Tiêu chuẩn ngành 10 TCN 730-2006

Tiêu chuẩn ngành 10 TCN 730-2006 về thịt và các sản phẩm của thịt- Phát hiện Campylobacter để phát hiện và xác định tổng số Campylobacter trong thịt và sản phẩm của thịt.

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN 10TCN                           TIÊU CHUẨN NGÀNH 10 TCN 730­2006 THỊT VÀ CÁC SẢN PHẨM CỦA THỊT­PHÁT HIỆN  CAMPYLOBACTER                                                                                                                          10 TCN 730­2006 Hà Nội  ­ 2006 TIÊU CHUẨN NGÀNH                                                                               10 TCN 730­2006 THỊT VÀ CÁC SẢN PHẨM CỦA THỊT­PHÁT HIỆN CAMPYLOBACTER (Meat and meat products ­ Detection  of  Campylobacter) (Ban hành kèm theo Quyết định số              QĐ/BNN­KHCN ngày        tháng  6  năm 2006 của Bộ trưởng Bộ Nơng nghiệp và Phát triển nơng thơn)   1. Phạm vi áp dụng Qui trình này để phát hiện và xác định tổng số  Campylobacter trong thịt và sản phẩm  của thịt 2. Định nghĩa Campylobacter  là những phảy khuẩn nhỏ, gram   âm. Tất cả  các lồi đều di chuyển   được nhờ các roi ở một hoặc hai đầu. Các lồi Campylobacter khơng hình thành nha bào và  phản ứng oxidase dương tính. Chúng phát triển mạnh trong điều kiện mơi trường có 3­15%  O2 và 3­5% CO2.  3. Thiết bị, dụng cụ thuỷ tinh và giống vi khuẩn 3.1. Thiết bị và dụng cụ thuỷ tinh 3.1.1. Tủ lạnh 3.1.2 Tủ sấy 3.1.3. Tủ ấm 3.1.4. Máy đồng nhất mẫu (Stomacher) 3.1.5. Máy trộn tốc độ cao (Vortex) 3.1.6. Nồi hấp cách thuỷ  3.1.7. Nồi hấp áp lực 3.1.8. Máy đo pH 3.1.9. Kính hiển vi 3.1.10. Bình yếm khí 3.1.11. Que cấy vòng (đường kính 3­4mm) và kim cấy 3.1.12. Đèn cồn                                                                                                                          10 TCN 730­2006 3.1.13. Dụng cụ thuỷ tinh Bình thuỷ tinh 1000ml, 500ml và 200ml Ống đong Pipet các loại  25ml, 10ml, 5ml và 1ml, được chia vạch 0,5ml và 0,1ml Ống nghiệm 13x100mm và 16x125mm Đĩa petri tiệt trùng  Phiến kính soi tiêu bản 3.1.14. Túi khí điều chỉnh mơi trường có 5%O2, 10% CO2 và 85%N2  3.2. Giống vi khuẩn Chủng chuẩn Campylobacter jejuni được sử dụng là chứng dương 4. Mơi trường ni cấy và thuốc thử (xem phần phụ lục) 4.1.  Nước peptone 0,1% 4.2. Canh thang  tăng sinh Campylobacter (Preston Enrichment Broth) 4.3. Thạch phân lập Campylobacter (Campylobater Blood­Free selective Agar) 4.4. Mơi trường bán cố thể Brucella (Semi­Solid Brucella Medium)  4.5. Tryptic soy agar 4.6. Thuốc nhuộm gram 4.7. Thuốc thử kiểm tra sự thuỷ phân hippurate 4.8. Thuốc thử của phản ứng oxidase 4.9. Khoanh giấy axit nalidixic và cephalothin  5. Lấy mẫu Theo  TCVN 4833 ­ 2002 6. Cách tiến hành Tiến hành nuôi cấy  chủng chuẩn  Campylobacter jejuni  tuần tự  theo qui trình  ni cấy mẫu để kiểm tra chất lượng mơi trường và phương pháp 6.1. Tăng sinh ­ Rửa hoặc làm đồng nhất những mẫu lớn (0,5­1kg) với 100 ml dung dịch nước   pepton 0,1% (4.1) ­ Lắc nhẹ dung dịch canh thang tăng sinh Preston (4.2) để máu tan đều trước khi  cấy  mẫu.  