Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 6662:2000 - ISO 10260:1992 trình bày nội dung về chất lượng nước - đo thông số sinh hóa - phương pháp đo phổ xác định nồng độ clorophyl-A. Mời các bạn cùng tham khảo.
tcvn tIªu chn vIƯt nam TCVN 6662 : 2000 ISo10260 : 1992 chất lợng nớc đo thông số sinh hoá phơng pháp đo phổ xác định nồng độ clorophyl-a Water quality − Measurement of biochemical parameters − Spectrometric determination of the chlorophyll-a concentration Hµ néi -2000 Lêi nãi đầu TCVN 6662 : 2000 hoàn toàn tơng đơng với ISO 10260 : 1992 TCVN 6662 : 2000 Ban Kỹ thuật Tiêu chuẩn TCVN/TC 147 Chất lợng nớc biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lờng Chất lợng đề nghị, Bộ Khoa học, Công nghệ Môi trờng ban hành TIêu chuẩn vIệt nam tcvn 6662 : 2000 Chất lợng nớc Đo thông số sinh hóa Phơng pháp đo phổ xác định nồng độ clorophyl-a Water quality − Measurement of biochemical parameters − Spectrometric determination of the chlorophyll-a concentration Phạm vi áp dụng 1.1 Tiêu chuẩn qui định phơng pháp xác định nồng độ clorophyl-a Phơng pháp áp dụng cho thực vật phù du nớc mặt tự nhiên để thử tăng trởng tảo thử nghiệm sinh học Dùng cách lấy mẫu thích hợp, phơng pháp áp dụng cho thực vật đáy (phụ lục A) 1.2 Các picment tảo khác nh clorophyl-b , clorophyl-c vài chất chuyển hoá clorophyl không đợc xác định Các picment nâu (phaeopicment) đợc xác định bán định lợng để hiệu chỉnh cản trở xác định clorophyl-a để phần sinh khối tảo không hoạt hóa 1.3 Clorophyl nhạy với ánh sáng oxi, bị chiết Để tránh phân hủy oxi hóa quang hóa, không đợc để mẫu không khí ánh sáng mạnh Đồng mẫu số trờng hợp làm tăng hiệu suất chiết 1.4 Phơng pháp chiết etanol gồm việc ®un nãng 75 o C ®Ó øc chế men clorophylaza để thúc đẩy phân giải picment Bảo quản phần chiết (không lọc) trớc đo phổ thời gian ngắn, đến ba ngày tủ lạnh oC Bảo quản phần chiết dới 25 oC đến ba mơi ngày 1.5 Mặc dầu suốt quy trình có sử dụng lọc ly tâm để làm cho phần chiết cuối nhng bị đục nhẹ Sự axit hóa gây đục Do độ hấp thụ đo 665 nm cần đợc hiệu chỉnh ®é ®ơc b»ng c¸ch trõ ®é hÊp thơ ®o ë 750 nm TCVN 6662 :2000 1.6 Picment cña mét vài khuẩn a sáng (thí dụ Clorobium) cản trở xác định nồng độ clorophyl-a [1] Độ hấp thụ clorophyl-b vµ clorophyl-c ë 665 nm rÊt nhá, cã thĨ bá qua [2] Tiªu chuÈn trÝch dÉn ISO 5667-1:1980, ChÊt lợng nớc Lấy mẫu Phần 1: Hớng dẫn lập chơng trình lấy mẫu TCVN 5992: 1995 (ISO 5667-2:1991), ChÊt l−ỵng n−íc − LÊy mÉu − H−íng dÉn kÜ thuật lấy mẫu Nguyên tắc Lấy tảo chất lơ lửng mẫu nớc lọc Chiết picment tảo từ phần lại trình lọc vào etanol nóng Đo phổ xác định nồng độ clorophyl-a phần chiết Đánh giá nồng độ clorophyl-a picment nâu từ khác độ hấp thụ 665 nm trớc sau axit hóa phần chiết [3] [4] Thc thư ChØ dïng c¸c thc thư tinh khiÕt phân tích nớc loại ion nớc tinh khiết tơng đơng 4.1 Axit clohydric , c(HCl) = mol/l 4.2 Etanol , (C H OH), dung dịch nớc 90 % (V/V) Chú thích Phần bị biến chất etanol không cản trở phép xác định Tuy nhiên, nên xác định so sánh etanol tinh khiết (90 %) làm với lô mẫu [4] Thiết bị, dụng cụ Các thiết bị, dụng cụ thông thờng phòng thí nghiệm và: 