Tác dụng chống viêm, giảm đau của cao lỏng kiện khớp tiêu thống trên động vật thực nghiệm

Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm đánh giá tác dụng chống viêm của chế phẩm trên mô hình gây phù chân chuột bằng carragenin và mô hình gây u hạt ở chuột cống trắng. Bên cạnh đó, bài viết còn đánh giá tác dụng giảm đau của chế phẩm bằng thử nghiệm Randall-Selitto ở chuột cống trắng và mô hình gây đau quặn ở chuột nhắt trắng.

TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2015 TÁC DỤNG CHỐNG VIÊM, GIẢM ĐAU CỦA CAO LỎNG KIỆN KHỚP TIÊU THỐNG TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM Vũ Bình Dương*; Nguyễn Hồng Ngân* TĨM TẮT Mục tiêu: nghiên cứu tác dụng chống viêm, giảm đau cao lỏng kiện khớp tiêu thống mơ hình thực nghiệm Đối tượng phương pháp: đánh giá tác dụng chống viêm chế phẩm mơ hình gây phù chân chuột carragenin mơ hình gây u hạt chuột cống trắng Đánh giá tác dụng giảm đau chế phẩm thử nghiệm Randall-Selitto chuột cống trắng mô hình gây đau quặn chuột nhắt trắng Kết quả: cao lỏng kiện khớp tiêu thống làm giảm có ý nghĩa thống kê mức phù bàn chân chuột sau tiêm carragenin; làm giảm trọng lượng u hạt khô tất chuột dùng thuốc; làm tăng ngưỡng đau thử nghiệm Randall-Selitto; làm giảm số đau quặn tiêm axít acetic Các tác dụng tương đương thuốc chuẩn NSAIDs dùng làm tham chiếu Kết luận: cao lỏng kiện khớp tiêu thống có tác dụng chống viêm, giảm đau thực nghiệm tương đương với thuốc chuẩn NSAIDs * Từ khóa: Kiện khớp tiêu thống; Chống viêm; Giảm đau Anti-inflammatory and Analgesic Activities of Kien Khop Tieu Thong Liquid Extract in Animal Model Summary Objective: Study anti-inflammatory and analgesic activities of Kien khop tieu thong liquid extract in experimental models Subjects and methods: The anti-inflammatory activities of the extract were evaluated using carrageenan-induced paw edema model and the granuloma formation model in rats The analgesic activities of the extract was evaluated using RandallSelitto test in rats and writhing test in mice Results: Kien khop tieu thong extract produced a significant reduction in paw edema after carrageenan administration; reduced dry granuloma weight in all treated animals; increased pain level in Randall-Selitto test; reduced the number of abdominal constriction and stretching of hind limb induce by the injection of acetic acid These activities equal to standard NSAIDs Conclusion: Kien khop tieu thong extract exhibit the antiinflammatory and the analgesic activities in experiment, equal to standard NSAIDs * Key words: Kien khop tieu thong; Anti-inflammatory; Analgesic ĐẶT VẤN ĐỀ Các thuốc giảm đau chống viêm không steroid (non-steroidal anti-inflammatory drugs - NSAIDs) thường dùng điều trị viêm đau khớp, dùng nhiều dễ gây tác dụng phụ viêm loét dày - tá tràng, gây độc cho thận Nhiều dược liệu, thuốc cổ truyền có tác dụng tốt điều trị viêm đau khớp mà gây * Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Vũ Bình Dương (vbduong2978@gmail.com) Ngày nhận bài: 01/03/2015; Ngày phản biện đánh giá báo: 26/03/2015 Ngày báo đăng: 03/04/2015 42 