Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 6831-2:2010 quy định ba phương pháp xác định sự ức chế phát quang của vi khuẩn biển Vibrio fischeri (NRRL B-11177). TCVN 6831-2:2010 (ISO 11348-2) quy định phương pháp sử dụng vi khuẩn khô-lỏng.
TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 6831-2:2010 ISO 11348-2:2007 CHẤT LƯỢNG NƯỚC - XÁC ĐỊNH ẢNH HƯỞNG ỨC CHẾ CỦA MẪU NƯỚC ĐẾN SỰ PHÁT QUANG CỦA VI KHUẨN VIBRIO FISCHERI (PHÉP THỬ VI KHUẨN PHÁT QUANG) - PHẦN 2: PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG VI KHUẨN KHÔ-LỎNG Water quality - Determination of the inhibitory effect of water samples on the light emission of Vibrio fischeri (Luminescent bacteria test)- Part : Method using liquid-dried bacteria Lời nói đầu TCVN 6831-2:2010 thay TCVN 6831-2:2001 (ISO 11348-2:1998) TCVN 6831-2:2010 hoàn toàn tương đương ISO 11348-2:2007 TCVN 6831-2:2010 Ban kỹ thuật Tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC 146 Chất lượng nước biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học Công nghệ công bố Bộ tiêu chuẩn TCVN 6831 Chất lượng nước - Xác định ảnh hưởng ức chế mẫu nước đến phát quang vi khuẩn Vibrio fischeri (phép thử vi khuẩn phát quang) gồm tiêu chuẩn sau: - TCVN 6831-1:2010 (ISO 11348-1:2007), Phần 1: Phương pháp sử dụng vi khuẩn nuôi cấy; - TCVN 6831-2:2010 (ISO 11348-2:2007), Phần 2: Phương pháp sử dụng vi khuẩn khô lỏng; - TCVN 6831-3:2010 (ISO 11348-3:2007), Phần 3: Phương pháp sử dụng vi khuẩn đông khô Lời giới thiệu Phép đo quy định TCVN 6831 (ISO 11348) tiến hành sử dụng vi khuẩn nuôi cấy, vi khuẩn đơng khơ khơ lỏng Cơng việc tiêu chuẩn hóa DIN Normenausschuss Wasserwesen ISO/TC 147/SC 5/WG tiến hành cho thấy, trường hợp đặc biệt, kỹ thuật khác cho kết khác nhau, đặc biệt có mặt kim loại nặng Độ nhạy thay đổi khác thành phần môi trường sử dụng để chuẩn bị vi khuẩn đông khô khô lỏng Các môi trường bảo vệ ảnh hưởng đến tính có sẵn sinh học chất độc và/hoặc phát quang vi khuẩn phát quang Điều có nghĩa nguồn gốc phương pháp chuẩn bị vi khuẩn cần xem xét biểu thị kết Đôi khi, việc khó khăn, vi khuẩn đơng khơ khơ lỏng nhà cung cấp khác Do vậy, việc có nghĩa thành phần chi tiết người sử dụng khơng thể diễn giải Vì lý này, ngồi phép đo độc tính dùng vi khuẩn ni cấy TCVN 6831-1 (ISO 11348-1) vi khuẩn đông khô TCVN 6831-3 (ISO 11348-3), quy trình dùng vi khuẩn khơ lỏng mơ tả tiêu chuẩn này, tính thực quy trình người sử dụng diễn giải chi tiết Phòng thí nghiệm chịu trách nhiệm kết có hội để lựa chọn kỹ thuật phù hợp dựa lời khuyên chuyên gia thông tin mẫu nước thử nghiệm CHẤT LƯỢNG NƯỚC - XÁC ĐỊNH ẢNH HƯỞNG ỨC CHẾ CỦA MẪU NƯỚC ĐẾN SỰ PHÁT QUANG CỦA VI KHUẨN VIBRIO FISCHERI (PHÉP THỬ VI KHUẨN PHÁT QUANG) - PHẦN 2: PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG VI KHUẨN KHÔ-LỎNG Water quality - Determination of the inhibitory effect of water samples on the light emission of Vibrio fischeri (Luminescent bacteria test)- Part 2: Method using liquid-dried bacteria CẢNH BÁO - Người sử dụng tiêu chuẩn cần phải thành thạo với thực hành phòng thí nghiệm thơng thường Tiêu chuẩn không đề cập tới vấn đề an toàn liên quan đến người sử dụng Trách nhiệm người sử dụng phải xác lập độ an toàn, bảo đảm sức khỏe phù hợp với quy định quốc gia QUAN TRỌNG - Điều chủ yếu phép thử theo tiêu chuẩn cần tiến hành nhân viên đào tạo phù hợp Phạm vi áp dụng TCVN 6831:2010 (ISO 11348:2007) quy định ba phương pháp xác định ức chế phát quang vi khuẩn biển Vibrio fischeri (NRRL B-11177) TCVN 6831-2:2010 (ISO 11348-2) quy định phương pháp sử dụng vi khuẩn khô-lỏng Tiêu chuẩn áp dụng cho: - Nước thải; - Dịch chiết dịch ngâm chiết nước; - Nước (nước mặt nước ngầm); - Nước mặn nước lợ; - Dịch rửa giải trầm tích (nước ngọt, nước lợ nước biển); - Nước giếng khoan; - Các chất ô nhiễm đơn, pha loãng nước Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm cơng bố áp dụng phiên