Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 4830-3:2005 - ISO 6888-3:2003 trình bày nội dung về vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - phương pháp định lượng staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase staphylococcus aureus và các loài khác trên đĩa thạch - phần 3: phát hiện và dùng kỹ thuật đếm số có xác suất lớn nhất (MPN) để đếm số lượng nhỏ.
TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 4830-3: 2005 ISO 6888-3 : 2003 VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM VÀ THỨC ĂN CHĂN NI - PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG STAPHYLOCOCCI CĨ PHẢN ỨNG DƯƠNG TÍNH VỚI COAGULASE (STAPHYLOCOCCUS AUREUS VÀ CÁC LỒI KHÁC; TRÊN ĐĨA THẠCH - PHẦN 3: PHÁT HIỆN VÀ DÙNG KỸ THUẬT ĐẾM SỐ CÓ XÁC SUẤT LỚN NHẤT (MPN) ĐỂ ĐẾM SỐ LƯỢNG NHỎ Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the enumeration of coagulasepositive staphylococci (Staphylococcus aureus and other species) - Part 3: Detection and MPN technique for low numbers Lời giới thiệu Do tính đa dạng thực phẩm thức ăn chăn ni nên phương pháp khơng thích hợp đến chi tiết cho sản phẩm cụ thể Trong trường hợp này, sử dụng phương pháp khác đặc trưng cho sản phẩm, hồn tồn lý kỹ thuật Tuy nhiên, cần cố gắng áp dụng phương pháp Khi tiêu chuẩn sốt xét tiếp cần phải tính đến thơng tin liên quan đến phạm vi mà phương pháp đếm đĩa phải tuân theo nguyên nhân gây sai lệch so với phương pháp trường hợp sản phẩm cụ thể Việc hài hồ phương pháp thử khơng thực vài nhóm sản phẩm tồn tiêu chuẩn quốc tế và/hoặc tiêu chuẩn quốc gia mà không phù hợp với tiêu chuẩn Trong trường hợp có sẵn tiêu chuẩn quốc tế cho sản phẩm cần thử nghiệm phải tuân theo tiêu chuẩn Hy vọng tiêu chuẩn sốt xét, chúng phải sửa đổi để phù hợp với tiêu chuẩn này, cho cuối sai lệch với phương pháp đếm đĩa lý kỹ thuật thừa nhận VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI - PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG STAPHYLOCOCCI CĨ PHẢN ỨNG DƯƠNG TÍNH VỚI COAGULASE (STAPHYLOCOCCUS AUREUS VÀ CÁC LOÀI KHÁC; TRÊN ĐĨA THẠCH - PHẦN 3: PHÁT HIỆN VÀ DÙNG KỸ THUẬT ĐẾM SỐ CÓ XÁC SUẤT LỚN NHẤT (MPN) ĐỂ ĐẾM SỐ LƯỢNG NHỎ Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the enumeration of coagulase-positive staphylococci (Staphylococcus aureus and other species) - Part 3: Detection and MPN technique for low numbers Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn qui định phương pháp phát định lượng staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase đĩa thạch kỹ thuật đếm số có xác suất lớn (MPN) Tiêu chuẩn áp dụng cho: - Các sản phẩm dùng cho người thức ăn chăn nuôi, - Các mẫu môi trường khu vực sản xuất xử lý thực phẩm Tiêu chuẩn khuyến cáo áp dụng cho sản phẩm ước tính tính staphylococci có mặt sản phẩm với số lượng nhỏ, ví dụ sản phẩm khơ Staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase ban đầu Stapylococcus aureus Stapylococcus intermedius số chủng