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2015 tác dụng phụ Việc nghiên cứu bào chế dạng thuốc đại từ dược liệu, thuốc cổ truyền ngày quan tâm, giúp tạo chế phẩm có tác dụng tốt, tác dụng phụ, giá thành hợp lý Học viện Quân y sản xuất cao lỏng kiện khớp tiêu thống từ dược liệu sẵn có nước Để có khoa học chứng minh hiệu sản phẩm, tiến hành nghiên cứu nhằm: Đánh giá tác dụng giảm đau chống viêm cao lỏng kiện khớp tiêu thống động vật thực nghiệm ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nguyên vật liệu nghiên cứu * Chế phẩm nghiên cứu: - Cao lỏng kiện khớp tiêu thống 1:1 đạt TCCS, Trung tâm Nghiên cứu Ứng dụng sản xuất Thuốc - Học viên Quân y cung cấp - Thuốc tham chiếu diclofenac sodium, dạng bột (Hãng Sigma, Hoa Kỳ) - Thuốc tham chiếu aspergic, gói bột 0,1 g Pháp sản xuất * Động vật thí nghiệm: - Chuột cống trắng trưởng thành dòng Wistar, khơng phân biệt giống, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm, cân nặng trung bình 150 - 180 g - Chuột nhắt trắng trưởng thành dòng Swiss, khơng phân biệt giống, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm, cân nặng trung bình 18 - 22 g Động vật thí nghiệm Ban Cung cấp động vật thí nghiệm - Học viện Quân y 43 cung cấp, ni dưỡng phòng ni động vật thí nghiệm tuần trước tiến hành thí nghiệm Động vật ăn thức ăn theo tiêu chuẩn thức ăn cho động vật nghiên cứu, nước đun sôi để nguội uống tự Hàng ngày theo dõi ghi chép diễn biến kết thí nghiệm * Thiết bị hóa chất dùng nghiên cứu: - Thiết bị nghiên cứu: cân phân tích 10 g, model CP224S (Sartorius, Đức); máy đo giảm đau áp lực bàn chân chuột (Paw Pressure Analgesy Meter), model 37215 (Hãng Ugo Basile, Italia); máy đo thể tích chân chuột (Plethysmometer), model 7140 (Hãng Ugo Basile, Italia) số thiết bị, dụng cụ phụ trợ khác -4 - Hóa chất: carrageenin số hóa chất khác Hãng Sigma, Hoa Kỳ Phƣơng pháp nghiên cứu Áp dụng mơ hình dược lý thực nghiệm theo quy định Bộ Y tế Việt Nam hướng dẫn Tổ chức Y tế Thế giới nghiên cứu đánh giá thuốc y học cổ truyền [1, 6, 7] * Nghiên cứu tác dụng chống viêm cấp: - Đánh giá tác dụng chống viêm cấp mơ hình gây phù chân chuột carrageenin, theo phương pháp Winter CS (1968) [3] - Chia ngẫu nhiên chuột cống trắng làm lô, lơ 08 Cho chuột nhịn đói qua đêm, nước uống tự Đo thể tích bàn chân sau (bên trái) chuột (hình 1) tới khớp cổ chân máy đo thể tích TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2015 chân chuột (Plethysmometer) lúc ban đầu (V0) Sau đó, cho chuột uống thuốc nước cất với thể tích ml/kg + Lơ (cao lỏng liều 1): uống cao lỏng kiện khớp tiêu thống liều 75 mg/kg + Lô (diclofenac): uống diclofenac sodium liều 15 mg/kg + Lô (chứng sinh lý): uống nước cất Sau dùng thuốc 60 phút, tiến hành gây phù viêm cấp cách tiêm hỗn dịch carrageenin 1% (pha nước muối sinh lý, trước tiêm), liều 0,05 ml/con vào da gan bàn chân sau (bên trái) chuột Sau gây phù viêm cấp, đo lại thể tích bàn chân sau (bên trái) thời điểm sau (V1), sau (V3), sau (V5) sau (V7) Mức độ tăng thể tích chân chuột tính theo cơng thức: X% = Vt - V0 V0 x 100 Trong đó, X%: tỷ lệ % tăng thể tích bàn chân chuột; V0: thể tích bàn chân chuột trước tiêm