Bài viết trình bày việc xây dựng và thẩm định quy trình phân tích đồng phân quang học của atenolol bằng phương pháp sắc ký lỏng (HPLC).
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 PHÂN TÍCH ĐỒNG PHÂN QUANG HỌC CỦA ATENOLOL TRONG VIÊN NÉN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG (HPLC) Lê Thị Thu Cúc*, Thái Hồng Hạnh*, Lê Khánh Trúc Diễm*, Trần Mỹ Thiên Thanh* TÓM TẮT Mục tiêu: Xây dựng thẩm định quy trình phân tích đồng phân quang học atenolol phương pháp sắc ký lỏng (HPLC) Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu đồng phân (S)-atenolol Trong trình thực nghiệm, yếu tố ảnh hưởng đến trình phân tách đồng phân cột sắc ký, thành phần tỉ lệ dung môi khảo sát nhằm chọn điều kiện phân tích thích hợp Sau tìm điều kiện sắc ký thích hợp, tiến hành thẩm định quy trình phân tích bao gồm khảo sát tính phù hợp hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, giới hạn phát hiện, độ xác độ Kết quả: Xây dựng thẩm định quy trình phân tích đồng phân quang học atenolol, với điều kiện sắc ký sau: cột sắc ký Lux Cellulose-1, pha động hệ dung môi n-hexan-ethanol-diethylamin (80:20:0,1; tt/tt/tt), detector UV bước sóng 220 nm Độ phân giải hai đồng phân lớn 3,0, Khoảng tuyến tính 25 – 1000 μg /ml Phương pháp độ xác độ lặp cao với RSD < 2% độ phục hồi từ 98 – 102% Kết luận: Bằng phương pháp HPLC, xây dựng thẩm định quy trình phân tích đồng phân quang học atenolol Phương pháp ứng dụng để kiểm tra chế phẩm chứa đồng phân quang học atenolol thị trường Từ khóa: đồng phân atenolol, (S)-atenolol, Lux Cellulose-1 ABSTRACT ENANTIOMERIC SEPARATION OF ATENOLOL IN TABLETS BY HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY METHOD Le Thi Thu Cuc,Thai Hong Hanh, Lê Khanh Truc Diem, Tran My Thien Thanh * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement Vol 22 - No 3- 2018: 400- 405 Objective: This paper describes validated direct liquid chromatographic chiral methods for enantiomeric separation and quantitative determination of atenolol Methods: The subject of this study is (S)-atenolol The aims of our study are: research of chromatographic conditions (column, mobile phase, ….) to separate the two isomers of atenolol The validation of an analytical method is the process by which it is established that the performance characteristics of the method, such as Precision, Accuracy, Specificity, Linearity, Limit of Detection (LOD), meet the requirements for the intended applications Results: A high performance liquid chromatographic (HPLC) method was developed for the chiral separation of atenolol The two enantiomers were separated on a Lux Cellulose-1 column The mobile phase was n-hexaneethanol-diethylamine (80:20:0.1; v/v/v), UV detection was at 220 nm The resolution of the enantiomers was more than 3.0, The range of quantification for both enantiomers was 25-1000 μg.mL-1, Relative standard deviation of the method was below 2% (n=6), the recovery range was 98-102% * Viện Kiểm nghiệm thuốc TP Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: TS.DS Lê Thị Thu Cúc, ĐT: 0909337330, Email: thucuc_vkn@yahoo.com.vn 400 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2018 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học Conclusion A high performance liquid chromatographic (HPLC) procedure for separation of the atenolol enantiomers was established and validated The method showed applicable to quantitative determination of atenolol enantiomers in pharmaceutical preparations Keywords: Atenolol enantiomers, (S)-atenolol, Lux