Hút 0,5ml dung dịch mẫu đã được đồng nhất vào bình chứa 500ml canh thang tăng   sinh Preston (4.2). Vặn chặt nút của bình canh thang, đặt   42 10C trong 48 giờ  với điều  kiện có khơng khí 6.2. Ni cấy phân lập                                                                                                                          10 TCN 730­2006 ­ Lấy đầy một vòng que cấy (10 l) canh thang đã được tăng sinh cấy vào đĩa thạch  phân lập Campylobacter (4.3). Đặt các đĩa này vào bình yếm khí, sau đó cắt các túi khí điều  chỉnh mơi trường (3.1.14), để    42 10C trong 48 giờ.  Nhỏ  1 giọt glycerol vào giấy lọc,  đặt tấm giấy này   đáy bình yếm khí nhằm hấp thụ  bớt độ  ẩm và hạn chế  sự  phát triển   tràn lan của vi khuẩn.   ­ Tất cả  những khuẩn lạc  ướt, phẳng, xám trắng được giả  định là  Campylobacter  jejuni. Một vài lồi Campylobacter có khuẩn lạc màu hơi xanh, mặt hơi khơ, có hoặc khơng   có ánh kim ­ Từ các đĩa thạch phân lập, chọn 2 khuẩn lạc điển hình để kiểm tra các đặc tính sinh   hố.  Các thử nghiệm sinh hố được miêu tả ở phần khẳng định 6.3. Ni cấy Campylobacter trên mơi trường thạch bán cố thể Dùng kim cấy chuyển 1 khuẩn lạc riêng rẽ  cấy trích sâu vào mơi trường bán cố  thể  Brucella (4.4). Ni cấy trong điều kiện hiếu khí. Vi khuẩn sẽ  mọc thành dải dưới mặt   thạch trong ống nghiệm. Có thể giữ giống trong vòng 1 tháng trong bóng tối dưới nhiệt độ  phòng Nếu muốn đơng khơ giống thì phải ni cấy Campylobacter trong thạch máu 2­3 ngày  trong điều kiện  5%O2, 10%CO2, 85%N2 6.4. Khẳng định vi khuẩn 6.4.1. Đánh giá vi khuẩn học Lấy một vài khuẩn lạc  Campylobacter  từ  môi trường bán cố  thể  Brucella (4.4) cấy   vào đĩa thạch Tryptic soy   (4.5). Mỗi khuẩn lạc cấy vào 1 đĩa.   Đặt các đĩa thạch này  ở  nhiệt độ 42 10C trong điều kiện  5% O2, 10% CO2, 85% N2.  * Nhuộm gram Lấy 1 khuẩn lạc điển hình từ mơi trường (4.5) để nhuộm gram. Q trình nhuộm tiến  hành trong vòng 3­4 phút, rồi đọc kết quả. Vi khuẩn  Campylobacter  bắt mầu đỏ nên là vi  khuẩn gram âm 6.4.2 Khẳng định bằng các phản ứng sinh hố * Kiểm tra đặc tính di động Miết một khuẩn lạc Campylobacter lên lam kính đã được làm ướt bằng nước peptone  0,1%. Soi kính để kiểm tra khả năng di động của vi khuẩn này *  Kiểm tra sự thuỷ phân hippurate Chuyển 1 khuẩn lạc  Campylobacter  vào  ống nghiệm chứa 2ml nước cất vơ trùng  thêm vào đó 0,5ml dung dịch hippurate 5% (4.7.2). Ni cấy ở 370C trong 2 giờ. Thêm 1  ml dung dịch ninhydrin (4.7.1) vào canh trùng đang được ni cấy.  Khơng được lắc canh  trùng sau khi đã cho dung dịch ninhydrin. Ni tiếp canh trùng   nhiệt độ  phòng trong 30                                                                                                                            10 TCN 730­2006 phút. Phản ứng dương tính sẽ làm cho mơi trường chuyển màu tím đen do có sự thuỷ phân   hippurate thành glycine * Kiểm tra tính nhạy cảm với axit nalidixic và cephalothin Chuyển 1 khuẩn lạc riêng rẽ  vào 1­2 ml dung dịch peptone 0,1% (4.1), lắc để  tạo  thành hỗn dịch đồng nhất Hai phép thử kiểm tra tính nhạy cảm với axit nalidixic và cephalothin được thực hiện  kép trên một đĩa thạch tryptic soy (4.5). Sử dụng dao vơ trùng cắt bỏ một dải thạch ở giữa   đĩa để tạo thành 2 phần riêng biệt. Sau đó nhỏ vơ trùng 50 l canh