Stapylococcus hyicus sinh coagulase Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm ban hành áp dụng phiên nêu Đối với tài liệu viện dẫn khơng ghi năm ban hành áp dụng phiên nhất, bao gồm sửa đổi TCVN 6507 (ISO 6887) (tất phần), Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật TCVN 6263 (ISO 8261), Sữa sản phẩm sữa Chuẩn bị mẫu thử dung dịch pha loãng để kiểm tra vi sinh TCVN 4830-1 : 2005 (ISO 6888-1 : 1999, with amendment 1: 2003), Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn ni - Phương pháp định luợng staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase (Staphylococuss aureus lồi khác) đĩa thạch Phần 1: Kỹ thuật sử dụng môi trường thạch Baird-Parker TCVN 4830-2 : 2005 (ISO 6888-2 : 1999, with amendment : 2003), Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi - Phương pháp định lượng staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase (Staphylococuss aureus loài khác) đĩa thạch Phần 2: Kỹ thuật sử dụng môi trường thạch fibrinogen huyết tương thỏ TCVN 6404 (ISO 7218), Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi - Nguyên tắc chung để kiểm tra vi sinh vật ISO/TS 11133-1, Microbiology of food and animal feeding stuffs - Guidelines on preparation and production of culture media - Part 1: General guidelines on quality assurance for the preparation of culture media in the laboratory (Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi - Hướng dẫn chuẩn bị tạo môi trường cấy - Phần Các hướng dẫn chung đảm bảo chất lượng cho việc chuẩn bị môi trường cấy phòng thử nghiệm) ISO/TS 11133-2 ; 2003, Microbiology of food and animal feeding stuffs - Guidelines on preparation and production of culture media - Part 2: Practical guidelines on performance testing of culture media (Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi - Hướng dẫn chuẩn bị tạo môi trường cấy Phần 2: Các hướng dẫn thực hành kiểm tra tính môi trường cấy) Thuật ngữ định nghĩa Trong tiêu chuẩn sử dụng thuật ngữ định nghĩa sau đây: 3.1 staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase (coagulase -positive staphylococci) vi khuẩn hình thành khuẩn lạc điển hình và/hoặc khơng điển hình bề mặt môi trường cấy chọn lọc cho phản ứng dương tính với coagulase phản ứng huyết tương thỏ đặc trưng thạch fibrinogen huyết tương thỏ CHÚ THÍCH: Tiêu chuẩn khẳng định staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase dựa phản ứng dương tính với coagulase mạnh, phải cơng nhận số chủng staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase cho phản ứng dương tính với coagulase yếu Các chủng nhầm với vi khuẩn khác chúng phân biệt thử nghiệm bổ sung việc tạo thermonucleasa (về chi tiết, xem IDF 83) 3.2 Định lượng staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase (enumeration of coagulasepositive staphylococci) Việc xác định số lượng staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase tìm thấy gam mililit mẫu tiến hành thử nghiệm theo phương