Cellulose-1 ĐẶT VẤN ĐỀ Trang thiết bị Các đồng phân đối quang khác tính chất dược động học, dược lý học hay độc tính Khơng trường hợp đối quang có hoạt tính đối quang lại gây độc cho thể Trong hướng dẫn FDA (Mỹ), MHW (Nhật) hay EMEA (châu Âu) nhấn mạnh việc tách riêng đối quang đánh giá đóng góp đối quang tới tác dụng thuốc Điều cho thấy việc tách đồng phân quang học trở thành xu hướng, thực tế, vấn đề quan tâm nghiên cứu hàng đầu lĩnh vực kiểm nghiệm dược phẩm (1,2,5) Máy sắc ký lỏng hiệu cao SHIMADZU UFLC 20A, Detector Diod Array SPD-20AD Atenolol chất thuộc nhóm chẹn beta, cấu trúc atenolol có carbon bất đối nên chúng có hai đồng phân đối quang Hai đối quang atenolol (S)-atenolol (R)atenolol, có dạng (S) dạng có hoạt tính Mặt khác, diện dạng (R) gây tác dụng phụ Các biệt dược atenolol thị trường phần lớn dạng racemic Tuy nhiên, dạng đồng phân (S) có hoạt tính mạnh dạng racemic, nên xuất chế phẩm dạng đồng phân riêng lẻ thị trường Tiếp theo công trình nghiên cứu lĩnh vực tách đồng phân quang học, báo này, giới thiệu kết phân tích đồng phân quang học (S)-atenolol phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Đối tượng nghiên cứu Viên nén atenolol STADA (atenolol 50 mg) Viên nén (S)-atenolol 25 mg (Nhà sản xuất: Emcure pharm Ltd India) Trang thiết bị, hóa chất, dung mơi Cột Lux Cellulose-1 (cellulose tris(3,5dimethylphenyl carbamat) (250 x 4,6 mm; μm) Cột Lux Cellulose-2 (cellulose tris(3-cloro-4methylphenyl carbamat) (250 x 4,6mm; μm) Cột Lux Amylose-2 (amylose tris(5-cloro-2methylphenyl carbamat) (250 x 4,6mm; μm) Cân phân tích điện tử Mettler Toledo AT200, bể siêu âm Hwashin, bình định mức, pipet xác, ống đong, cốc có mỏ, Các thiết bị phân tích dụng cụ phân tích hiệu chuẩn đạt quy định theo GLP ISO/IEC 17025 Hóa chất, dung môi n-Hexan, 2-propanol (IPA), ethanol (EtOH), diethylamin (DEA): dùng cho HPLC (J.T.Baker) Chất chuẩn Atenolol: Viện Kiểm nghiệm thuốc TPHCM, số lô QT163 010515, hàm lượng 98,47% (S)-Atenolol: Sigma-Aldrich, số lô 330892, hàm lượng 99,0% Phương pháp nghiên cứu Thay đổi thành phần tỉ lệ pha động, nhằm chọn điều kiện phân tích đáp ứng yêu cầu với thông số: hai pic đồng phân phải tách hoàn toàn với độ phân giải Rs > 1,5; đáp ứng đầu dò cao, hệ số bất đối As pic nằm khoảng 0,8 - 1,5, Sau tìm điều kiện phân tích thích hợp, tiến hành thẩm định quy trình phân tích bao gồm: khảo sát tính phù hợp hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, giới hạn phát hiện, độ xác độ đúng(4) Chuẩn bị mẫu Dung dịch mẫu chuẩn atenolol (500 μg/ml): Cân xác khoảng 25 mg atenolol chuẩn, cho vào Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2018 401 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học bình định mức 50 ml, thêm khoảng 35 ml methanol, siêu âm phút, lắc đều, để nguội, thêm methanol đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc PTFE 0,45 μm Dung dịch mẫu chuẩn (S)-atenolol (250 μg/ml): Cân xác khoảng mg (S)-atenolol chuẩn, cho vào bình định mức 20 ml, thêm khoảng 10 ml methanol, siêu âm phút, lắc đều, để nguội, thêm methanol đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc PTFE 0,45 μm Dung dịch mẫu thử (S)-atenolol: Cân 20 viên (S)-atenolol, xác định khối lượng trung bình viên Nghiền 20 viên thành bột mịn, cân lượng bột viên tương ứng với khoảng 25 mg (S)atenolol, cho vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 50 ml methanol, siêu âm phút, lắc đều, để nguội, thêm methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc PTFE 0,45 μm Dung dịch mẫu thử atenolol: Cân 20 viên