Xây dựng quy trình thực nghiệm phân tích độc tố ciguatoxins trong chình biển bằng phương pháp sắc ký lỏng đầu dò khối phổ kép (LC MS MS)

Lời cam đoan Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Nha Trang, ngày 04 tháng 10 năm 2019 Tác giả luận văn Nguyễn Phương Nga LỜI CẢM ƠN Để luận văn đạt kết tốt đẹp, nhận nhiều giúp đỡ quý báu thầy cô giáo, nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực đồng nghiệp bạn bè Đầu tiên tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Đào Việt Hà TS Phạm Đức Thịnh tận tình hướng dẫn, quan tâm tạo điều kiện cho tơi hồn thành luận văn Tơi chân thành cảm ơn đề tài Nghiên cứu độc tố số lồi cá rạn thân mềm có nguy gây ngộ độc thực phẩm Việt Nam (mã số: KHCBBI.02/18-20) Viện Hải dương học hỗ trợ kinh phí cho việc thực Luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Hóa Học, Học viện Khoa học Cơng nghệ, Phòng Quản lý Tổng hợp tạo điều kiện thuận lợi giúp tơi thực luận văn hồn thành thủ tục cần thiết Tôi chân thành cảm ơn giúp đỡ tạo điều kiện mặt Lãnh đạo Viện Hải dương học anh chị em phòng Hóa sinh q trình thực luận văn Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân bạn bè quan tâm, động viên giúp đỡ tơi suốt q trình học tập hồn thành luận văn Nha Trang, ngày 04 tháng 10 năm 2019 Tác giả luận văn Nguyễn Phương Nga Danh mục ký hiệu chữ viết tắt AcOH : Acetone ACN : Acetonitril ATTP : An toàn thực phẩm APCI : Atmospheric pressure chemical ionization CFP : Ciguatera Fish Poisoning CTX : Ciguatoxin CTXs : Ciguatoxins DW : Distilled water đvdt : Đơn vị diện tích ESI : Electrospray ionization EI : Electron ionization FAB : Fast-atom bombardment HR-FABMS : High-resolution fast atom bombardment mass spectrometry H-NMR : Proton NMR spectroscopy COSY : Correlated Spectroscopy GC : Gas chromatography HPLC : High-performance liquid chromatography HRMS : High Resolution Mass Spectrometry IP : Identification point IS : Ion spray LC : Liquid Chromatography LOD : Limit of Detection LOQ : Limit of Quantitation MeOH : Metanol MeCN : Acetonitrile MRM : Multi Reaction Monitoring MS : Mass spectrometry NĐTPB : Ngộ độc thực phẩm biển PTN : Phòng thí nghiệm RF : Radio frequency SIM : Selected Ion Monitoring SPE : solid phase extraction SRM : Selected Reaction Monitoring TFA : Trifluoroacetic acid TEM : Temperature Danh mục bảng Bảng 1.1 Các độc tố ciguatoxins ion phân tử tương ứng phân tích sắc ký khối phổ……………………………………………… ……………17 Bảng 2.1 Định danh ký hiệu mẫu 25 Bảng 3.1 Ảnh hưởng điều kiện chiết rút dịch chiết … 36 Bảng 3.2 Thời gian lưu mẫu phép phân tích với pha tĩnh Agillent…………… ………………………………………………….