nêu Đối với tài liệu viện dẫn khơng ghi năm cơng bố áp dụng phiên bao gồm sửa đổi, bổ sung (nếu có) TCVN 7325 (ISO 5814), Chất lượng nước - Xác định oxy hòa tan - Phương pháp đầu đo điện hóa ISO 5667-16, Water quality - Sampling - Part 16: Guidance on biotesting of samples (Chất lượng nước - Hướng dẫn thử sinh học mẫu) Nguyên tắc Sự ức chế phát quang cấy vi khuẩn Vibrio fischeri xác định cách thử nghiệm theo mẻ Điều thực việc kết hợp thể tích quy định mẫu thử mẫu thử pha loãng với huyền phù vi khuẩn phát quang đựng ống thử Chuẩn phép thử giảm độ phát quang mẫu thử suốt thời gian tiếp xúc, cường độ phát quang mẫu đo sau thời gian phản ứng 15 30 đo thêm sau min, tùy chọn, có tính đến hệ số hiệu ( kt) Ảnh hưởng ức chế mẫu nước xác định LID (xem Phụ lục B) giá trị-EC20 và/hoặc giá trị-EC20 thơng qua dãy pha lỗng (EC nồng độ ảnh hưởng) Các chất gây nhiễu Các chất không tan, tan dễ bay chất có phản ứng với nước pha lỗng với huyền phù, làm thay đổi trạng thái chúng q trình thử, ảnh hưởng đến kết làm giảm độ tái lập kết thử Trong trường hợp nước đục đậm màu, xảy phát quang việc hấp thụ ánh sáng tán xạ ánh sáng gây Sự gây nhiễu đơi khắc phục cách xử lý độ đục mẫu (7.2) hoặc, ví dụ, cách sử dụng cuvet hiệu hấp thụ hai ngăn (xem Phụ lục A) Vì phát quang sinh học[6] cần đến oxy, nên mẫu có nhu cầu oxy cao (và/hoặc có nồng độ oxy thấp) gây thiếu hụt oxy mẫu bị ức chế Các chất dinh dưỡng dễ phân hủy sinh học mẫu làm giảm tự ô nhiễm việc phát quang sinh học[1] Mẫu có pH nằm ngồi khoảng từ 6,0 đến 8,5 ảnh hưởng đến phát quang vi khuẩn[6], [7] Cần phải điều chỉnh pH mẫu ảnh hưởng độc pH khơng mong muốn Vì vi khuẩn thử nghiệm Vibrio fishcheri vi khuẩn biển, nên việc thử nghiệm mẫu nước mặn theo quy trình chuẩn thường dẫn đến hiệu ứng kích thích phát quang sinh học mà che hiệu ứng ức chế (xem Phụ lục D) Nồng độ muối mẫu ban đầu vượt 30 g/l NaCI, hàm lượng thành phần khác có độ thẩm thấu tương đương, với lượng muối cần phải thêm vào thử gây hiệu ứng siêu thẩm thấu Để tránh ảnh hưởng này, nồng độ muối cuối có mẫu thử khơng vượt q độ thẩm thấu dung dịch NaCI 35 g/l Thuốc thử vật liệu Sử dụng hóa chất đạt chất lượng tinh khiết phân tích Dùng nước cất nước có độ tinh khiết tương đương 5.1 Vi khuẩn thử Sử dụng chủng vi khuẩn phát quang thuộc loại Vibrio fischeri NRRL B- 11177 Huyền phù vi khuẩn dùng cho phép đo độc tính chuẩn bị từ thuốc thử khơ-lỏng có sẵn ngồi thị trường Bảo quản vi khuẩn khơ-lỏng nhiệt độ ≤ -18 °C xem xét khuyến nghị nhà cung cấp Vi khuẩn bắt đầu phát triển sau khôi phục sẵn sàng để sử dụng cho phép thử 5.2 Dung dịch natri clorua, làm chất pha lỗng Hồ tan 20 g natri clorua (NaCI) nước thêm nước đến lít 5.3 Dung dịch natri hydroxit, ví dụ c(NaOH) = ví dụ mol/l 5.4 Axit clohydric, ví dụ c(HCI) = ví dụ mol/l Để điều chỉnh pH cần sử dụng axit bazơ nồng độ thấp cao 5.5 Dung dịch dùng cho vi khuẩn khô-lỏng 8,0 g D(+)- Glucoza ngậm nước (C6H12O6.H2O) 20,0 g Natri clorua (NaCI) 2,035 g Magie clorua ngậm sáu nước (MgCI2.6H2O) 0,30 g Kali clorua (KCI) 11,9 g N- (2- Hydroxyetyl) piperazin-N- (2- axit etanesunfonic) (HEPES) Hòa tan thành phần nước, khuấy 30 điều chỉnh pH đến 7,0 ± 0,2 dung dịch natri hydroxit (5.3) axit clohydric (5.4) Thêm nước đến lít Dung dịch bảo quản phần nhiệt độ -18 °C tới - 20 °C 5.6 Chất chuẩn Chuẩn bị riêng rẽ dung dịch chuẩn gốc, pha loãng dung dịch natri clorua (5.2) mà không cần điều chỉnh pH: 219,8 mg/l Kẽm sunfat ngậm bảy nước (ZnSO4.7H2O) mg/l 3,5-dichlorophenol (C6H4OCl2) (Độ tinh khiết ≥ 99 %) 22,6 mg/l Kali dicromat (K2Cr2O7) Các nồng độ xấp xỉ gấp hai lần giá trị EC50 mong đợi chất chuẩn tương ứng tiêu chuẩn Thể tích yêu cầu phụ thuộc vào u cầu thử nghiệm CHÚ THÍCH Có thể sử dụng dung dịch có sẵn ngồi thị trường có nồng độ ZnSO4 K2Cr2O7(titrisol) xác định để chuẩn bị dung dịch gốc chất chuẩn Thiết bị, dụng cụ 6.1 Tủ lạnh sâu, để bảo quản vi khuẩn cần bảo