khuẩn lên từng nửa đĩa,  láng  đều  vi khuẩn trên một  nửa đĩa bằng que láng, đốt que láng tiệt trùng và tiếp tục  láng   nửa   đĩa   thạch     lại   Đặt   khoanh   giấy   axit   nalidixic   (30 g)     khoanh   giấy  cephalothin (30 g) cách đều nhau vào một nửa đĩa thạch. Nửa còn lại cũng được làm tương  tự Đặt các đĩa thạch này vào tủ   ấm   420C trong khoảng 24­48 giờ. Sau thời gian ni  cấy kiểm tra sự phát triển của vi khuẩn trên đĩa thạch để khẳng định tính nhạy cảm của vi   khuẩn với 2 loại hoạt chất trên Tính nhạy cảm với axit nalidixic, cephalothin và khả  năng thuỷ  phân hippurate của  một số chủng Campylobacter như sau: C. jejuni C.coli Khả năng thuỷ phân hippurate + ­ Tính nhạy cảm với axit nalidixic  Nhạy cảm Nhạy cảm Tính nhạy cảm với cephalothin Kháng lại Kháng lại Nhận dạng khuẩn lạc ướt, phẳng, xám  ướt, xám kem,  trắng, mọc lan tràn  mọc riêng rẽ C.laridis ­ Kháng lại Kháng lại xám trắng,  mọc riêng  rẽ *  Phản ứng oxidase Sau khi nhỏ thuốc thử oxidase, đọc kết quả trong vòng 1 phút. Campylobacter có phản  ứng dương tính, khuẩn lạc biến đổi sang mầu hồng và chuyển dần sang mầu tím. Chỉ  sử  dụng các khuẩn lạc lấy ở mơi trường mới ni cấy để kiểm tra men này.   6.5. Các tiêu chuẩn khẳng định Campylobacter Nhuộm gram Đặc tính di động Phản ứng oxidase Phản ứng kiểm tra sự thuỷ phân hippurate Phản ứng thử tính mẫn cảm với kháng sinh 7. Biểu thị kết quả  gram âm, hình que dương tính dương tính dương tính tuỳ từng chủng Campylobacter                                                                                                                          10 TCN 730­2006 Báo cáo sự  có mặt hay khơng của  Campylobacter  trong một đơn vị  mẫu, một gram  hoặc một đơn vị diện tích mẫu 8. Tài liệu tham khảo 8.1. FAO 1992, 14/4 Rev.1 8.2. Microbiologycal method for meat industry 1991 New Zealand 8.3. TCVN 6404: 1998 (ISO 7218: 1997) Vi sinh vật học ­ Nguyên tắc chung về kiểm tra   vi sinh vật 8.4. TCVN 4833: 2002­ Lấy mẫu thịt         KT. BỘ TRƯỞNG           THỨ TRƯỞNG                                                                                                                          10 TCN 730­2006 Phụ lục 4. Môi trường nuôi cấy và thuốc thử 4.1. Nước peptone 0,1% Thành phần: Peptone NaCl Nước cất  1,0g 8,5g 1000ml Cách pha chế:   Đun nhẹ để hồ tan các thành phần. Đổ hỗn dịch vào các ống, các bình tam giác thích  hợp và hấp ướt 1210C trong 15 phút. Chỉnh pH cuối cùng là 7,0 4.2. Canh thang  tăng sinh Campylobacter (Preston Enrichment Broth) 4.2.1. Mơi trường cơ bản Thành phần: Bột Lab­Lemco   10,0g Peptone   10,0g NaCl    5,0g Chiết xuất nấm men     6,0g Nước cất                                     950ml  Cách pha chế:   Hồ trộn và đun sơi để hồ tan các thành phần, đóng mơi trường vào các bình tam giác  thích hợp. Hấp ướt ở 1210C trong 15 phút. Chỉnh pH là 7,5  0,2 4.2.2.  Mơi trường bổ sung FBP đặc Thành phần: Ferrous sulfate                                       6,25g Sodium  metabisulfite                           6,25g Sodium pyruvate   6,25g Cách pha chế: Hồ trộn các thành phần trong bình tam giác bằng 100ml nước cất vơ trùng. Lọc qua  màng lọc 0,45  m. Chia 20ml mơi trường trong các  ống   polypropylene và bảo quản   – 200C trong 2 tháng.  