5.1 Máy đo phổ , dùng vùng khả kiến đến 750 nm, với độ phân giải nm, chiều rộng dải nhỏ nm, độ nhạy nhỏ 0,001 đơn vị độ hấp thụ, có cuvet nằm khoảng cm đến cm 5.2 Thiết bị lọc chân không , có giá kẹp 5.3 Cái lọc sợi thủy tinh chất hữu cơ, để lọc mẫu nớc giữ lại 99 % hạt lớn m Dải đờng kính lọc thích hợp từ 25 mm đến 50 mm TCVN 6662 :2000 5.4 Cái lọc phần chiết , mô tả nh 5.3 nhng đờng kính nhỏ hơn, thí dụ 25 mm Cách khác: ly tâm, gia tốc 000 g mâm quay phù hợp cho ống nghiệm chiết 5.5 Nồi cách thủy , điều chỉnh ®−ỵc ë 75 o C + o C cã chỗ vừa cho bình chiết 5.6 Bình chiết , thí dụ lọ nhỏ màu nâu, miệng rộng, có nút vặn polytetrafloetylen (PTFE), dung tích từ 30 ml đến 50 ml, thích hợp cho việc ly tâm 6000 g Lấy mẫu bảo quản mẫu Lấy mẫu theo ISO 5667-1 vµ TCVN 5992: 1995 (ISO 5667-2) Cã thể bảo quản mẫu tủ lạnh, không h, nhng nên tránh Nếu có thể, thực 7.1 đến 7.3 sau lấy mẫu Nếu cần, giữ phần chiết thô bình chiết thuỷ tinh màu nâu kÝn khÝ (5.6) ë d−íi − 25 o C th× đợc ba mơi ngày Không giữ lại mẫu nớc đông lạnh lọc có chất rắn Cách tiến hành 7.1 Lọc Lắc để trộn kỹ mẫu Lọc thể tích mẫu V s (thờng khoảng 0,1 đến lit, phụ thuộc vào chiết tảo) qua lọc sợi thủy tinh (5.3) gắn giá Làm khô lọc chân không, vừa khô lấy khỏi giá đỡ đặt vào bình chiết Nếu lọc không vừa bình chiết cắt lọc thành mảnh nhỏ Tránh chạm ngón tay vào mẫu 7.2 Phơng án chiết A Đun nóng thể tích etanol (4.2) ®Õn 75 o C Rãt mét thĨ tÝch nhá etanol nóng (30 ml đến 40 ml) vào bình chứa lọc mảnh Để nguội vài phút, nghiền lọc để dễ chiết, nên dùng máy làm ®ång nhÊt cã khy d¹ng que Rưa que khy etanol (4.2) để loại mảnh vụn bám vào Chiết phần huyền phù Chú thích Việc chiết thờng đợc thực nhiệt độ phòng nhiều qua đêm Nếu chiết kéo dài phần chiết đợc lu giữ nhiều ngày (thí dụ qua cuối tuần) bình chiết cần để tủ lạnh Lọc dung dịch qua lọc dày (5.4) vào bình định mức (dung tích 50 ml 100 ml) có nút Rửa bình chiết etanol (4.2) chuyển định lợng vào bình định mức Định mức đến vạch, đậy kín lắc Đó thể tích phần chiết V e TCVN 6662 :2000 Làm tiếp với bớc 7.4 7.3 Phơng án chiÕt B LÊy chÝnh x¸c mét thĨ tÝch V E (20 ml 25 ml) etanol (4.2) vào bình chiết (5.6) để ngập hết lọc Đóng nắp chặt để tránh phần chiết bay Lắc nhẹ để ổn định phần cặn Đặt vào nồi cách thủy để phần chiết bình ngang mức với nớc nồi Đun min, lắc nhẹ cần Lấy bình chiết khỏi nồi để nguội đến nhiệt độ phòng 15 Thời gian chiết đo phải tối thiểu Chú thích Phần chiết giai đoạn giữ tủ lạnh qua đêm trớc đo (xem 7.4) Không lu giữ ba ngày Lọc phần phần chiết qua lọc (5.4), hứng vào bình phản ứng (5.6), bình không đợc tráng dung môi (xem thích 4) Có thể ly tâm bình phản ứng để thu đợc phần Dùng phần chiết để đo quang Chú thích Khi dùng phơng pháp này, cần thu lấy phần thể tích chiết thể tích V e biết xác không bay nút kín Ngoài ra, nớc lọc bỏ qua (xem 7.1) nhỏ % thể tích chiết 7.4 Đo quang 7.4.1 Dùng pipét chuyển phần chiết vào cuvet máy đo phổ, để lại đủ cho bớc axit hóa (xem 7.4.2) Đo độ hấp thụ ë 665 nm (A 665 ) vµ 750 nm (A 750 ) so víi etanol (4.2) Chó thÝch − §é hÊp thơ ë 665 nm ph¶i n»m kho¶ng 0,01 đến 0,8 đơn vị Điều đạt đợc nhờ lấy phần thể