quản 6.2 Hộp kiểm sốt nhiệt độ, để trì mẫu thử nhiệt độ 15 °C ± °C Trong lần thử nghiệm nhiệt độ dao động tối đa ± 0,3 °C 6.3 Máy đo độ phát quang, ngăn đo đo trì nhiệt độ 15 °C ± °C, có trang bị cuvet phù hợp 6.4 Cuvet thử, làm chất liệu trơ hóa học, thích hợp để sử dụng với ngăn đo độ phát quang chọn có dung tích tạo thuận lợi để đọc hết bề mặt lớn phù hợp với hộp kiểm soát nhiệt độ(6.2) 6.6 Đồng hồ tính 6.7 Pipet pittơng bơm tiêm nhựa, 100 l, 500 l 000 l 6.8 Pipet pittơng, có dung tích thay đổi, từ 10 ml đến 200 ml 200 l đến 000 l 6.9 Bể điều nhiệt, có khả trì nhiệt độ 20 °C ± °C 6.10 Nồi cách thủy hộp ổn định nhiệt, để trì dung dịch tích 12 ml chuẩn bị 5.5 (ví dụ bình thuốc thử) nhiệt độ 15 °C ± °C 6.11 Máy đo độ dẫn 6.12 Đầu đo oxy, Theo TCVN 7325 (ISO 5814) Lấy mẫu xử lý sơ mẫu 7.1 Lấy mẫu Mẫu phải đựng vật chứa sạch, trơ hóa học quy định ISO 5667-16 Nạp đầy mẫu vào vật chứa gắn kín Thử nghiệm mẫu sớm tốt sau lấy mẫu Nếu cần, bảo quản mẫu nhiệt độ từ °C đến °C vật chứa nơi tối không 48 h Nếu phải bảo quản mẫu đến hai tháng để mẫu nhiệt độ ≤ -18 °C Khơng sử dụng hóa chất để bảo quản mẫu Cần chỉnh-pH thêm muối trước thử 7.2 Chuẩn bị mẫu Đo nồng độ oxy tất mẫu Nồng độ oxy cần phải > mg/l thử nghiệm Nếu nồng độ oxy mẫu chưa pha loãng nhỏ mg/l, phải sử dụng phương pháp làm đủ oxy cho mẫu, ví dụ sục khí khuấy Đo pH tất mẫu Nếu pH nằm khoảng 6,0 đến 8,5 khơng cần phải điều chỉnh Tuy nhiên, việc chỉnh giá trị-pH làm biến đổi chất mẫu Mặt khác, pH mẫu pH mẻ thử khác khả đệm mơi trường thử Có thể cần phải thực thử nghiệm hai mẫu: mẫu điều chỉnh pH mẫu chưa điều chỉnh-pH Nếu cần, điều chỉnh-pH mẫu cách thêm axit clohydric (5.4) dung dịch natri hydroxit (5.3) Tùy thuộc vào mục đích phép thử điều chỉnh pH đến 7,0 ± 0,2 giới hạn (8,5 ± 0,2) giới hạn (6,0 ± 0,2) Lựa chọn nồng độ axit clohydric dung dịch natri hydroxit cho thể tích thêm vào khơng lớn % tổng thể tích Cho thêm 20 g natri clorua lít vào mẫu nước vào mẫu nước trung hòa Đối với mẫu có nồng độ muối cao đo độ muối cần thêm lượng muối để điều chỉnh độ thẩm thấu tới NaCI 20 g/l Nếu mẫu chứa từ 20 g/l đến 50 g/l NaCI tương đương, không cần thêm muối Nồng độ muối tạo nên mẫu thử không vượt độ thẩm thấu 35 g/l dung dịch natri clorua Phụ lục D cung cấp thêm thông tin mẫu nước mặn Các mẫu đục cần đục để lắng h cho ly tâm, ví dụ 10 5000 g lọc Sử dụng chất lọc cho phép thử Cách tiến hành Chuẩn bị mẫu chuẩn theo 5.6 Thử mẻ vi khuẩn sau tiến hành với ba mẫu chuẩn Thử ba mẫu chuẩn song song với cuvet dung dịch huyền phù gốc hoàn nguyên cho phép thử Chuẩn bị mẫu theo 7.2 Làm tan vi khuẩn khô-lỏng (huyền phù gốc) bể điều nhiệt nhiệt độ 20 °C ± °C Các huyền phù gốc làm lạnh sử dụng cho thử nghiệm ban đầu Chuẩn bị huyền phù thử từ huyền phù gốc theo hai bước: - Thêm 0,5ml dung dịch (5.5) (cho 100 l huyền phù gốc vào cuvet thử), trì nhiệt độ 15 °C ± °C làm đồng cách lắc nhẹ cuvet thử - Chờ khoảng 15 Dùng pipet hút dung dịch huyền phù cho vào bình định mức (dung tích khoảng 20 ml) thêm 11,5 ml dung dịch (5.5), trì nhiệt độ 15 °C ± °C, làm đồng cách lắc nhẹ bình thuốc thử Chờ khoảng 15 Chuẩn bị vào cuvet thử (6.4) dãy dung dịch pha loãng mẫu, mẫu chuẩn (5.6) mẫu kiểm tra (5.2) yêu cầu Quy trình thơng thường để chuẩn bị dãy pha lỗng mô tả Phụ lục B Tùy thuộc vào mục đích thử nghiệm yêu cầu thống kê liên quan đến kết phép thử, thiết kế dãy pha lỗng có nồng độ dãy hình học logarit phù hợp Vì hỗn hợp thể tích mẫu/mẫu pha lỗng huyền phù thử nghiệm, nên nồng độ mẫu cao phép thử chiếm 50% mẫu thử quy luật Đối với phép thử mẫu nước gần khơng pha lỗng (80 % mẫu), cần thêm mẻ kiểm tra (xem B.2 Bảng 1) Duy trì cuvet thử có chứa dung dịch natri clorua (5.2) để kiểm soát, mẫu chuẩn (5.6), mẫu (7.2) mẫu dãy pha loãng (Bảng B.1) 15 °C ± °C Chọn điều kiện thử nghiệm đảm bảo độ lệch nhiệt độ tối đa bể điều nhiệt phép thử không ± 0,3 °C Đối với phép thử tích huyền