atenolol, xác định khối lượng trung bình viên Nghiền 20 viên thành bột mịn, cân lượng bột viên tương ứng với khoảng 50 mg atenolol, cho vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 50 ml methanol, siêu âm phút, lắc đều, để nguội, thêm methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc PTFE 0,45 μm Dung dịch mẫu placebo: chuẩn bị dung dịch mẫu thử thay lượng bột thuốc lượng tá dược tương ứng mẫu thử (viên nén atenolol) Dung dịch mẫu trắng: Dung môi hòa tan mẫu methanol KẾT QUẢ Khảo sát điều kiện sắc ký Bảng Các điều kiện sắc ký khảo sát (3) Điều kiện Điều kiện Điều kiện Điều kiện Điều kiện Pha động n-hexan-EtOH (80:20) n-hexan-EtOH (80:20) n-hexan-EtOH (80:20) n-hexan-EtOH-DEA (80:20:0,1) n-hexan- EtOH-DEA (80:20:0,1) Cột sắc ký Cột Lux Amylose-2 Cột Lux Cellulose-2 Cột Lux Cellulose-1 Cột Lux Cellulose-2 Cột Lux Cellulose-1 Nhận xét: Điều kiện 1, 2, 4: không phân biệt dạng đồng phân Điều kiện 5: hai pic đồng phân tách hoàn toàn với RS = 3,89 (pic có thời gian lưu 9,92 phút pic có thời gian lưu 12,80 phút).Như vậy, điều kiện thích hợp để phân tách đồng phân quang học atenolol là: Cột sắc ký Lux Cellulose-1 (250 x 4,6 mm; μm) Pha động n-hexan-EtOHDEA (80:20:0,1) Tốc độ dòng: ml/phút Nhiệt độ cột: 30 oC Thể tích tiêm mẫu: 20 μl Bước sóng phát hiện: 220 nm (Hình 1) Thẩm định phương pháp Khảo sát tính phù hợp hệ thống Bảng Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống phương pháp (n=6) Chuẩn (S)-atenolol Chuẩn atenolol % %RS % Rt %RSD RSD Rt D RSD As Rs As (phút) (Rt) (phút) (S) (Rt) (S) Pic 9,922 0,09 0,13 1,2 3,9 12,74 0,14 0,39 1,5 12,80 0,07 0,10 Pic 1,3 Kết thống kê cho thấy, sau lần sắc ký thông số thời gian lưu (Rt) diện tích pic (S) pic đồng phân có RSD < 2%; giá trị độ phân giải (RS) lớn 1,5 hệ số đối xứng (AS) nằm khoảng 0,8 - 1,8, Vậy phương pháp đạt tính phù hợp hệ thống Tính đặc hiệu Tiến hành sắc ký mẫu trắng, mẫu đối chiếu mẫu thử Kết cho thấy mẫu trắng pic trùng với pic chất phân tích Thời gian lưu pic mẫu thử tương ứng với thời gian lưu pic mẫu chuẩn (S)-atenolol Khi thêm chuẩn (S)-atenolol vào mẫu chuẩn atenolol diện tích pic (S)-atenolol (pic có thời gian lưu khoảng 12,8 phút) tăng cao so với ban đầu Phổ tử ngoại thời gian di chuyển pic mẫu thử giống phổ tử ngoại mẫu chuẩn Độ tinh khiết pic lớn 99% Hai pic hai dạng đồng phân có phổ UV giống Vậy phương pháp có tính đặc hiệu 402 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2018 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học Điều kiện (mẫu chuẩn atenolol) Điều kiện (mẫu chuẩn atenolol) Điều kiện (mẫu chuẩn atenolol) Điều kiện (mẫu chuẩn atenolol) mẫu chuẩn atenolol mẫu chuẩn (S)-atenolol Điều kiện Hình Các sắc ký đồ khảo sát điều kiện sắc ký Hình Sắc ký đồ atenolol (mẫu chuẩn atenolol) Hình Sắc ký đồ chuẩn atenolol + chuẩn (S)atenolol Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2018 403 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Hình Sắc ký đồ (S)-atenolol (mẫu chuẩn) Hình Sắc ký đồ (S)-atenolol (mẫu thử) Hình Sắc ký đồ mẫu trắng(Placebo) Khoảng tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại giới hạn phát Bảng Phương trình hồi quy, khoảng tuyến tính, giới hạn phát Phương trình hồi qui Khoảng tuyến tính Giới hạn phát Mẫu chuẩn atenolol (R)-atenolol (S)-atenolol y = 36254 x y = 6340 x r = 0,9999 r = 0,9999 25 - 1000 µg/ml Mẫu chuẩn (S)-atenolol y = 36363 x r = 0,9999 0,1 µg/ml 0,1 µg/ml 0,1 µg/ml Nhận xét: kết thống kê cho thấy quy trình phân tích có khoảng tuyến tính rộng với hệ số tương quan cao Độ lặp lại, độ xác