tích lọc, thể tích chiết, pha loãng, cu vet phù hợp Để bắt đầu, lấy 0,5 lit mẫu, lọc đờng kính 50 mm, 20 ml etanol vµ cuvet cm 7.4.2 Axit hóa phần chiết (thờng ml đến 10 ml) b»ng 0,01 ml axit clohydric (4.1) cho 10 ml phÇn chiết, lắc đo độ hấp thụ 665 nm 750 nm sau đến 30 Tính toán biểu thị kết 8.1 Nồng độ c clorophyl-a, đợc tính microgam lit, theo c«ng thøc: TCVN 6662 :2000 ( A − Aa ) 10 3Ve R × × Kc R − Vs d ρc = (1) ®ã A = A 665 A 750 độ hấp thụ cđa phÇn chiÕt tr−íc axit hãa (xem 7.4.1); A a = A 665 A 750 độ hấp thụ phần chiết sau axit hóa; Ve thể tích phần chiết, tính mililit; Vs thể tÝch mÉu ®· läc, tÝnh b»ng lit; K c = 82 l/ µ g ⋅ cm lµ hƯ sè hÊp thụ phổ đặc trng cho clorophyl-a, giá trị đợc lÊy tõ [2]; R = 1,7 lµ tû sè A/A a cho dung dịch clorophyl-a tinh khiết bị chuyển thành phaeophytin axit hóa (xem 7.4.2) (giá trị đợc lÊy tõ [2]); d lµ chiỊu dµi quang cđa cuvet, tính centimet; 10 hệ thập phân số cđa V e 8.2 Nång ®é ρ p cđa phaeopicment, tính microgam lit , đợc tính theo công thức: p = 8.3 R 10 3Ve ì c Aa ì Kc Vs d (2) Khi giá trị 82 đợc lấy cho hệ số hấp thụ phổ đặc trng clorophyl-a etanol 90 %, 1,7 đợc lấy cho hệ số axit cực đại (R) clorophyl-a tinh khiết nồng độ clorophyl-a mẫu nớc đợc đơn giản hóa thành c = ( A Aa ) × 29,6 × Ve Vs d (3) nồng độ phaeopicment từ công thức (2) đợc đơn giản hóa thành công thức (4): p = Aa ì 20,8 × Ve − ρc Vs d (4) Chó thích Giá trị tính toán phaeopigment không ổn định nh nồng độ clorophyl-a Một phép thử liên phòng thÝ nghiƯm ®· chØ râ ®é lƯch % ®Õn 11 % clorophyl-a % đến 46 % phaeopigment Tỷ số A/A a 1,7 có clorophyl-a tồn mẫu, sản phẩm phân hủy clorophyl-a tồn t¹i mÉu TCVN 6662 :2000 HƯ sè hÊp thụ (82) cho clorophyl-a etanol (4.2) đợc lấy [5] 665 nm Giá trị (84) cho cho clorophyl-b clorophyl-c Độ hấp thụ clorophyl-a nồng độ axeton cao % ®Õn % etanol ë 665 nm [2] [4] 8.4 Ghi kết microgam lit (hoặc miligam mét khối) với hai số có nghĩa sè sau dÊu phÈy, thÝ dơ: Nång ®é clorophyl-a 5,5 µ g/l Nång ®é phaeopigment < 0,1 µ g/l Độ xác Một phép thử liên phòng thí nghiệm thùc hiƯn 1983 cho kÕt qu¶ [6] ghi b¶ng Bảng Độ xác Mẫu l n na − x % σr VC r σR VC R µ g/l µ g/l % µ g/l % A 18 71 126,5 5,46 4,3 6,36 5,0 B 18 70 2,8 20,3 3,67 18,1 2,90 11,3 C 17 67 5,6 24,6 2,21 9,0 2,8 11,4 l số phòng thí nghiệm r độ lệch chuẩn lặp lại n số giá trị VC r hệ số độ lệch lặp lại na phần trăm loại bỏ R độ lệch chuẩn tái lập trung bình tổng VC R hệ số độ lệch tái lập x 10 Báo cáo kết Báo cáo kết cần gồm thông tin sau: a) viện dẫn tiêu chn nµy; b) nhËn biÕt mÉu n−íc; c) biĨu diƠn kết quả, theo điều 8; d) xử lý mẫu trớc, có; e) sai khác so với phơng pháp tình ảnh hởng đến kÕt qu¶ TCVN 6662 :2000 Phơ lơc A (tham kh¶o) Xác định hàm lợng thực vật đáy A.1 Xác định thực vật đáy Lấy mẫu thực vật phù du theo ISO 5667-1 vµ TCVN 5992: 1995 (ISO 5667-2) LÊy mÉu thực vật đáy (tảo bám vào) phụ thuộc vào chất Một vùng diện tích bề mặt xác định đá vật liệu khác chìm nớc đợc nạo dao lỡi dao cạo râu Sỏi đá nhỏ lấy trực tiếp vào dung môi Vật liệu nhân tạo đặt xuống nớc nh miếng thủy tinh làm cho việc lấy mẫu trở nên dễ dàng Cả miếng thủy tinh tảo đợc