phù cần thử mẫu thử nhau, dùng pipet hút vào ống đo thứ hai, tương ứng với cuvet thử (6.4) 500 l huyền phù cần thử, trì nhiệt độ 15 °C ± °C tủ ấm, khoảng thời gian (từ s đến 20 s) phép đo cường độ sau Tiến hành phép xác định song song mức pha loãng nhiệt độ thử 15 °C ± °C Điều chỉnh dụng cụ đo huỳnh quang cho thuận tiện gần với mức cực đại Xác định ghi cường độ phát quang, I0, huyền phù thử máy đo phát quang Vì thời gian tiếp xúc tất mẫu phải nhau, nên sử dụng đồng hồ tính (6.6) để đo cường độ phát quang khoảng thời gian đo Khoảng thời gian đo thích hợp s đến 20 s Đo tất huyền phù thử, độ phát quang khác huyền phù thử khơng đồng Ngay sau đo độ phát quang huyền phù thử ban đầu, làm đầy huyền phù thử tới ml mẫu (7.2), mẫu pha loãng (Phụ lục B), mẫu chuẩn (5.6) dung dịch natri clorua (5.2), thích hợp Việc thực cách dùng pipet lấy 500 l dung dịch mẫu (7.2), mẫu pha loãng (Phụ lục B), mẫu chuẩn (5.6) dung dịch natri clorua (5.2), chuẩn bị dãy cuvet thử thứ nhất, cho vào huyền phù thử cần thử cuvet thử dãy ống đo thứ hai tương ứng Trộn tay, bắt đầu bấm đặt ống nghiệm trở lại hộp ổn nhiệt nhiệt độ 15 °C ± °C Lặp lại với tất cuvet thử khác, để khoảng thời gian lần thêm vào Đo ghi cường độ phát quang tất cuvet, kể mẫu kiểm soát, sau 15min sau 30min (I15, I30), đo sau (I5), tùy chọn, để khoảng thời gian đo từ s đến 20 s Ghi lại điều chỉnh dụng cụ Đánh giá 9.1 Ảnh hưởng ức chế lên vi khuẩn phát quang Sử dụng Cơng thức (1) để tính hệ số hiệu (giá trị kt) từ cường độ phát quang đo Hệ số dùng để hiệu giá trị ban đầu I0 tất mẫu thử trước chúng dùng làm giá trị chuẩn để xác định độ giảm phát quang nước kt = Ikt / I0 (t = min, 15 min, 30 min) (1) Trong kt hệ số hiệu thời gian tiếp xúc min, 15 min, 30 min; Ikt cường độ phát quang mẫu kiểm tra sau thời gian tiếp xúc min, 15 30 min, tính đơn vị phát quang tương ứng; I0 cường độ phát quang huyền phù thử kiểm tra trước cho thêm chất pha loãng (5.2), tính đơn vị phát quang tương ứng; Tính hệ số hiệu trung bình kt độ lệch giá trị riêng từ giá trị trung bình tính phần trăm, (lấy chữ số có nghĩa): kti kt / kt 100 (2) Trong đó: kti giá trị riêng hai hệ số hiệu kt giá trị trung bình Dùng Cơng thức (3) để tính Ict: Ict = I0 x (3) kt Trong kt giá trị trung bình kti ; I0 cường độ phát quang huyền phù mẫu thử, trước thêm vào mẫu (7.2) mẫu pha lỗng (Phụ lục B), tính đơn vị phát quang tương ứng; Ict giá trị hiệu I0 cuvet đựng mẫu thử trước cho mẫu thử vào Dùng công thức (4) để tính ảnh hưởng ức chế mẫu thử: Ht = [(Ict - It) / Ict x 100] (4) Trong Ht ảnh hưởng ức chế mẫu thử sau thời gian tiếp xúc min, 15 30 min, tính phần trăm; Ict xem Công thức (3); It cường độ phát quang mẫu thử sau thời gian tiếp xúc min, 15 30 min, tính đơn vị phát quang tương ứng Tính giá trị trung bình ảnh hưởng ức chế Ht cho mức pha lỗng, tính phần trăm Tính chênh lệch số học phép xác định song song Hti từ trung bình tương ứng H t , tính điểm phần trăm (một chữ số có nghĩa): H t (%) - Hti (%) Trong đó: Hti hai giá trị hiệu ứng ức chế mẫu thử H t giá trị trung bình 9.2 Xác định giá trị-EC Tính tốn mối tương quan ảnh hưởng nồng độ thời gian tiếp xúc sử dụng tuyến tính chuẩn thích hợp phân tích hồi qui phi tuyến tính[8] Để đánh giá ảnh hưởng nồng độ sử dụng kỹ thuật hồi quy tuyến tính, ước lượng giá trị gamma cho mức pha loãng (tỷ lệ độ giảm phát quang với tổng lượng ánh sáng lại thời điểm t) sử dụng Công thức (5): t = [ H t / (100 - H t )] (5) Trong t giá trị gamma mẫu thử sau thời gian tiếp xúc min, 15 30 min; H t giá trị trung bình Ht xem Cơng thức (4) CHÚ THÍCH Khi nồng độ thử định cho % 100 % độ ức chế phát quang sinh học, khơng thể tính giá trị gamma Do đó, có giá trị Ht nằm khoảng 10 % 90 % dùng để tính tương quan nồng độ Mối tương quan ảnh hưởng nồng độ thời điểm tiếp xúc cho thường mơ tả phương trình tuyến tính sau: lg ct = b LG t + lg a (6) Trong ct phần mẫu nước có mẫu thử, tính