……41 Bảng 3.3 Thời gian lưu mẫu phép phân tích với pha tĩnh Wakosil………………………………………………………………………43 Bảng 3.4 Đánh giá độ thích hợp hệ thống cột Agilent Poroshell 120 ECC18 (100 × 2,1 mm; 1,9 mm kích cỡ hạt nhồi)…………………………… 45 Bảng 3.5 Hàm lượng CTXs mẫu Chình biển Việt Nam Nhật Bản……………………………………………………………………… …48 Bảng 3.6 Kết so sánh phương sai mẫu Việt Nam Nhật Bản………………………………………………………………………… 50 Bảng 3.7 Kết so sánh phương sai mẫu gan Việt Nam Nhật Bản………………………………………………………………………… 50 Bảng 3.8 Kết kiểm định khác biệt mẫu Việt Nam Nhật Bản………………………………………………………………………… 51 Bảng 3.9 Kết kiểm định khác biệt mẫu gan Việt Nam Nhật Bản…………………………… ……………………………… …….52 Danh mục hình vẽ, đồ thị Hình 1.1 Một số cấu trúc Ciguatoxin từ G toxicus………… ……….10 Hình 1.2 Cấu trúc Pacific (P-CTX-1) Caribbean (C-CTX-1) ciguatoxin………………………………………………………………… 11 Hình 1.3 Mơ chuỗi thức ăn biển…………………………………… 12 Hình 1.4 Mơ hình hệ thống LC-MS 14 Hình 1.5 Khối phổ thời gian lưu 16 dẫn xuất CTXs ……… …… 22 Hình 3.1 Sắc ký đồ CTX-1B chuẩn 38 Hình 3.2 Sắc ký đồ mẫu có thời gian lưu so với mẫu chuẩn 38 Hình 3.3 Sắc ký đồ mẫu gan có thời gian lưu so với mẫu chuẩn 38 Hình 3.4 Sắc ký đồ số mẫu dương tính phân tích CTXs LC/MS-MS pha tĩnh Agilen (A: C026; B: C029; C: C034; D: G035; E: G036)…………………………………… ……………………….……… 40 Hình 3.5 Sắc ký đồ số mẫu dương tính phân tích CTXs LC/MS-MS pha tĩnh Wakosil (A: G028; B: G027; C: C026; D: C027; E: G030)……………………………………………………………………… 42 Hình 3.6 Sắc ký đồ mẫu C034 phân tích CTXs 02 pha tĩnh (A: pha tĩnh Agilent; B: pha tĩnh Wakosil)……………………………… ………….43 Hình 3.7 Đánh giá độ đặc hiệu cột Agilent (A: sắc ký đồ mẫu cá chứa độc tố; B: sắc ký đồ Acetone; C: Sắc ký đồ chuẩn CTX-1B)……… …….44 MỤC LỤC MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 NGỘ ĐỘC CIGUATERA 1.1.1 Khái niệm 1.1.2 Đối tượng gây ngộ độc 1.1.3 Triệu chứng lâm sàng 1.2 ĐỘC TỐ CİGUATOXİNS 1.2.1 Bản chất, cấu trúc hoá học 1.2.2 Cơ chế hoạt động 11 1.2.3 Nguồn gốc tích luỹ sinh học 11 1.3 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP NỐİ ĐẦU DÒ KHỐİ PHỔ 12 1.3.1 Nguyên lý hoạt động 13 1.3.2 Sự kết hợp sắc ký lỏng khối phổ 16 1.3.3 Ứng dụng sắc ký khối phổ phân tích độc tố Ciguatoxins 16 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 25 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 25 2.2.1 Nguyên liệu, thiết bị 25 2.2.1.1 Dung mơi, hóa chất 25 2.2.1.2 Thiết bị, dụng cụ phân tích 26 2.2.2 Chiết tách tinh độc tố CTX từ gan Chình biển 27 2.2.3 Xác định độc tố CTXs phương pháp LC/MS-MS 32 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1 KẾT QUẢ CHİẾT RÚT VÀ TİNH SẠCH ĐỘC TỐ CTXS TỪ MỘT SỐ BỘ PHẬN