lấy vận chuyển từ nơi lấy mẫu với nớc Tảo đáy chất với khối lợng biết đợc xử lý tơng tự nh với thực vật phù du theo phơng pháp mô tả tiêu chuẩn A.2 Dung môi chiết Axeton đợc dùng nhiều đợc UNESCO-SCOR đề nghị vào năm 1966 để chiết tảo Tuy nhiên, số trờng hợp axeton tỏ không đợc tốt nên đợc thay cồn Thực nghiệm etanol metanol nóng tơng tự chiết tốt axeton lạnh [4] Nhng axit hóa phần chiết để hiệu chỉnh ảnh hởng phaeopicment sinh vấn đề Sự lệch độ hấp thụ cực đại phía sóng ngắn dẫn đến thay đổi tỷ số axit, thí dụ nồng độ axit, hàm lợng nớc dung môi lọc, thời gian từ lúc axit hóa đến lúc đo Những vấn đề khắc phục cách thêm bớc phơng pháp, thí dụ trung hòa bazơ hữu (dimetyl anilin diphenyl anilin) Ngoài ra, mêtanol độc Vì thế, khuyến nghị dùng etanol làm chất chiết để xác định clophyl-a mẫu nớc nớc biĨn TCVN 6662 :2000 Phơ lơc B (tham kh¶o) Tài liệu tham khảo [1] TOLSTOY, A TOTH, I., Bacterio clorophyl-d ảnh hởng đến xác định clorophyl-a, Arch Hydro biol.89 (1980), tr 160 - 170 Bacterio clorophyl-d and its interference on determination of chlorophyll-a Arch Hydro biol 89 (1980),pp.160-170 [2] NUSCH, E.A., So sánh phơng pháp khác để xác định clorophyl phaeopigment, Arch Hydrobiol.Ergebn.Limnol.14 (1980) tr 14-36 Comparison of different methods for chlorophyll and phaeopigment determination, Arch Hydrobiol.Ergebn.Limnol.14 (1980), pp 14-36 [3] LORENZEN, C J., Xác định clorophyll phaeopigment, phơng trình trắc quang, Limmol oceanogr.12 (1967), tr 343-346 Determination of chlorophyll and phaeopigments; spectrophotometric equations, Limmol oceanogr.12 (1967), pp 343-346 [4] MARKER, A.F.H., NUSCH, E.A, RAI, H RIEMANN, B Đo pigment quang hợp nớc phơng pháp tiêu chuẩn hóa: kết luận đề nghị, Arch Hydrobiol Beich Ergebn.Limnol, 14 (1980) tr 91-106 The mesurement of photosynthetic pigments in frestwaters and standardization of methods: Conclusions and recommentdations Arch Hydrobiol Beich Ergebn.Limnol, 14 (1980) pp 91-106 [5] VOLLENWEIDER, R.A, Những phơng pháp đo dự phát triển môi trờng nớc IBP Handbook N o 12, xuất lần thø hai (1971) Blackwell Scient Publ.Oxford Edinburgh A manual on methods of measuring primary production in aquatic environments, IBP Handbook No 12, 2nd ed (1971) Blackwell Scient Publ.Oxford Edinburgh [6] NISCH, E.A., kết thử liên phòng thí nghiệm Xác định clorophyl-a.Z Wasser Abw.Forsch.17, (1984), tr 189-194 Results from an interlaboratory ring test concerning the determination of chlorophyll a Z Wasser Abw.Forsch.17, (1984), pp 189-194 _ 10 ...Lời nói đầu TCVN 6662 : 2000 hoàn toàn tơng ®−¬ng víi ISO 10260 : 1992 TCVN 6662 : 2000 Ban Kü thuËt Tiªu chuÈn TCVN/ TC 147 ChÊt lợng nớc biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lờng Chất lợng... Khoa học, Công nghệ Môi trờng ban hành TIêu chuẩn vIệt nam tcvn 6662 : 2000 Chất lợng nớc Đo thông số sinh hóa Phơng pháp đo phổ xác định nồng độ clorophyl-a Water quality − Measurement of biochemical... nhá, cã thĨ bá qua [2] Tiªu chn trÝch dÉn ISO 566 7-1 :1980, Chất lợng nớc Lấy mẫu Phần 1: Hớng dẫn lập chơng trình lấy mẫu TCVN 5992: 1995 (ISO 566 7-2 :1991), ChÊt l−ỵng n−íc − LÊy mÉu − H−íng