phần trăm; t xem Công thức (5); b giá trị độ dốc đường tuyến tính; lg a giá trị phần bị chắn/giao cắt đường tuyến tính Bằng phương pháp thống kê hồi qui bình phương tối thiểu chuẩn, tính giá trị EC 20 EC50 với giới hạn tin cậy tương ứng, đó: ct = EC20,t t = 0,25; ct = EC50,t t = 1,00 Đối với phân tích hồi qui phi tuyến tính, mơ hình khác có sẵn phần mềm đồ họa chuẩn phần mềm thống kê Các phần mềm dựa hàm phân bố chuẩn (nghĩa phân tích Probit), phân bố logistic (nghĩa phân tích Logit), phân bố Weibull (nghĩa phân tích Weibull) Ảnh hưởng ức chế tính (Ht) dùng trực tiếp để ước lượng thông số ảnh hưởng nồng độ phi tuyến tính, từ đó, giá trị EC mức tính tiếp sau [8] Nếu khoảng cặp giá trị khơng khớp với đường cong, giá trị EC ước lượng theo hình học sử dụng hệ thống tọa độ logarit kép 10 Biểu thị kết Báo cáo kết theo mẫu Bảng Báo cáo khoảng thời gian thử (5 min, 15 30 min) Nếu xác định được, báo cáo giá trị LID lb, (xem Phụ lục B) Nếu xác định được, báo cáo giá trị EC20 EC50 phương pháp để tính độ lệch giá trị Báo cáo cách chuẩn bị vi khuẩn sử dụng Bảng - Ví dụ đánh giá thử nghiệm - Mẫu: nước thải sau xử lý trạm xử lý nước thải Thí nghiệm đối chứng Số mẻ kiểm tra Mức pha loãng Giá trị đo Ik30 / I0 D I0 Ik30 1a ≥2 k 30 Thí nghiệm tính đắn Độ lệch từ giá trị trung bình b k 30 , tính % 93 76 0,8172 91 74 0,8132 92 79 0,8587 95 80 0,8421 0,8152 ± 0,3 0,8504 ± 1,0 Thí nghiệm thử Số mẻ thử Mức pha loãng D 1 Giá trị đo I c 30 H 30 H 30 % % I0 Ik30 92 25 75,0 66,7 93 27 75,8 64,4 86 43 73,1 41,2 90 43 76,5 43,8 91 60 77,4 22,5 89 58 75,7 23,4 95 72 80,8 12,4 94 70 79,9 10,9 91 32 77,4 58,7 93 34 79,1 57,0 Thí nghiệm tính đắn 30 Độ lệch so với giá trị trung bình, tính %c 65,53 ± 1,1 1,901 42,51 ± 1,3 0,740 22,92 ± 0,5 0,297 11,65 ± 0,8 0,132 57,85 ± 0,9 1,372 Chất chuẩn 3,4 mg/l DCP, 2,2 mg/l Zn, 18,7 mg/l Cr 10 a b Xem Phụ lục B Đối với mẻ kiểm tra, độ lệch so với giá trị trung bình k 30 tính chênh lệch số học lần xác định song song so với giá trị trung bình chúng, tính phần trăm [Công thức (2) 9.1] c Đối với mẻ thử, độ lệch giá trị H 30 (tính phần trăm) lần xác định song song so với giá trị trung bình chúng tính chênh lệch số học giá trị H 30 (tính phần trăm) so với giá trị trung bình H 30 (tính phần trăm) (được gọi điểm phần trăm) Giá trị LID ví dụ LIDlb = Giá trị-EC20 ví dụ = 31,9 %, Giá trị-EC50 = 58,8 % (thống kê bình phương tối thiểu chuẩn) 11 Chuẩn tính đắn phép thử Phép thử coi - Giá trị kt ủ 15 30 nằm phạm vi từ 0,6 đến 1,3; - Kết phép xác định song song không chênh lệch so với giá trị trung bình chúng % mẫu kiểm tra; - Đối với mẫu thử mà xác định giá trị-LIDlb giá trị EC20/EC50 tương ứng, độ lệch so với giá trị trung bình chúng “điểm phần trăm” khơng % (xem Chú thích c Bảng 1) - Đối với mẻ vi khuẩn làm tan, ba chất chuẩn (5.6) (các dung dịch không trung hòa, kiểm tra riêng rẽ) gây ức chế từ 20 % đến 80 % sau thời gian tiếp xúc 30 nồng độ sau huyền phù thử cuối cùng: 4,5 mg/l 3,5-diclorophenol 25 mg/l Zn(ll) (tương đương 109,9 mg/l kẽm sunfat ngậm bẩy nước) mg/l Cr(VI) (tương đương 11,3 mg/l kali dicromat) - Một ba mẫu chuẩn (5.6) (các dung dịch khơng trung hòa), thử phép thử song song ống thử dung dịch huyền phù gốc rã đông cho phép thử thực (xem Điều 8) gây ức chế 20 % đến 80 % sau thời tiếp xúc 30 12 Độ xác Trong chương trình thử nghiệm liên phòng cấp quốc gia có 22 phòng thí nghiệm tham gia, tiến hành suốt mùa thu năm 1991 xác định số liệu độ xác Các kết tóm tắt Phụ lục C 13 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải viện dẫn tiêu chuẩn TCVN 6831-2:2010 (ISO 11348-2) Tài liệu cần phải bao gồm thông tin sau: a) Nhận dạng mẫu nước, kể việc lấy mẫu, thời gian lưu giữ điều kiện bảo quản; b) pH nồng độ oxy mẫu nước gốc, tính mg/l % bão hòa; c) Ngày thử nghiệm; d) Phương pháp xử lý sơ mẫu, cần, ví dụ pH sau hiệu chính; e) Nguồn gốc vi khuẩn, số mẻ; ngày bắt đầu kết thúc; f) Nhiệt