CỦA CHÌNH BİỂN (CƠ, GAN) 36 3.2 THÀNH PHẦN VÀ HÀM LƯỢNG ĐỘC TỐ CTXS TRONG CƠ, GAN, CHÌNH BİỂN 37 3.3 QUY TRÌNH THỰC NGHİỆM PHÂN TÍCH ĐỘC TỐ CTXS BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC/MS-MS 46 3.4 ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM (ĐỐI CHIẾU VỚI KẾT QUẢ KIỂM CHỨNG CỦA NHẬT BẢN) 48 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Ciguatera (CFP) dạng ngộ độc thực phẩm biển (NĐTPB) ăn phải lồi cá rạn san hơ vùng biển nhiệt đới cận nhiệt chứa độc tố ciguatoxin (CTX) dẫn xuất độc tố Độc tố CTXs sản sinh loài vi tảo sống đáy Gambierdiscus toxicus tích lũy qua chuỗi thức ăn biển Đến phát 400 lồi cá rạn có nguy ngộ độc CFP Mặc dù tỉ lệ tử vong thấp (0,1%), CFP mối lo ngại lớn giới mặt an toàn thực phẩm (ATTP), độc tố có hiệu ứng dài hạn (vài tháng năm), gánh nặng dịch vụ y tế, chăm sóc sức khoẻ cộng đồng CFP gây nên tâm lý hoang mang, bất ổn cho người tiêu dùng, dẫn đến thiệt hại kinh tế ngành công nghiệp thuỷ hải sản nội địa xuất nhiều quốc gia Trước đây, tình trạng ngộ độc CFP xảy Nam Thái bình dương, Caribbe Ấn Độ, đến lan khắp châu Á, châu Âu Bắc Mỹ Ở Mỹ, từ thập niên 1970 đến nay, vụ ngộ độc CFP tăng gấp lần lên 250 vụ năm Trong đó, nhập phần lớn hải sản, Hồng Kông năm xảy hàng trăm vụ ngộ độc CFP so với mức chưa đến 10 vụ vào năm 1980 Tỷ lệ mắc phân bố CFP giới ngày gia tăng, theo thống kê FAO, hàng năm có khoảng 20,000 - 30,000 vụ ngộ độc CFP ghi nhận, phần lớn tập trung vùng biển nhiệt đới cận nhiệt đới Ở Việt Nam, theo thông tin từ y tế địa phương, từ 2007 đến nay, hàng năm ghi nhận rải rác vụ ngộ độc nghi ngờ CFP, xảy chủ yếu vùng ven biển Quảng Ngãi, Ninh Thuận, Bình Thuận,… Năm 2012, hội thảo ATTP EU báo cáo ghi nhận độc tố nghi ngờ CTXs cá Hồng nguồn gốc Việt Nam Đến tháng 5/2017, EU thức cảnh báo ATTP mặt hàng cá Hồng xuất Việt Nam Dù nhiều quan tâm, hướng nghiên cứu độc tố CTXs giới vấp phải trở ngại lớn phương pháp nguồn chất chuẩn quý CTXs hợp chất polyete tan dung môi hữu cơ, bền nhiệt (nhiệt độ cao đóng băng) bền pH (axit hay kiềm), không nhạy với ánh sáng tia cực tím, nên khơng thể phân biệt trực quan Gần đây, nhóm nhà khoa học Nhật Bản công bố kết phát triển phương pháp phân tích độc tố CTXs mẫu thịt cá sử dụng hệ thống sắc ký lỏng khối phổ kép (LC/MS-MS) Tuy nhiên đến chưa có cơng bố cơng trình nghiên cứu độc tố Đơng Nam Á, gây khó khăn việc giám sát cảnh báo vấn đề ATTP Hơn nữa, trình nghiên cứu CFP Việt Nam gặp nhiều khó khăn đặc tính sinh học lồi, nguồn gốc, chế tích lũy lan truyền độc tố chuỗi thức ăn biển phức tạp, đặc biệt chưa có phương pháp phân tích phù hợp thiếu trang thiết bị phân tích đại chuyên