trung gian độ Bảng Kết khảo sát độ lặp lại độ xác trung gian Số lần TB Hàm lượng nhãn (mg) 50 RSD (%) (n = 6) RSD (%) (n = 12) Ngày Diện tích (S)-atenolol 8520666 8510447 8507666 8529722 8524258 8522024 Hàm lượng (%) 97,98 97,93 98,10 97,71 98,12 98,05 97,98 0,15 Ngày Diện tích Hàm lượng (%) (S)-atenolol 8546438 98,21 8524867 98,94 8526652 98,04 8557384 97,99 8630053 97,58 8567671 97,37 98,02 0,56 0,39 404 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2018 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học Bảng Kết khảo sát độ Tỷ lệ chất Lượng (S)-atenolol Lượng (S)-atenolol chuẩn thêm vào có sẵn (µg/ml) thêm vào (µg/ml) (%) 80 122,54 98,21 122,53 98,21 122,51 98,21 100 122,75 122,76 122,37 122,76 122,61 122,76 120 122,57 147,32 122,42 147,32 122,51 147,32 Trung bình RSD% Nhận xét: Phương pháp phân tích đạt độ với tỷ lệ phục hồi nằm khoảng cho phép 98%-102% BÀNLUẬN Với sắc ký pha thuận sử dụng pha tĩnh bất đối, dung môi không phân cực n-hexan chứa alcol ethanol hay IPA thường sử dụng Vai trò alcol cạnh tranh với atenolol để gắn với pha tĩnh bất đối nhờ khả tạo liên kết hydro Để tách chất có nhóm acid, lượng nhỏ acid DEA thêm vào pha động để làm giảm thời gian lưu, tăng độ phân giải giảm hệ số kéo Ngồi ra, có mặt DEA tăng khả tách đối quang có tác dụng ngăn kết hợp đối quang KẾT LUẬN Bằng phương pháp HPLC sử dụng pha tĩnh bất đối, tiến hành xây dựng thẩm định quy trình phân tích đồng phân quang học (S)-atenolol, với điều kiện sau: cột sắc ký Lux Cellulose-1, chiều dài 250 mm, đường Diện tích pic Lượng tìm lại ( µg/ml) Tỷ lệ phục hồi (%) 8073610 8068921 8100476 9016724 8937105 9007193 9860928 9875210 9879384 98,13 98,01 98,89 123,70 121,90 123,58 146,95 147,49 147,52 99,92 99,80 100,70 100,76 99,30 100,67 99,75 100,12 100,13 99,31 0,43 kính 4,6 mm, kích thước hạt μm Pha động hệ dung mơi n-hexan-EtOH-DEA (80:20:0,1, v/v/v), tốc độ dòng ml/phút, nhiệt độ 30 oC, thể tích tiêm mẫu 20 μl, bước sóng phát 220 nm Quy trình có tính đặc hiệu, độ xác độ lặp cao TÀI LIỆU THAM KHẢO Alberto C., Luisa P., Alessandro M., Nicola M., Francesco D (2011), “Recent applications in chiral high performance liquid chromatography: A review”, Analytica Chimica Acta, 706, pp.205222, Caner H., Groner E., Levy L., Agranat I (2004), “Trends in the development of chiral drugs”, Drug Discov Today, 9(3), 105, Dongmei W., Fang L., Zhen J., Li Y., and Xingjie G.o (2014),” Chiral Recognition Mechanisms of four β-Blockers by HPLC with Amylose Chiral Stationary Phase”, Iran J Pharm Res, 13(2), pp.449-45, ICH Harmonised tripartite guideline (2005), Validation of analytical procedures: text and methodology, pp.1-13, Landoni MF, Soraci A (2001), “Pharmacology of Chiral Compounds: 2-Arylpropionic Acid Derivatives”, Current Drug Metabolism, 2, 37-51, Ngày nhận báo: 03/02/2018 Ngày phản biện nhận xét báo: 02/03/2018 Ngày báo đăng: 20/04/2018 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2018 405 ... tách đồng phân quang học, báo này, giới thiệu kết phân tích đồng phân quang học (S) -atenolol phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Đối tượng nghiên cứu Viên nén atenolol. .. Hình Các sắc ký đồ khảo sát điều kiện sắc ký Hình Sắc ký đồ atenolol (mẫu chuẩn atenolol) Hình Sắc ký đồ chuẩn atenolol + chuẩn (S )atenolol Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm... khả tách đối quang có tác dụng ngăn kết hợp đối quang KẾT LUẬN Bằng phương pháp HPLC sử dụng pha tĩnh bất đối, tiến hành xây dựng thẩm định quy trình phân tích đồng phân quang học (S) -atenolol,