độ bảo quản vi khuẩn; g) Biểu thị kết theo Điều 10 Bảng 1; h) Mọi sai lệch so với phương pháp thông tin tình ảnh hưởng đến kết quả; i) Kết thử so với chất chuẩn mẻ vi khuẩn phép thử thực tế Phụ lục A (tham khảo) Phương pháp hiệu màu A.1 Phạm vi áp dụng Việc giảm độ phát quang hấp thụ ánh sáng xảy mẫu dãy pha loãng quan sát thấy rõ màu, đặc biệt màu từ đỏ đến nâu Nếu quan sát thấy màu nồng độ EC20, nên thực quy trình sau để kiểm tra cần phải hiệu màu Trong trường hợp, nồng độ mẫu thử gần với giá trị-EC 50 nên hiệu màu A.2 Dụng cụ bổ sung A.2.1 Cuvet hiệu chính-màu: cuvet-hai lớp, lắp vừa với máy đo độ phát quang A.2.2 Pipet Pasteur A.3 Cách tiến hành Thực tồn quy trình hiệu màu nhiệt độ 15 °C ± °C tủ ủ kiểm soát nhiệt độ Chuẩn bị dung dịch pha lỗng mẫu thử (5.2) có nồng độ gần giá trị EC 20,t (Ck) Nếu giá trịEC20t chênh lệch nhiều Ck phải gần với giá trị EC20,t thấp CHÚ THÍCH - Khơng cần phải chọn Ck khác cho khoảng thời gian tiếp xúc (5 min, 15 min, 30 min) Cho 2,0 ml dung dịch natri clorua % (5.2) vào khoang ống hiệu chính-màu Chuẩn bị huyền phù vi khuẩn đặc biệt Với vi khuẩn khơ-lỏng, dùng 1,0 ml huyền phù vi khuẩn gốc Trộn kỹ huyền phù trước dùng pipet Paster để chuyển vào khoang ống hiệu màu Thêm huyền phù cho với mức dung dịch có khoang ngồi cuvet hiệu màu Đo mức ánh sáng (B0) sau 15 min, bật đồng hồ bấm Từ thời điểm trở đi, vị trí cuvet hiệu màu khoảng đo phải giữ nguyên cho tất số đọc Dùng pipet lấy hết dung dịch natri clorua từ khoang ngồi thay vào 2,0 ml mẫu thử pha loãng (Phụ lục B) làm lạnh trước đến 15 °C ± °C Đo mức ánh sáng (I5)5 sau lần đo đầu Dùng pipet lấy hết mẫu thử pha lỗng từ khoang ngồi thay vào 2,0 ml dung dịch natri clorua Đo mức ánh sáng (B10) 10 sau lần đo đầu CHÚ THÍCH Quy trình đơn giản hóa cách dùng hai ống hiệu màu giống hệt Khoang ống thứ chứa đầy nước, khoang cuvet thứ hai chứa đầy mẫu pha lỗng Sau 15 min, đo mức ánh sáng B0 I0 Những giá trị thay cho giá trị B5 I5 để tính tốn A.4 A.4 Tính tốn kết Các tính tốn thừa nhận cường độ màu mẫu phù hợp với định luật Beer-Lambert, trường hợp thơng thường Tính B5 theo Cơng thức (A 1): B5 B0 B0 B10 (A.1) Tính độ hấp thụ (At) nồng độ EC20,t chưa hiệu với thời điểm tiếp xúc (t) theo cơng thức (A.2): EC20 ,t Ck At B5 I5 k ln (A.2) Trong Ck nồng độ mẫu hóa chất có nồng độ thử (màu); k số hệ thống thu theo thực nghiệm ln B5 độ hấp thụ dịch pha loãng cần thử cuvet hiệu màu I5 Tính độ truyền qua tương ứng (Tt) theo Công thức (A.3): e At Tt At (A.3) Tính giá trị gamma hiệu ( c) theo Cơng thức (A.4): c t = (5Tt) - (A.4) Và theo Công thức (A.5): c =c t x (A.5) Trong c t hệ số hiệu cho giá trị gamma thời điểm tiếp xúc định (t); giá trị gamma gốc Tiến hành tính lai kết thử với giá trị hiệu Với thời gian tiếp xúc định, tính độ hấp thụ (At) độ truyền qua (Tt) nồng độ thử, từ tính giá trị gamma chưa hiệu theo Cơng thức (A.6): c = Tt (1 + )-1 (A.6) Hệ số hiệu giống giá trị gamma, thừa nhận độ dốc đồ thị gốc Do đó, điều đủ để tính hệ số hiệu giá trị gamma Trong phép xác định này, áp dụng giá trị gamma tương ứng với nồng độ EC 20,t chưa hiệu ( = 0,25) Cơng thức (A.7) tính hệ số hiệu rút gọn sau: c t c Tt 1 Tt 0,25 0,25 5Tt (A.7) Trong Tt giá trị phát quang sinh học đo thời điểm tiếp xúc định (t); c t hệ số hiệu cho giá trị gamma thời điểm tiếp xúc định (t); giá trị gamma gốc; c giá trị gamma hiệu A.5 Ví dụ Bảng A.1 - Ví dụ Số liệu hiệu màu Ck = 10,0 % phần B5 = 81 I0 = 78 k = 3,1 thể tích Tính hiệu màu C = phần thể tích c 15 = 0,708 C = 0,670 c = 0,657 I5 Mẫu trắng 100 90 5,625 98 82 0,076 0,054 74 0,059 0,040 65 0,055 0,036 11,250 94 63 0,343 0,243 60 0,253 0,170 53 0,242 0,159 22,500 96 45 0,920 0,651 42 0,829 0,556 38 0,768 0,505 45,000 97 15 4,820 3,412 17 3,565 2,389 17 2,994 1,967 Công thức gốc: c I30 30 I0 I15 15 30 c 80 c 70 ln = 1,96 x In C- 5,96 ln = 1,95 x In C- 6,16 ln = 1,90 x In C- 6,12 Công thức hiệu In = 