pháp qui định tiêu chuẩn Nguyên tắc 4.1 Phương pháp phát 4.1.1 Cấy lên môi trường chọn lọc lượng mẫu thử qui định, sản phẩm ban đầu dạng lỏng, lượng huyền phù qui định ban đầu sản phẩm dạng khác 4.1.2 Ủ ống môi trường kỵ khí 37 oC từ 24 h đến 48 h Sự có mặt staphylococci giả định có phản ứng dương tính với coagulase thị khử kali telurit CHÚ THÍCH: Trong tiêu chuẩn này, mơi trường kỵ khí thu cách rót thạch paraffin đậy lên phía ống, có cách khác ủ ống bình tủ ấm điều kiện kỵ khí 4.1.3 Cấy lên bề mặt môi trường Baird-Parker đặc chọn lọc khuẩn lạc lấy từ ống dương tính giả định (4.1.2) sau 24 h tất ống lại sau 48 h 4.1.4 Tất ống cấy 37 oC từ 24 h đến 48 h Sự có mặt staphylococci giả định có phản ứng dương tính với coagulase thị khử kali telurit phản ứng với lòng đỏ trứng 4.1.5 Các khuẩn lạc điển hình và/hoặc khơng điển hình khẳng định phản ứng với coagulase 4.1.6 Cách khác, cấy lên bề mặt thạch fibrinogen huyết tương thỏ, sau ủ ấm thích hợp, có mặt staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase thị khuẩn lạc cho thấy có phản ứng với fibrinogen huyết tương thỏ đặc trưng 4.1.7 Kết "có mặt" hay "khơng có mặt" staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase x g hay x ml sản phẩm 4.2 Phương pháp định lượng 4.2.1 Các dãy dung dịch pha loãng sản phẩm cấy vào môi trường cấy lỏng chọn lọc 4.2.2 Các ống ủ điều kiện kỵ khí 37 oC từ 24 h đến 48 h Sự có mặt staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase giả định thị khử kali telurit CHÚ THÍCH: Trong tiêu chuẩn này, mơi trường kỵ khí thu cách rót thạch paraffin đậy lên phía ống, có cách khác ủ ống bình tủ ấm điều kiện kỵ khí 4.2.3 Cấy lên bề mặt môi trường Baird-Parker đặc chọn lọc khuẩn lạc lấy từ ống dương tính giả định (4.2.2) sau 24 h tất ống lại sau 48 h 4.2.4 Ủ ống 37 oC từ 24 h đến 48 h Sự có mặt staphylococci giả định có phản ứng dương tính với coagulase thị khử kali telurit phản ứng với lòng đỏ trứng 4.2.5 Các khuẩn lạc điển hình và/hoặc khơng điển hình khẳng định phản ứng với coagulase 4.2.6 Cách khác, cấy lên bề mặt thạch fibrinogen huyết tương thỏ, sau ủ ấm thích hợp, có mặt staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase thị khuẩn lạc cho thấy có phản ứng với fibrinogen huyết tương thỏ đặc trưng 4.2.7 Số có xác suất lớn staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase gam hay mililit sản phẩm tính cách đối chiếu với bảng số có xác suất lớn cho độ pha lỗng khẳng định (4 2.5 hoăc 4.2.6) Dịch pha loãng mơi trường cấy Đối với phòng thử nghiệm, xem TCVN 6404 (ISO 7218) Các hóa chất sử dụng để chuẩn bị môi trường cấy thuốc thử phải có chất lượng tinh khiết phân tích 5.1 Dịch pha loãng Xem phần tương ứng TCVN 6507 (ISO 6887), TCVN 6263 (ISO 8261), tiêu chuẩn riêng liên quan đến sản phẩm cần kiểm tra 5.2 Môi trường Giolitti Cantoni cải biến 5.2.1 Môi trường 5.2.1.1 Thành phần Môi trường nồng độ kép Môi trường nồng độ đơn Pepton từ casein 20,0 g 10,0 g Cao thịt 10,0 g 5,0 