghĩa kết cao không vượt 50% kết thấp hơn) CHÚ THÍCH: Kinh nghiệm cho thấy độ lặp lại mức 100 000 vi sinh vật mililit khoảng 50% Với số lượng vi sinh giảm số liệu độ lặp lại tăng, nghĩa trở nên dần 12 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ: a) thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu thử; b) phương pháp lấy mẫu sử dụng, biết; c) phương pháp thử sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này; d) chi tiết thao tác không qui định tiêu chuẩn này, tùy ý lựa chọn, với chi tiết bất thường khác ảnh hưởng tới kết quả; e) kết thử nghiệm thu THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] TCVN 6400 (ISO 707), Sữa sản phẩm sữa - Hướng dẫn lấy mẫu [2] THOMSON, D.I., DONNELLY, C.B and Black, L.A A plate loop method for determining viable counts of raw milk J.Milk Food Technol., 23, 1960, pp 167-171 [3] LUCK, H and LATEGAN, B Evaluation of the manual plate loop method for determining the total bacteria count of refrigerated milk S.Afr J Dairy Techno., 15, 1983, pp 15-18  ... trường ni cấy thuốc thử 5.1 Yêu cầu chung Xem TCVN 6404 (ISO 7218) ISO/ TS 1113 3-1 5.2 Dung dịch pha lỗng Xem TCVN 6263 (ISO 8261) 5.3 Mơi trường ni cấy - Thạch sữa đếm đĩa 5.3.1 Thành phần Dịch chiết... trình vận chuyển bảo quản Việc lấy mẫu không quy định tiêu chuẩn Nên lấy mẫu theo TCVN 6400 (ISO 707) Chuẩn bị 8.1 Chuẩn bị mẫu thử 8.1.1 Chuẩn bị mẫu thử tránh ánh sáng mặt trời ý đảm bảo vô... dẫn tiêu chuẩn này; d) chi tiết thao tác không qui định tiêu chuẩn này, tùy ý lựa chọn, với chi tiết bất thường khác ảnh hưởng tới kết quả; e) kết thử nghiệm thu THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] TCVN