1,96 x In C- 6,30 chính: ln = 1,95 x In C- 6,56 ln = 1,90 x In C- 6,53 EC20,t gốc 10,3 11,6 12,1 EC20,t hiệu 12,3 14,3 15,1 Phụ lục B (tham khảo) Mức pha loãng D - Chuẩn bị dãy pha loãng B.1 Nguyên tắc Khi thử nước thải cách pha lỗng dần (D) mẻ thử có nồng độ đậm đặc mà nồng độ khơng có ức chế, có ảnh hưởng ức chế mà khơng vượt độ biến đổi đặc trưng thử nghiệm, gọi “Độ pha lỗng khơng ảnh hưởng thấp (LID)” Độ pha loãng biểu thị giá trị nghịch đảo phần thể tích nước thải mẻ thử [ví dụ, hàm lượng nước thải (25 % phần thể tích) mức pha loãng D = 4] Trong phép thử vi khuẩn phát quang, thường trộn thể tích huyền phù thử với thể tích mẫu nước thể tích mẫu pha lỗng Do đó, mức pha lỗng dãy pha lỗng theo thơng lệ D ≥ (nồng độ mẫu cao phép thử: 50 % mẫu) B.2 Chuẩn bị mẫu Chuẩn bị mẫu theo 7.2 Mẫu nước thải phải làm đồng cách lắc tay trộn khuấy từ Thêm 20 g dung dịch natri clorua vào lít mẫu nước mẫu nước điều chỉnh-pH Đối với mẫu nước có nồng độ muối cao, đo độ muối tính lượng NaCI (nếu cần) cần để điều chỉnh độ thẩm thấu Nồng độ muối thu mẫu thử không vượt độ thẩm thấu dung dịch natri clorua 35 g/l Chuẩn bị dãy pha loãng dãy cuvet thử thứ Nên dùng dãy pha loãng theo Bảng B.1 Dãy pha loãng chuẩn bị cách pha loãng dần kết hợp hai pha lỗng hình học (D = 2, 4, 8, 16, D = 3, 6, 12, 24, ) Đối với phép xác định song song, thể tích mẫu mẫu pha loãng mẫu kiểm tra 500 l đủ Bảng B.1 - Chuẩn bị dãy pha loãng Mức pha loãng D Thành phần dãy pha lỗng mẫu (Thể tích tổng phép xác định song song: 500 l) Mẫu nước (7.2) Nước pha loãng (5.2) l l 500 500 0 500 500 000 500 750 750 500 000 375 125 12 250 250 16 187,5 312,5 24 125 375 32 93,75 406,25 500 Đối với D = Mẻ kiểm tra Mẻ thử Đối với D ≥ Mẻ kiểm tra Mẻ thử Mẻ chuẩn (Nồng độ xem 5.6) Cách dễ để chuẩn bị dãy pha loãng tạo hai dung dịch pha loãng gốc ống nghiệm riêng rẽ (xem Hình B.1) CHÚ DẪN mẫu a Mẫu pha loãng để tạo dãy thử thứ b Mức pha loãng cuối D sau thêm huyền phù thử Hình B.1 - Sơ đồ pha loãng Pha loãng 1, 000 l mẫu chưa pha loãng (độ pha loãng cuối phép thử sau trộn với thể tích huyền phù thử 2) Pha lỗng 3, ví dụ 000 l mẫu + 000 l dung dịch 5.2 (độ pha loãng cuối phép thử sau trộn với thể tích huyền phù thử 3) Đối với chuẩn bị pha loãng nữa, chuyển 500 l mẫu /mẫu pha loãng vào 500 l dung dịch 5.2 ống thử, trộn sau lần chuyển Trong phép thử vi khuẩn phát quang, thường 500 l mẫu nước mẫu pha loãng chuẩn bị dãy thử thứ trộn với 500 l huyền phù thử (xem Điều 8) chuẩn bị dãy ống thử thứ hai, sau đo cường độ ánh sáng ban đầu huyền phù thử Do vậy, mức pha loãng thu D mẻ thử phép đo ức chế phát quang gấp đôi độ pha loãng mẫu mẫu pha loãng Nếu cần thử mẫu nước gần chưa pha lỗng, thêm 800 l mẫu nước chưa pha loãng (7.2) vào 200 l huyền phù thử Độ pha loãng mẫu 1,25 (nồng độ mẫu cuối phép thử: 80 % mẫu) Giá trị D tương ứng coi D = Huyền phù thử D = chuẩn bị cách thêm 4,5 ml dung dịch (5.5) vào vi khuẩn tạo huyền phù lại, thay cho 11,5ml Đối với giá trị này, cần có mẻ kiểm tra thêm để tính tốn hệ số hiệu phục vụ cho việc hiệu giá trị ban đầu Mẻ kiểm tra làm cách thêm 800 l dung dịch natri clorua (5.2) vào 200 l huyền phù thử B.3 Cách tiến hành Thực phép thử theo Điều Thực phép xác định kép mức pha loãng Xác định ghi lại cường độ phát quang tất ống thử, kể ống thử kiểm tra, sau 15 30 min(I30), tùy chọn B.4 Đánh giá Tính giá trị trung bình ảnh hưởng ức chế H 30 mức pha lỗng, tính phần trăm (xem 9.1) Tính độ lệch phép xác định song song H30 so với giá trị trung bình chúng tương ứng cho phép xác định kép H30 (%) (trung bình) - H30 (%) tính điểm phần trăm, (một chữ số có nghĩa) theo phần trăm trung bình cho kiểm tra (hệ số hiệu chính, xem 9.1) B.5 Biểu thị kết Biểu thị kết theo Điều 10 Giá trị D thấp thử mức mà hiệu ứng ức chế trung bình H 30 < 20 %, gọi LIDlb B.6 Báo cáo thử nghiệm Xem Điều 13 Ngoài số liệu yêu cầu tiêu chuẩn này, báo cáo thử nghiệm phải bao gồm