carrageenin; Vt: V1, V3, V5 V7 (thể tích bàn chân chuột thời điểm sau tiêm carrageenin 1, 3, giờ) Tác dụng ức chế phù biểu thị % giảm mức độ tăng thể bàn chân chuột lô dùng thuốc nghiên cứu so với mức độ tăng lô chứng sinh lý tính theo cơng thức: Y% = 44 Mc - Mt Mc x 100 Trong đó, Y%: tỷ lệ % giảm mức độ phù bàn chân chuột; Mc: tỷ lệ % tăng thể tích bàn chân chuột lơ đối chứng Mt: tỷ lệ % tăng thể tích bàn chân chuột lô dùng thuốc nghiên cứu * Nghiên cứu tác dụng chống viêm mạn: Đánh giá tác dụng chống viêm mạn mơ hình gây u hạt chuột cống trắng theo phương pháp nghiên cứu Ducrot, Julon CS (1963) [4], Meier CS (1950) [3] Chia ngẫu nhiên chuột cống trắng làm lô, lô 08 Sau nhịn đói qua đêm, cho chuột uống thuốc nước cất với thể tích ml/kg/24 + Lô (cao lỏng liều 1): uống cao lỏng kiện khớp tiêu thống liều 75 mg/kg/24 + Lô (diclofenac): uống diclofenac sodium liều 15 mg/kg/24 + Lô (chứng sinh lý): uống nước cất 30 phút sau dùng thuốc, gây mê nhẹ chuột calypsol cấy hạt amian vô khuẩn (30 ± 0,1 mg) vào da lưng hai bên chuột Tiếp tục cho chuột uống thuốc thêm ngày, sang ngày thứ 7, phẫu thuật chuột, bóc tách lấy u hạt bao bọc quanh hạt amian, sấy khô đến khối lượng khơng đổi, cân cân phân tích xác đến 10-4g xác khối lượng thực u hạt sau trừ khối lượng hạt amian (tính theo mg/100 g cân nặng chuột) * Nghiên cứu tác dụng giảm đau tổ chức viêm (Randall-Selitto test): Dựa theo phương pháp nghiên cứu Randall Selitto có sửa đổi Winter CS (1962) [3] TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2015 Chia ngẫu nhiên chuột cống trắng thành lô, lô 08 Chuột nhịn đói 18 trước uống thuốc Tiến hành gây phù viêm cấp cách tiêm hỗn dịch carrageenin 1% (pha chế trước tiêm) liều 0,1 ml/con vào da gan bàn chân chuột Sau kể từ tiêm carrageenin, cho chuột uống thuốc nước cất với thể tích ml/kg cân nặng + Lô (cao lỏng liều 1): uống cao lỏng kiện khớp tiêu thống liều 75 mg/kg + Lô (aspegic): uống aspegic liều 80 mg/kg + Lô (chứng sinh lý): uống nước cất Đo ngưỡng đau bàn chân gây phù viêm chuột máy đo giảm đau áp lực bàn chân chuột (Paw Pressure Analgesy Meter) thời điểm 30 phút, 60 phút, 90 phút 120 phút sau dùng thuốc So sánh ngưỡng đau bàn chân chuột lô với * Nghiên cứu tác dụng giảm đau mơ hình gây đau quặn (Writhing tests): Theo phương pháp nghiên cứu Koster CS (1959) [3] Chia ngẫu nhiên chuột nhắt trắng làm lô, lô 10 Cho chuột nhịn đói 12 trước uống thuốc Cho chuột uống thuốc nước cất với thể tích 10 ml/kg + Lô (cao lỏng liều 1): uống cao lỏng kiện khớp tiêu thống liều 90 mg/kg + Lô (diclofenac): uống diclofenac sodium liều 20 mg/kg + Lô (chứng sinh lý): uống nước cất Sau dùng thuốc 60 phút, tiến hành gây đau quặn cách tiêm phúc mạc 45 dung dịch axít acetic 0,6% liều 0,1 ml/10 g thể trọng Chuột xuất đau quặn biểu thóp bụng lại, áp bụng xuống sàn, duỗi dài thân chân sau Đếm số đau quặn thời gian 20 phút kể từ tiêm axít acetic So sánh kết lơ nghiên cứu, tính % ức chế đau quặn theo công thức: Dc - Dt x 100 A% = Dc Trong đó, A%: tỷ lệ giảm số đau quặn lô thử thuốc; Dc: số đau quặn lô chứng âm; Dt: số đau quặn lô thử thuốc * Xử lý số liệu: So sánh thống kê đánh