Có thể đơng lạnh một lần nữa sau khi giải đơng. Tránh ánh sáng 4.2. 3. FBP lỗng                                                                                                                             10 TCN 730­2006 Thành phần: Ferrous sulfate                                        0,125g Sodium metabisulfite                             0,125g Sodium pyruvate  0,125g  Cách pha chế:         Hồ tan các thành phần bằng 5ml nước cất vơ trùng. Lọc qua màng lọc 0,45 m, chia  mơi trường vào các ống 0,5ml. Bảo quản mơi trường ở –200C trong 2 tháng 4.2.4.  Mơi trường bổ sung  (Máu cừu hoặc máu ngựa đã được loại tơ huyết) Rót     lắc   nhẹ   khoảng   100ml   máu   tươi       loại   tơ   huyết   vào     chai   polypropylene   vô   trùng   Bảo   quản     tủ   lạnh   để   tránh     hấp   thu   oxygen     Hemoglobin. Sau khi máu đơng lạnh có thể giải đơng, rồi đơng lạnh lại. Mơi trường này  sử  dụng được trong 6 tháng, có thể giải đơng và đơng lạnh lại nhiều lần 4.2.5.  Cơng thức bổ sung kháng sinh số1 Thành phần: Sodium cefoperazone  30,0mg Trimethoprim lactate  12,5mg Vancomycin                                           10,0mg Cycloheximide                                       100,0mg Cách pha chế: Hoà   tan   0,75g   sodium   cefoperazone     100ml   nước   cất     lọc   qua   màng   lọc  0,45 m. Dung dịch có thể bảo quản ở 40C trong 5 ngày hoặc ở –200C  trong 3 tuần hoặc ở  –700C   trong 5 tháng. Dạng bột bảo quản   –20 0C (bảo quản trong lọ  hay bình bằng  polypropylene) Hồ tan 0,3125g trimethoprim lactate trong 100ml nước cất. Lọc qua màng lọc 0,45  m. Bảo quản dung dịch ở 40C  trong 1 năm   Hồ tan 0,25g vancomycin trong 100ml nước cất. Lọc qua màng lọc 0,45   m. Bảo  quản ở 40C trong 4 tháng   Hồ tan 2,5g cycloheximide bằng 20­30ml ethanol 70%. Bù thêm nước cất cho đủ thể  tích là100ml. Lọc qua màng lọc 0,45 m. Bảo quản ở 40C trong 1 năm. Khơng được để đơng  lạnh 4.2.6. Công thức bổ sung kháng sinh số 2 Thành phần: Sodium cefoperazone                           15,0mg Trimethoprim lactate                            12,5mg                                                                                                                          10 TCN 730­2006 Vancomycin                                 Cycloheximide 10,0mg 100,0mg  Cách pha chế: Hồ tan 0,375g sodium cefoperrazone trong 100ml nước cất. Lọc qua màng lọc 0,45  m.    Trimethoprim lactate, vancomycin, cycloheximide, được chuẩn bị như trong cơng thức  bổ sung kháng sinh số 1  4.2.7. Cơng thức bổ sung kháng sinh số 3     Thành phần:                                   Rifampicin  10,0mg Sodium cefoperazone                   15,0mg Trimethoprim lactate 12,5mg Cycloheximide 100mg  Cách pha chế: Hồ tan 0,25g rifamicin trong 50ml ethanol 70% trong bình  tam giác và bù thêm nước  cất tới vạch 100ml. Lọc qua màng lọc 0,45 m.   