sâu chưa tiếp cận, cập nhật phương pháp phân tích giới Hiện nay, Viện Hải dương học xây dựng quy trình phân tích độc tố cá Hồng chưa có quy trình phân tích lồi Chình biển, vậy, học viên chọn đề tài luận văn “Xây dựng quy trình thực nghiệm phân tích độc tố Ciguatoxins Chình biển phương pháp sắc ký lỏng đầu dò khối phổ kép (LC/MS-MS)” Nội dung phân tích độc tố CTXs đề tài sử dụng quy trình phân tích độc tố CTXs cập nhật Nhật Bản Tuy nhiên, quy trình thực nghiệm cần hiệu chỉnh phù hợp với điều kiện hệ thiết bị có Việt Nam thành phần hố sinh Chình biển để đảm bảo độ tin cậy tính xác kết phân tích Mục tiêu nghiên cứu - Dựa quy trình phân tích Ciguatoxins Nhật Bản, tiến hành hiệu chỉnh để xây dựng quy trình thực nghiệm vừa phù hợp với điều kiện trang thiết bị Việt Nam vừa phù hợp với thành phần hóa sinh Chình biển để đảm bảo độ tin cậy tính xác kết phân tích 45 Kiểm tra tính tương thích hệ thống Để đảm bảo độ thích hợp hệ thống LC/MS-MS điều kiện phương pháp xây dựng phân tích định tính định lượng độc tố CTX-1B dung dịch chuẩn 10 ng/mL độc tố phân tích lặp lại lần đánh giá tiêu chí sau: độ lặp lại thời gian lưu; độ lặp lại diện tích pic ion thứ cấp m/z 1133,6; tỷ lệ đáp ứng pic theo ion thứ cấp m/z 1133,6 1117,6 Bảng 3.4 Đánh giá độ thích hợp hệ thống cột Agilent Poroshell 120 ECC18 (100 × 2,1 mm; 1,9 mm kích cỡ hạt nhồi) Chỉ tiêu đánh giá (n = 6) Thời gian lưu (phút) Diện tích pic (counts) ion m/z 1133,6 (ion sơ cấp) Tỷ lệ đáp ứng ion m/z mẹ ion m/z thứ cấp (%) CTX-1B 10,858 ± 0,132 RSD: 1,22 % 71500 ± 400 RSD: 0,6 % 9,0 ± 0,1 RSD: 1,4 % Nhận xét: Kết trình bày bảng 3.4 cho thấy, với lần lặp lại, thời gian lưu (RSD nhỏ 10%), diện tích peak diện tích peak theo ion thứ cấp m/z 1117,6 dùng cho định lượng (RSD nhỏ 2%) ổn định sau lần tiêm lặp lại, đồng thời tỷ lệ đáp ứng ion thứ cấp m/z 1133,6 1117,6 dao động cao 1,4 % so với giá trị trung bình Như vậy, điều kiện LC/MS-MS sử dụng với cột Agilent Poroshell 120 EC-C18 (100 × 2,1 mm; 1,9 mm kích cỡ hạt nhồi) thích hợp để phân tích định tính, định lượng độc tố cá chình 46 3.3 QUY TRÌNH THỰC NGHİỆM PHÂN TÍCH ĐỘC TỐ CTXS BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC/MS-MS Trên sở số liệu thu nhận trình thực nghiệm, quy trình đề xuất cho tách chiết làm độc tố CTXs từ mơ cá Chình mơ tả sơ đồ sau: Mẫu 5g (Cơ/gan cá chình) + 15 mL Acetone (để qua đêm) Ly tâm Hỗn hợp Acetone, CTXs tạp chất Cô quay đuổi Acetone + mL Diethyl ether Dung dịch phân thành lớp → Diethyl ether (lớp trên) Cô quay đuổi Diethyl ether + mL MeOH-DW (9:1, v/v) + mL Hexan Dung dịch phân thành lớp → Lấy lớp (MeOH-DW) Cô quay đuổi MeOH-DW + mL EtOAc – MeOH (9:1, v/v) Cho qua cột InertSep FL-PR, 500 mg Dịch Cô quay chân không + mL ACN Cho qua cột InertSep FL-PR, 200 mg 47 Dịch Cô quay chân không + mL ACN Cho qua cột InertSep PSA, 200 mg* Dịch Cô quay chân không Cặn + μL MeOH LC/MS-MS ( Nếu mẫu cá khơng cần cho qua cột PSA - Phân tích LC/MS-MS + Ion sơ cấp lựa chọn [M+Na]+ CTX-1B có m/z 1133,6 + Điều kiện sắc ký: ion spray voltage (IS) 5500V nhiệt độ buồng ion IS 500°C (TEM) Nguồn lượng ion GS1 GS2 lần lượt 80 30, giá trị tối ưu DP (thể tách chùm) 400, lượng bắn phá ion sơ cấp CE 12V để đáp ứng cường độ peak tốt đầu dò khối phổ MS + Chế độ chạy: Q3 SIM Event Tên chất m/z CTX-1B 1133.60 54 deoxy-CTX-1B 1117.60 CTX-4A/4B 1083.60 CTX-3C 1045.60 48 + Nhiệt độ cột: 40°C + Thời gian chạy mẫu: 27 phút/mẫu + Tốc độ dòng: 0,25 mL/phút + Pha tĩnh: Agilent Poroshell 120 EC-C18 (100 × 2,1 mm; 1,9 mm kích cỡ hạt nhồi) + Pha động:  Kênh A: Nước cất hỗn hợp dung dịch (5 mM HCOONH4, 0,1% HCOOH) theo tỉ lệ 95:5 (v/v) (475 mL:25 mL)  Kênh B: MeOH  Chương trình: Thời gian (phút) 17 27 % MeOH 80 80 95 3.4 ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM (ĐỐI CHIẾU VỚI KẾT QUẢ KIỂM CHỨNG CỦA NHẬT BẢN) Trên sở quy trình thực nghiệm xây dựng được, luận văn phân tích độc tố CTXs mẫu Chình biển thu thập được, đối chiếu với kết phân tích PTN Viện Nghiên cứu Thủy Sản Nhật Bản Kết thu trình bày bảng 3.5 Bảng 3.5 Hàm lượng CTXs mẫu Chình biển phân tích PTN Việt Nam PTN Nhật Bản Mẫu Hàm lượng (ng/mL) Việt Nam C026 0,58 Mẫu Nhật Bản 0,55 Hàm lượng (ng/mL) Việt Nam G026 Nhật Bản 49 C027 0,28 0,22 G027 12,21 10,15 C028 0,36 0,33 G028 20,89 19,98 C029 0,79 0,77 G029 2,54 1,80 C030 0,32 0,29 G030 189,41 80,10 C031 0 G031 5,24 3,12 C032 0 G032 0 C033 0 G033 0 C034 0,95 0,89 G034 0 C035 0 G035 2,94 2,20 C036 0 G036 0,77 C037 0 G037 4,70 3,98 C038 0 G038 0 C039 0 G039 0 Những mẫu có hàm lượng (ng/mL) khơng có peak sắc ký đồ Để đánh giá hai dãy số liệu từ thực nghiệm phân tích CTX-1B mẫu Cá chình Việt Nam Nhật Bản có khác biệt trung bình tổng thể mang ý nghĩa thống kê hay không, tiến hành xử lý thống kê phần mềm Excel với phương pháp thống kê t-test: phương pháp kiểm định giả thuyết khác biệt hai trung bình tổng thể hai tổng thể độc lập số lượng quan sát mẫu nhỏ Trước tiên cần so sánh phương sai hai dãy số liệu Việt Nam Nhật Bản, sử dụng phương pháp kiểm định giả thuyết với giả thuyết H hai dãy số có phuơng sai H hai dãy số có phương sai khơng Kết kiểm định chức F-test two samples for variances (bảng 3.6, 3.7) phần mềm Excel cho thấy: - 50 Bảng 3.6 Kết so sánh phương sai mẫu phân tích PTN Việt Nam PTN Nhật Bản Trung bình Phương sai Cỡ mẫu Df F P(F