g Cao men 10,0 g 5,0 g Liti clorua 10,0 g 5,0 g Mannitol 40,0 g 20,0 g Natri clorua 10,0 g 5,0 g Glyxin 2,4 g 1,2 g Natri pyruvat 6,0 g 3,0 g Polyoxyetylen sorbitan mono-oleat (Tween 80) 2,0 g 1,0 g 000 ml 000 ml Nước 5.2.1.2 Chuẩn bị Hoà tan thành phần nước, cách đun nóng khuấy, cần, để thu dung dịch hoà tan hồn tồn Làm nguội đến nhiệt độ phòng chỉnh pH cho sau khử trùng pH cuối 6,9 0,2, cần Phân phối môi trường với lượng thích hợp vào ống nghiệm có kích thước phù hợp (ví dụ: mơi trường nồng độ đơn, dùng ống 16 mm x 160 mm, mơi trường nồng độ kép dùng ống 20 mm x 200 mm) Khử trùng 15 phút nồi hấp áp lực 121 oC 5.2.2 Dung dịch kali telurit 5.2.2.1 Thành phần Kali telurit 2) (K2TeO3) 1,0 g Nước 100 ml 5.2.2.2 Chuẩn bị Hoà tan kali telurit nước cách đun nóng nhẹ Bột phải dễ tan Nếu có mặt chất khơng tan màu trắng nước; loại bỏ kali telurit Lọc qua màng lọc cỡ lỗ 0,22 m để khử trùng Dung dịch bảo quản tối đa tháng nhiệt độ oC oC Loại bỏ dung dịch có kết tủa màu trắng 5.2.3 Mơi trường hồn chỉnh Ngay trước sử dụng, đun nóng mơi trường (5.2.1) 15 phút 100 oC để đuổi hết khơng khí Làm nguội đến nhiệt độ từ 44 oC đến 47 oC kỹ thuật vô trùng cho thêm vào ống dung dịch kali telurit (5.2.2): 0,1 ml mơi trưòng nồng độ đơn 0,2 ml môi trường nồng độ kép 5.2.4 Thử tính để đảm bảo chất lượng mơi trường cấy Để xác định tính chọn lọc suất, xem ISO/TS 11133-1 Bảng cho thấy chuẩn thử nghiệm tính mơi trường Giolitti Cantoni cải biến Bảng - Chuẩn thử nghiệm tính môi trường Giolitti Cantoni cải biến Chức Chế độ ủ Năng suất 2) Các chủng kiểm tra Môi trường chuẩn Staphylococcus aureus ATCC 6538 P Staphylococcus 37 oC aureus ATCC 25923 cộng với 48 chủng cạnh tranh (E.coli ATCC h 8732 25922), chủng tương tự đăng ký khác Chỉ sử dụng kali telurit phù hợp phép thử (5.3.2.2) Phương pháp kiểm tra Chuẩn Bán định lượng > 10 khuẩn lạc, môi trường chọn lọc Escherichia coli ATCC 25922 8739 chủng tương tự Tính 37 oC đăng ký khác chọn loc 48h TSA Không mọc Bán định môi lượng trường không chọn lọc 5.3 Môi trường thạch (20 g/l) 5.3.1 Thành phần Thạch 15 g đến 20 g3) Nước 000 ml 5.3.2 Chuẩn bị Hoà tan thạch nước cách đun sôi khử trùng 15 phút nồi hấp áp lực 121 oC Làm nguội đến nhiệt độ từ 44 oC đến 47 oC trước sử dụng Rót vào ống nghiệm có dung tích thích hợp Bảo quản theo TCVN 6404 (ISO 7218) 5.4 Môi trường thạch Baird-Parker 5.4.1 Thành phần chuẩn bị Xem 5.3 TCVN 4830-1 : 2005 (ISO 6888-1 : 1999, with amendment 1: 2003) 5.4.2 Thử tính để đảm bảo chất lượng mơi trường cấy Để xác định tính chọn lọc suất, xem ISO/TS 11133-1 Đối với chuẩn cứ, xem Bảng B.1 ISO/TS 11133-2 5.5 Môi trường thạch fibrinogen huyết tương thỏ (xem [6] [7]) 5.5.1 Thành phần chuẩn bị Xem 5.3 TCVN 4830-2 : 2005 (ISO 6888-2: 1999, with amendment 1: 2003) 5.5.2 Thử tính để đảm bảo chất lượng môi trường cấy Để xác định tính chọn lọc suất, xem ISO/TS 11133-1 Đối với chuẩn cứ, xem Bảng B.1 ISO/TS 11133-2 5.6 Môi trường canh thang não - tim (Brain-heart infusion broth) 5.6.1 Thành phần chuẩn bị Xem 5.4 TCVN 4830-1 : 2005 (ISO 6888-1: 1999, with amendment : 2003) 5.6.2 Thử tính để đảm bảo chất lượng mơi trường cấy Để xác định tính chọn lọc suất, xem ISO/TS 11133-1 Đối với chuẩn cứ, xem Bảng B.4 ISO/TS 11133-2 5.7 Huyết tương thỏ Xem 5.5 TCVN 4830-1 : 2005 (ISO 6888-1: 1999, with amendment 1: 2003) Thiết bị dụng cụ CHÚ THÍCH: Có thể dùng dụng cụ thuỷ tinh sử dụng lần thay cho dụng cụ thủy tinh sử dụng nhiều lần chúng có đặc tính thích hợp Sử dụng thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm vi sinh thơng thường [xem TCVN 6404 (ISO 7218)] cụ thể là: 6.1 Tủ ấm, hoạt động 37 oC oC 6.2 Tủ sấy lò sấy, thơng gió đối lưu, trì nhiệt độ từ 37 oC đến 55 oC Có thể sử dụng tủ quạt gió 6.3 Đĩa Petri, vơ trùng 3) Tùy thuộc vào sức đơng thạch 6.4 Que cấy vòng, platin-iridi, niken-crơm chất dẻo, đường kính khoảng mm, que cấy vòng 10 l vơ trùng sử dụng lần kim cấy sâu chất liệu tương tự 6.5 Ống nghiệm, có dung tích thích hợp (ví dụ: 16 mm x 160 mm, 20 mm x 200 mm 10 mm x 75 mm) 6.6 Pipet chia độ, có dung tích danh định ml, chia vạch 0,1 ml có lỗ xả với đường kính hợp lý 6.7 Nồi cách thủy, hoạt động nhiệt độ từ 44 oC đến 47 oC 37 oC 6.8 Dao, để cắt thạch 6.9 Bình kỵ khí Lấy mẫu Điều quan trọng phòng thử nghiệm nhận mẫu đại diện không bị hư hỏng biến đổi suốt trình vận chuyển bảo quản Việc lấy mẫu khơng qui định tiêu chuẩn Nếu chưa có tiêu chuẩn riêng lấy mẫu cho sản phẩm tương ứng, bên có liên quan tự thoả thuận vấn đề Chuẩn bị mẫu thử Việc chuẩn bị mẫu thử theo phần thích hợp TCVN 6507 (ISO 6887), TCVN 6263 (ISO 8261) tiêu chuẩn riêng cho sản phẩm tương ứng Nếu chưa có tiêu chuẩn riêng bên liên quan tự thoả thuận với vấn đề Cách tiến hành 9.1 Phương pháp phát 9.1.1 Phần mẫu thử huyền phù ban đầu Xem phần tương ứng TCVN 6507 (ISO 6887) tuỳ thuộc vào sản phẩm có liên quan TCVN 6263 (ISO 8261) Để chuẩn bị huyền phù ban đầu, cho ml g sản phẩm vào ml g môi trường Giolitti Cantoni cải biến nồng độ đơn (5.2) 10 ml 10 g vào 10 ml 10 g môi trường Giolitti Cantoni cải biến nồng độ kép Đối với thể tích lớn phần mẫu thử, thêm x ml x g vào x ml x g môi trường Giolitti Cantoni cải biến nồng độ đơn đuổi khí bổ sung kali telurit, tích khơng khí nhỏ bình vật chứa Rót cẩn thận thạch (5.3) paraffin phủ lên môi trường, làm nguội đến nhiệt độ từ 44 oC đến 47 o C cho đơng đặc lại để tạo thành lớp hàn kín 9.1.2 Tăng sinh Ủ (xem 6.1) dung dịch huyền phù ban đầu (9.1.1) 24 h h 37 oC Nếu bị đen có kết tủa đen cấy truyền 9.1.3 Nếu không màu đen ủ tiếp 24 h h cấy truyền 9.1.3 (kể xuất không xuất màu đen kết tủa đen) 9.1.3 Cấy truyền từ ống tăng sinh Bằng cách vô trùng, tháo bỏ lớp thạch paraffin phía trên, sử dụng dao vơ trùng (6.8) để cắt (xem thích 4.1.2) thành bốn phần theo chiều dọc Nếu cần, chèn dao vào sát thành theo đường cong ống thuỷ tinh để tách lớp phủ Lắc mạnh ống để lớp phủ vỡ thành mảnh nhỏ rơi xuống đáy ống đảm bảo nguyên huyền