Dung   dịch này và dạng bột có thể  bảo  quản ở –200C trong 1 năm Dung dịch sodium cefoperazone, trimethoprim lactate, cycloheximide  được chuẩn bị  như trong cơng thức bổ sung kháng sinh số 2 4.2.8. Mơi trường hồn chỉnh: Thành phần: Canh thang tăng sinh Camlylobacter cơ  bản                                               950,0ml FBP đặc  4,0ml Máu cừu hoặc ngựa (đã được loại bỏ  tơ huyết) 50,0ml Các dung dịch kháng sinh riêng rẽ 4,0ml  Cách pha chế: Hồ trộn các thành phần vào bình chứa Chú ý: Sodium cefoperazone ở nồng độ 30mg/lít trong mơi trường canh thang làm giầu có thể  ngăn chặn các vi khuẩn họ Campylobacter. Thêm 2,0ml dung dịch sodium cefoperazone vào  mơi trường làm giầu ban đầu. Thêm 2,0ml dung dịch Sodium cefoperazone sau khi ni cấy   4 giờ trong mơi trường trước khi làm giầu (đối với mẫu đã được đơng lạnh khơng q 10   ngày) hoặc sau khi nuôi cấy 3 giờ (đối với mẫu được bảo quản trên 10 ngày) hoặc đã được  xử lý bằnh nhiệt hoặc đông lạnh.                                                                                                                                                                                                      10 TCN 730­2006 4.3. Thạch phân lập Campylobacter  (Campylobater Blood­Free selective Agar) Thành phần:  Canh thang dinh dưỡng N02                      Charcoal, bacteriological grade  Caseinhydrolysate                                      Sodium deoxycholate                                 Ferrous sulfate                                            Sodium pyruvate  Thạch  Nước cất  25,0g 4,0g 3,0g 1,0g 0,25g 0,25g 12,0g 1000ml Cách pha chế:   Hồ trộn các thành phần vào bình chứa. Đun nóng và lắc mạnh để  hồ tan thạch   Chỉnh pH sao cho mơi trường hồn chỉnh có pH là 7,4   0,2. Hấp ướt 1210C trong 15 phút.  Sau khi hấp ướt, trước khi rót thạch vào đĩa, thêm 100 ml nước cất vơ trùng và 4,4ml dung   dịch sodium cefoperazone và 4,4ml dung dịch cycloheximide theo cơng thức: Sodium cefoperazone                     30,0mg  Cycloheximide 100,0mg Cách pha: Hồ tan 0,75g sodium cefoperazone bằng 100ml nước cất. Lọc qua màng lọc 0.45 m Hồ tan 2,5g cycloheximide trong 20­30ml ethanol 70% trong bình tam giác. Bù thêm  nước cất tới vạch 100ml. Lọc qua màng lọc 0,45 m.  4.4. Mơi trường bán cố thể Brucella (Semi­Solid Brucella Medium)  Thành phần: Tryptone  hoặc trypticase  Thiotone hoặc peptamine                        Dextrose                                                   Autolysate nấm men                                NaCl                                                         10 10,0g 10,0g 1,0g  2,0g 5,0g                                                                                                                          10 TCN 730­2006 NaHSO3                                                    Đỏ trung tính  Thạch                    Nước cất  0,1g  0,2mg  0,02 g 1000ml Cách pha chế:   Đun nóng và lắc mạnh để hồ tan thạch, đun sơi 1 phút. Hấp ướt 1210C trong 15 phút.  