giá khác biệt lô nghiên cứu Oneway ANOVA test, sử dụng phần mềm SPSS 16.0 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Tác dụng chống viêm cấp Sau tiêm carragenin, tất chuột xuất phù bàn chân rõ Ở tất lô, chân chuột phù to thời điểm sau gây viêm phù thời điểm sau gây viêm phù giảm dần So với lô chứng sinh lý, tỷ lệ % tăng thể tích bàn chân chuột lô dùng cao lỏng kiện khớp tiêu thống lô dùng diclofenac giảm rõ (p < 0,05 thời điểm sau tiêm carragenin p < 0,01 thời điểm 3, 5, sau tiêm carragenin) (hình 1) So sánh lơ cao lỏng lô dùng diclofenac không thấy khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2015 Phần trăm tăng thể tích 200 160 120 ** 80 * * * Cao lỏng ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** * * ** Diclofenac ** Chứng sinh lý 40 Sau Sau Sau Sau Hình 1: Cao lỏng kiện khớp tiêu thống có tác dụng ức chế phù viêm carragenin bàn chân chuột cống trắng Các (bar) thể giá trị X ± SE * p < 0,05; ** p < 0,01 so với lô chứng sinh lý Tại thời điểm sau gây phù viêm giờ, lô dùng cao lỏng kiện khớp tiêu thống lô dùng thuốc chuẩn diclofenac thể tác dụng ức chế phù viêm Tác dụng thể rõ thời điểm sau gây phù viêm giờ, với tỷ lệ % ức chế phù viêm lô dùng cao lỏng kiện khớp tiêu thống diclofenac 38,14% 40,49% Tại thời điểm sau gây phù viêm giờ, tỷ lệ % ức chế phù viêm lô dùng thuốc trì mức cao So sánh tỷ lệ % ức chế phù bàn chân chuột lô dùng cao lỏng lô dùng diclofenac không thấy khác biệt (p > 0,05) (bảng 1) Bảng 1: Tỷ lệ % ức chế (I%) phù viêm cấp bàn chân chuột lơ nghiên cứu Tû lƯ % ức chế phù viêm cấp bàn chân chuột (I%) Thời ®iĨm sau g©y phï Lơ cao lỏng Lơ diclofenac Sau 25,17 28,75 Sau 38,11 40,49 Sau 37,89 40,00 Sau 35,80 38,37 34,24 ± 6,14 36,90 ± 5,51 X 46 ± SD p > 0,05 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2015 Tác dụng chống viêm mạn Hình 2: U hạt bao quanh hạt amian nghiên cứu tác dụng chống viêm mạn Toàn chuột cấy hạt amian vơ khuẩn vào da có hình thành tổ chức u hạt (granuloma tissue) bao quanh hạt aminan 45 40 Trọng lượng u hạt (mg) 35 ** ** 30 25 20 15 39.88 28.88 28.63 10 Cao lỏng1 Cao lỏng Diclofenac Diclofenac Chứng sinh3lý Chứng sinh lý Hình 3: Cao lỏng kiện khớp tiêu thống có tác dụng làm giảm khối lượng u hạt chuột cống trắng Các (bar) thể giá trị X ± SE ** p < 0,01 so với lô chứng sinh lý Khối lượng u hạt lô dùng cao lỏng kiện khớp tiêu thống lô dùng diclofenac giảm so với lô chứng sinh lý (p < 0,01) So sánh lô dùng cao lỏng kiện khớp tiêu thống lơ dùng diclofenac khơng khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) 47 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2015 Tác dụng giảm đau tổ chức viêm Bảng 2: Ngưỡng đau tổ chức viêm cấp bàn chân chuột (n = 8) Ng-ỡng đau thời điểm sau uống thuốc 30 phút L« thÝ nghiƯm X ± SD 60 phút % tăng X ± SD 90 phút % tăng X ± SD 120 phút % tăng X ± SD % tăng Cao lỏng (1) 5,13 ± 0,69 26,15 6,03 ± 1,01 40,94 5,36 ± 0,65 31,19 5,15 ± 0,76 29,56 Aspegic (2) 5,26 ± 0,86 29,54 6,09 ± 1,01 42,40 5,68 ± 0,89 38,84 5,29 ± 0,81 33,02 Chứng sinh lý (3) 4,06 ± 1,25 - 4,28 ± 1,14 - 4,09 ± 1,14 - 3,98 ± 0,96 - p p1,2,3- < 0,05 p1,2,3- < 0,01 Tại