phù dịch cấy Dùng que cấy vòng vơ trùng (6.4), lấy vòng đầy môi trường chọn lọc dàn lên bề mặt đĩa thạch Baird Parker (5.4) riêng biệt đĩa thạch fibrinogen huyết tương thỏ (5.5) để thu khuẩn lạc phân lập Lật ngược đĩa chuẩn bị đặt chúng vào tủ ấm (6.1) để 37 oC 24 h h 9.2 Phương pháp định lượng 9.2.1 Phần mẫu thử huyền phù ban đầu h 48 h Xem phần thích hợp TCVN 6507 (ISO 6887) tuỳ thuộc vào sản phẩm có liên quan TCVN 6263 (ISO 8261) 9.2.2 Cấy Lấy ba ống môi trường nồng độ kép, đuổi khí bổ sung kali telurit (5.2.3) Chuyển vào ống 10 ml mẫu thử dạng lỏng 10 ml dung dịch pha loãng ban đầu (tức g mẫu) sản phẩm dạng khác Lấy ba ống mơi trường nồng độ đơn, đuổi khí bổ sung kali telurit (5.2.3) Chuyển vào ống ml mẫu thử dạng lỏng ml dung dịch pha loãng ban đầu (tức 0,1 g mẫu) sản phẩm dạng khác Đối với độ pha loãng (tức 10-1, 10-2 10-3 sản phẩm dạng lỏng 10-2, 10-3 10-4 sản phẩm dạng khác), tiến hành mô tả trên, sử dụng pipet vô trùng cho độ pha loãng Chuẩn bị đủ số lượng dung dịch pha loãng để đảm bảo độ pha loãng cuối đủ ba kết âm tính Trộn cẩn thận chất cấy mơi trường, trường hợp tránh để lẫn khơng khí vào Cẩn thận rót lớp thạch (5.3), làm nguội đến nhiệt độ từ 44 oC đến 47 oC lên môi trường ống cấy đặc lại tạo thành lớp hàn kín 9.2.3 Ủ Ủ (xem 6.1) ống nghiệm đựng môi trường nồng độ kép môi trường nồng độ đơn (9.2.2) cấy, 37 oC 24 h h Cấy truyền ống nghiệm cho thấy bị đen có kết tủa đen 9.5 Ủ tiếp ống lại 24 h ± h cấy truyền tất ống 9.1.3 (kể ống có kết tủa đen khơng có kết tủa đen sau 48 h ± h) 9.2.4 Cấy truyền 9.3 Chọn đĩa vả giải thích kết 9.3.1 Mơi trường thạch Baird-Parker 9.3.1.1 Chọn khuẩn lạc Sau ủ đĩa (9.1.3 9.2.4) 24 h, đánh dấu vào đáy đĩa vị trí khuẩn lạc điển hình có mặt CHÚ THÍCH 1: Các khuẩn lạc điển hình có màu đen màu xám, bóng lồi (đường kính từ mm đến 1,5 mm sau ủ 24 h, có đường kính từ 1,5 mm đến 2,5 mm sau ủ 48 h) bao quanh vùng rõ rệt, mờ phần Sau ủ 24 h, xuất vòng màu trắng đục tiếp giáp với khuẩn lạc CHÚ THÍCH 2: Các khuẩn lạc khơng điển hình kích cỡ khuẩn lạc điển hình có hình thái sau a) Các khuẩn lạc đen bóng có khơng có rìa trắng hẹp; khơng có vùng khơng nhìn thấy khơng có vòng trắng đục khó nhìn thấy b) Các khuẩn lạc màu xám khơng có vùng Các khuẩn lạc khơng điển hình hình thành chủ yếu chủng staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase nhiễm vào sản phẩm, ví dụ: sản phẩm sữa, tôm phận vật nuôi Chúng thường hình thành chủng staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase bị nhiễm sản phẩm khác CHÚ THÍCH 3: Các khuẩn lạc khác tất khuẩn lạc lại có khả có mặt đĩa mà khơng cho thấy biểu bên ngồi điển hình khơng điển mơ tả Chú thích Chú thích 2, coi hệ vi khuẩn Ủ lại (xem 6.1) tất đĩa 37 oC thêm 24 h + h đánh dấu khuẩn lạc điển hình Đồng thời đánh dấu khuẩn lạc không điển hình có mặt 9.3.1.2 Khẳng định Từ bề mặt khuẩn lạc chọn (9.3.1.1), dùng kim cấy vô trùng lấy phần chuyển vào ống lọ đựng môi trường canh thang não-tim (5.6) Ủ (xem 6.1) 37 oC 24 h ± h Bằng kỹ thuật vô trùng, lấy 0,1 ml chủng cấy cho vào 0,3 ml huyết tương thỏ (5.7) (trừ nhà sản xuất qui định lượng khác) đựng ống vơ trùng có kích thước thích hợp (ví dụ 10 mm x 75 mm) Nghiêng ống, kiểm tra kết dính huyết tương sau ủ từ h đến h, phép thử âm tính kiểm tra lại sau ủ 24 h h, kiểm tra theo thời gian ủ nhà sản xuất qui định Các phép thử coagulase coi dương tính chủng cấy sinh phản ứng coagulase + theo hướng dẫn đánh dấu (kẻ vạch) Hình Các phản ứng từ 1+ đến 2+ coi trung gian Về kiểm tra âm tính, mẻ huyết tương, thêm 0,1 ml môi trường canh thang não-tim vô trùng (5.6) vào lượng huyết tương thỏ (5.7) khuyến cáo ủ không cấy Việc kiểm tra huyết tương khơng có dấu hiệu kết dính phép thử hợp lệ Đánh dấu dương tính ống có khuẩn lạc khẳng định dương tính với coagulase - âm tính: khơng có chứng hình thành fibrrin + dương tính: kết dính nhỏ khơng có tổ chức + dương tính: kết dính nhỏ có tổ chức + dương tính: kết dính nhiều có tổ chức + dương tính: tồn kết dính khơng dịch chuyển ống bị lật ngược Hình - Đánh dấu phản ứng thử nghiệm với coagulase 9.3.2 Môi trường thạch fibrinogen huyết tương thỏ Sau ủ 24 h ± h, ủ tiếp 24 h cần, staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase hình thành khuẩn lạc nhỏ màu đen màu xám (hoặc chí màu trắng) bao quanh vòng sáng kết tủa dấu hiệu cho hoạt tính coagulase Khi bắt đầu ủ, khuẩn lạc Proteus, cho thấy vẻ bên giống với khuẩn lạc staphylococci có phản úng dương tính với coagulase Tuy nhiên sau ủ 24 h 48 h chúng phát triển thành khuẩn lạc mọc rộng có màu nâu đậm nâu nhạt phân biệt với vi khuẩn staphylococci Phép thử dương tính có mặt khuẩn lạc thị hoạt tính coagulase thấy CHÚ THÍCH: Vi thạch fibrinogen huyết tương thỏ dựa phản ứng coagulase, nên khơng cần thiết phải khẳng định hoạt tính 10 Biểu thị kết 10.1 Phương pháp phát Theo giải thích kết quả, ghi lại có mặt khơng có mặt staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase phần mẫu thử, theo khối lượng tính gam theo thể tích tính mililit mẫu thử 10.2 Phương pháp định lượng 10.2.1 Chọn độ pha lỗng CHÚ THÍCH: Huyền phù ban đầu mẫu thử, dạng lỏng coi dung dịch pha loãng Đối với độ pha lỗng cấy vào mơi trường cấy lỏng chọn lọc (9.1.2 9.2.2), ghi lại số lượng ống nghiệm cho thấy có mặt staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase khẳng định phép thử thạch Baird-Parker (9.3.1) có mặt khuẩn lạc với phản ứng dương tính với coagulase mơi trường thạch fibrinogen huyết tương thỏ (9.3.2) Chỉ rõ ống dương tính Chọn ba độ pha lỗng liên 9.4 TCVN 6404 : 1998 (ISO 7218 : 1996) xác định số có xác suất lớn (MPN) [xem TCVN 6404 (ISO 7218)] 10.2.2 Tính toán Xem 9.4 TCVN 6404 : 1998 (ISO 7218 : 1996) 11 Độ chụm Như biết, sai lệch lớn kết xảy với kỹ thuật MPN Các giới hạn tin cậy qui định dựa hoàn toàn phân bố ngẫu nhiên kết Các nguyên nhân gây sai lệch khác đơi quan trọng, khơng đề cập kỹ thuật MPN Để tính đến ảnh hưởng này, sử dụng phạm