Điều  chỉnh để  pH cuối cùng là 7,0   0,2. Bảo quản mơi trường   2­80C, dùng trong 6­8  tuần 4.5. Tryptic soy agar Thành phần: Trypticcase peptone Phytone peptone NaCl Thạch  Nước cất  15,0g   5,0g   5,0g 15,0g 1000ml Cách pha chế:   Cho tất cả các thành phần vào 1000ml nước cất. Đun sơi 1 phút để hồ tan hồn tồn   thạch. Chỉnh pH để  mơi trường sau khi hấp tiệt trùng có pH là 7,3  0,2. Đóng thạch vào  các ống hoặc bình tam giác 4.6. Thuốc nhuộm gram 4.6.1. Hucker’s Crystal violet Thành phần: Dung dịch A   2,0g                   Crystal violet  20,0ml                   (90% dye content )                   Ethanol 95%  0,8g Dung dịch B  80ml                   Ammonium oxalate                   Nước cất Cách pha chế: Trộn đều dung dịch A với dung dịch B, lọc bằng giấy lọc, bảo quản trong 24h.  4.6 2. Gram’s Iodine Thành phần: Iodine 1,0g Postasdium iodide (KI)  2,0g Nước cất 300ml Cách pha chế: 11                                                                                                                          10 TCN 730­2006 Đổ  KI vào trong cối thêm iodine và nghiền bằng chầy trong 5­10 phút. Sau đó vừa  nghiền vừa thêm nước. Lần thứ nhất thêm 1ml, lần  thứ 2 thêm 5ml, lần thứ 3 thêm 10ml   Rót dung dịch được nghiền vào chai, rửa chầy cối bằng lượng nước còn lại và đổ vào chai 4.6.3. Hucker’s counterstain  Thành phần: Safranin  2,5g Ethanol 95% 100ml Cách pha chế: Hồ tan 2,5g safranin   vào 100ml ethanol 95%. Sau đó thêm 10ml dung dịch trên vào  90ml nước cất 4.6.4. Carbol fuchsin 0,5% Thành phần: Carbol fuchsin 0,5g Nước cất 100,0ml Cách pha chế:   Hồ tan 0,5g carbol fuchsin với 100ml nước cất vơ trùng 4.7. Thuốc thử kiểm tra sự thuỷ phân hippurate 4.7.1. Thuốc thử ninhydrin Thành phần:  Ninhydrin 3,5g Acetone/butanol (1 : 1) 100,0ml  Cách pha chế:   Hoà tan hoàn toàn ninhydrin trong 100ml dung dịch acetone/butanol (1:1) và bảo quản   trong tủ lạnh 4.7.2. Thuốc thử Sodium hippurate 5% Thành phần: Sodium hippurate 5,0g Nước cất 100ml Cách pha chế:     Hoà tan thuốc trong nước cất và lọc qua màng lọc 0,45 m. Bảo quản trong tủ  lạnh  hoặc chia thành các ống 0,4ml, bảo quản ở –200C 4.8. Thuốc thử cho phản ứng oxidase Thành phần: N,N,N,N,­tetramethyl­ phenylenediamine. 2HCl Nước cất Cách pha chế:   12 1,0g 100ml                                                                                                                          10 TCN 730­2006 Hồ tan 1g N,N,N,N,­tetramethyl­phenylenediamine. 2HCl bằng 100ml nước cất. Dung   dịch chuẩn bị xong bảo quản lạnh (4­100C) trong chai thuỷ tinh mầu, sử dụng được trong  vòng 7 ngày 4.9. Khoanh giấy axit nalidixic (30 g) và cephalothin (30 g) 13 ...                                                                                                                         10 TCN 730­2006 Hà Nội  ­ 2006 TIÊU CHUẨN NGÀNH                                                                               10 TCN 730­2006 THỊT VÀ CÁC SẢN PHẨM CỦA THỊT­PHÁT HIỆN...                                                                                                                          10 TCN 730­2006 3.1.13. Dụng cụ thuỷ tinh Bình thuỷ tinh 100 0ml, 500ml và 200ml Ống đong Pipet các loại  25ml, 10ml, 5ml và 1ml, được chia vạch 0,5ml và 0,1ml Ống nghiệm 13x100mm và 16x125mm...                                                                                                                          10 TCN 730­2006 Vancomycin                                 Cycloheximide 10, 0mg 100 ,0mg  Cách pha chế: Hoà tan 0,375g sodium cefoperrazone trong 100 ml nước cất. Lọc qua màng lọc 0,45