thông tin độ nước thải, điều chỉnh độ muối phương pháp xử lý sơ (lắng, lọc, ly tâm, sục khí) Phụ lục C (tham khảo) Số liệu độ Đối với chương trình thử nghiệm liên phòng, dung dịch chưa trung hòa gồm 3,5-diclorophenol, kẽm sunfat ngậm bảy nước, kali dicromat xetyltrimethyammonium bromua pha nước cất nước có độ tinh khiết tương đương Những giá trị EC xác định nêu 9.2, kết đưa Bảng C.1 CHÚ THÍCH Do số phòng thí nghiệm cho kết ức chế lớn 20 % nồng độ thử thấp kết ức chế nhỏ 50 % nồng độ thử cao nên giá trị l đơi có khác EC20 EC50 Bảng C.1 - Số liệu độ xác vi khuẩn khơ-lỏng l=n nAP % x mg/l % 4,8 4,69 1,03 22,0 20 4,8 7,61 1,31 17,2 19 5,0 15,0 3,6 23,8 20 0,0 26,3 6,1 23,2 EC20 18 0,0 1,22 0,5 46,2 EC50 19 0,5 3,50 1,15 32,8 EC20 14 0,0 0,745 0,416 55,9 EC50 16 5,9 1,199 0,346 28,9 Kẽm sunfat ngậm nước a EC20 EC50 mg/l 20 EC50 CVR 3,5-diclorophenol EC20 sR Kali dicromat a Cetyltrimethylamoni Các chữ viết tắt bảng C.1 biểu thị: l: Số lượng phòng thí nghiệm tham gia; n: Số lượng liệu; nAP: Số lượng ngoại lệ; x : Giá trị trung bình; sR: Độ lệch chuẩn độ tái lập; CVR: Hệ số biến thiên độ tái lập; EC20: Nồng độ ảnh hưởng gây ức chế phát quang 20 %; EC50: Nồng độ ảnh hưởng gây ức chế phát quang 50 % a Nồng độ Zn(ll) Cr(VI) tương ứng Phụ lục D (Tham khảo) Thử mẫu nước mặn với phép thử vi khuẩn phát quang dùng vi khuẩn khô-lỏng D.1 Thông tin chung Sinh vật thử Vibrio fischeri vi khuẩn biển Thử mẫu nước mặn quy trình chuẩn thường dẫn tới ảnh hưởng kích thích mà gây cản trở hiệu ứng ức chế[2] Sự kích thích ion kim loại kiềm kim loại kiềm thổ[2], [3] Với cải tiến quy trình thử, phát quang sinh học kiểm tra tối ưu hóa cách sử dụng nước biển nhân tạo nước lợ nhân tạo kiểm tra pha loãng Do vậy, hiệu ứng kích thích giảm bớt phương pháp áp dụng cho mẫu nước biển, nước lợ nước lọc tương ứng D.2 Định nghĩa D.2.1 Độ muối (Salinity) Độ muối thực tế (practical sanility) S Đại lượng không thứ nguyên, dùng để kiểm tra chất lượng nước, xem ước lượng nồng độ muối hòa tan nước biển, tính gam kilogram; Nó định nghĩa theo toán học, tỷ số (K15) độ dẫn điện mẫu nước, 15 °C atm *, độ dẫn điện dung dịch kali clorua xác định (32,4366 g/kg mẫu) nhiệt độ áp suất CHÚ THÍCH Chấp nhận từ TCVN 8184-2:2009 (ISO 6107-2:2006), định nghĩa 85 D.2.2 Mẫu nước mặn (salt water sample) Mẫu nước mặn lợ có độ muối khoảng từ đến 35 D.2.3 Nước chiết trầm tích biển lợ (Eluates of marine or brackish sediments) Dịch chiết lỏng trầm tích biển nước lợ có nước lợ/biển nhân tạo tự nhiên môi trường rửa giải D.2.4 Trầm tích nước biển nước lợ (Pore water of marine or brackish sediment particles) Nước nằm hạt trầm tích biển trầm tích lợ D.3 Vật liệu D.3.1 Chất chuẩn - 3,5-dichlorophenol; - Kẽm sunfat ngậm bảy nước (ZnSO4.7H2O) D.3.2 Nước biển nhân tạo (ASW) nước lợ nhân tạo (ABW) Sử dụng nước loại ion để chuẩn bị nước biển nhân tạo (ASW) nước lợ nhân tạo (ABW) với thành phần nêu Bảng D Tất thuốc thử phải cấp độ tinh khiết Bảng D.1 - Nước mặn nhân tạo (ASW) (như quy định ISO 10253[5]) nước lợ nhân tạo (ABW) Nước mặn nhân tạo (ASW) Nước lợ nhân tạo (ABW) NaCI 22,0 14,19 MgCI2.6H2O 9,7 6,26 Na2SO4(anhydris) 3,7 2,39 CaCl2 (anhydris) 1,0 0,65 KCI 0,65 0,42 NaHCO3 0,20 0,13 H3BO3 0,023 0,015 47,000 ± 1,000 31,000 ± 1,000 31 ± 20 ±1 7,5 ± 0,2 7,5 ± 0,2 Độ muối (g/l) Độ dẫn điện ( S/cm) (20 °C) Độ muối nhân tạo (20 °C) Giá trị pH * Theo quy định hợp pháp, atm chuyển thành Pa: atm = 101 325 Pa D.4 Cách tiến hành D.4.1 Khái quát Hoàn nguyên vi khuẩn theo quy trình chuẩn Tùy thuộc vào độ muối mẫu, sử dụng nước biển nhân tạo (ASW) nước lợ nhân tạo (ABW) làm mẫu kiểm tra âm, nước pha loãng cho dãy pha loãng mẫu nước pha loãng cho chất chuẩn thay cho dung dịch natri clorua % (S 20) (xem tóm tắt Bảng D.2) Bảng - D.2 - So sánh quy trình chuẩn quy trình cải biến Quy trình chuẩn TCVN 6831-2:2010 Nước lợ cải biến Nước mặn cải biến (ISO 11348-2) Độ muối mẫu (S) X