trù bảng B.2 TCVN 6404 : 1998 (ISO 7218 : 1996) Chúng tổng kết tổ hợp ống theo khả xuất chúng CHÚ THÍCH: Mơt nghiên cứu cộng tác quốc tế (xem [3]) mẫu sữa khô cho thấy, sử dụng kỹ thuật MPN giống mơ tả tiêu chuẩn này, 75 % trường hợp chênh lệch kết hai phép thử độc lập nhỏ 1,25 lần so với trung bình cộng hai kết Chênh lệch lớn quan sát kết hai phép thử độc lập 1.94 lần so với trung bình cộng hai kết 12 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải rõ: a) Mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu thử, b) Phương pháp lấy mẫu sử dụng, biết; c) Phương pháp thử nghiệm dùng (phương pháp phát phương pháp định lượng; môi trường sử dụng), viện dẫn tiêu chuẩn này; d) Mọi chi tiết thao tác không quy định tiêu chuẩn điều coi tuỳ ý cố mà ảnh hưởng đến kết quả; e) kết thu được, rõ phương pháp biểu thị sử dụng THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] IDF 83 : 1998, Milk and milk-based products - Detection of thermonuclease produced by coagulase - positive staphylococci in milk and milk-based products [2] IDF 60 C : 1997, Milk and milk-based products - Detection of coagulase - positive staphylococci Most probable number technique [3] CHOPIN, A , MALCOLM, S , JARVIS, G , ASPERGER, H , BECKERS, H.J , BERTONA, A.M , COMINAZZINI, C , CARINI, S , LODI, R HAHN, G , HEESCHEN, W , JANS, JERVIS, D.l , LANIER, J.M , OCONNOR, F., REA, M , ROSSI, J , SELIGMANN, R , TESONE, S WAES, G , MOCQUOT, G and PIVNICK H Comparision of four media and methods for enumerating Staphylococcus aureus in powdered milk: ICMSF methods studies: XV, J Food Prot , 48, 1985, pp 21-27 [4] BAIRD - PARKER, A.C improvide diagnostic and selective medium for isolating coagulase positive staphylococci, J Applied Bacteriology, 25 (1), 1962, pp 12-19 [5] SMITH, B.A and BAIRD - PARKER, A.C The use of sulphamezathine for inhibiting Proteus spp on Baird-Parker's isolation medium for Staphylococcus aureus J Applied Bacteriology, 27 (1) 1964, pp 78 - 82 [6] BECKERS, H.L et al Evaluation of pour-plate system with rabbit plasma-bovine fibrinogen agar for the enumeration of Staphylococcus auraus in food Can J Microbioi , 30, 1984, pp 470-474 [7] SAWHEY D The toxicity of potassium tellurite to Staphylococcus aureus in rabbit plasma fibrinigen agar, J Applied Bacteriology, 61, 1996, pp, 149- 155 ... xem ISO/ TS 1113 3-1 Đối với chuẩn cứ, xem Bảng B.1 ISO/ TS 1113 3-2 5.6 Môi trường canh thang não - tim (Brain-heart infusion broth) 5.6.1 Thành phần chuẩn bị Xem 5.4 TCVN 483 0-1 : 2005 (ISO 688 8-1 :... xem ISO/ TS 1113 3-1 Đối với chuẩn cứ, xem Bảng B.1 ISO/ TS 1113 3-2 5.5 Môi trường thạch fibrinogen huyết tương thỏ (xem [6] [7]) 5.5.1 Thành phần chuẩn bị Xem 5.3 TCVN 483 0-2 : 2005 (ISO 688 8-2 :... cấy Để xác định tính chọn lọc suất, xem ISO/ TS 1113 3-1 Đối với chuẩn cứ, xem Bảng B.4 ISO/ TS 1113 3-2 5.7 Huyết tương thỏ Xem 5.5 TCVN 483 0-1 : 2005 (ISO 688 8-1 : 1999, with amendment 1: 2003) Thiết