thời điểm sau uống thuốc 30 phút, lô dùng cao lỏng kiện khớp tiêu thống lô dùng thuốc chuẩn aspegic thể tác dụng giảm đau, làm tăng ngưỡng đau so với lô chứng sinh lý (p < 0,05) Tác dụng giảm đau thể rõ thời điểm sau uống thuốc 60 phút, ngưỡng đau tăng so với lô chứng sinh lý với p < 0,01 tỷ lệ % tăng ngưỡng đau so với lô chứng sinh lý lô dùng cao lỏng kiện khớp tiêu thống aspegic 40,94% 42,40% Tại thời điểm sau uống thuốc 90 phút 120 phút, tác dụng giảm đau thuốc trì với ngưỡng đau tăng so với lô chứng sinh lý (p < 0,01) So sánh thống kê lô dùng cao lỏng kiện khớp tiêu thống với lô dùng aspegic khơng thấy khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Tác dụng giảm đau mô hình gây đau quặn Bảng 3: Ảnh hưởng thuốc nghiên cứu tới số đau quặn chuột nhắt trng Chỉ tiêu nghiên cứu Lô nghiên cứu n S đau quặn (lần/20 phút) Tỷ lệ (%) giảm đau quặn Cao lỏng liều (1) 10 33,60 ± 8,22 ↓ 35,14% Diclofenac (2) 10 30,40 ± 8,80 ↓ 36,80 % Chứng sinh lý (3) 10 48,10 ± 11,99 0% p p1-3 < 0,01; p2-3 < 0,01; p1-2 > 0,05 Sau tiêm axít acetic vào ổ bụng, tất chuột có đau quặn với biểu thóp bụng lại, áp bụng xuống sàn, duỗi dài thân chân sau Chuột lô dùng cao lỏng kiện khớp tiêu thống lơ dùng diclofenac có số đau quặn đếm 20 phút giảm rõ so với lô chứng sinh lý (p < 0,01) Tỷ lệ giảm đau quặn lô dùng cao lỏng diclofenac 35,14% 36,80% So sánh lô dùng cao lỏng kiện khớp tiêu thống với lô dùng aspegic chuẩn, số đau quặn khơng khác có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) 48 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2015 BÀN LUẬN KẾT LUẬN Tác dụng chống viêm cao lỏng kiện khớp tiêu thống đánh giá mơ hình gây phù chân chuột carragenin mơ hình gây u hạt chuột cống trắng Mơ hình gây phù chân chuột carragenin dùng để khảo sát hoạt tính ức chế thuốc chống lại autacoid (nitric oxide, histamine, serotonin, kinin, prostaglandin ) chất trung gian hóa học đóng vai trò quan trọng q trình viêm cấp [5] Mơ hình gây u hạt thực nghiệm xem mơ hình tin cậy để đánh giá tác dụng thuốc ức chế chống lại hoạt hóa (activation), thâm nhiễm (infiltration) kết tập (aggregation) đại thực bào, chống lại trình hình thành tổ chức u hạt viêm mạn Tác dụng giảm đau cao lỏng kiện khớp tiêu thống đánh giá mơ hình đánh giá giảm đau tổ chức viêm (Randall-Selitto test) mơ hình gây đau quặn (Writhing tests) Đây hai mơ hình dược lý để đánh giá tác dụng giảm đau ngoại vi thuốc, đặc biệt đau viêm [3, 4] Kết nghiên cứu cho thấy cao lỏng kiện khớp tiêu thống có tác dụng chống viêm giảm đau tốt mơ hình thực nghiệm, tương đương với thuốc NSAIDs (diclofenac, aspergic) dùng làm tham chiếu, hứa hẹn loại thuốc có tác dụng tốt cho điều trị chứng viêm đau viêm khớp (cả cấp mạn), viêm dây thần kinh Cao lỏng kiện khớp tiêu thống có tác dụng chống viêm (cả viêm cấp viêm mạn), giảm đau tốt mơ hình dược lý thực nghiệm, tương đương với thuốc NSAIDs (diclofenac, aspergic) dùng làm tham chiếu 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO Bộ Y tế Quyết định số 01/2007/ QĐ-BYT việc ban hành “Quy định thử thuốc lâm sàng” 2007 Meier R, Schuler W, Desaulles P On the mechanism of cortisone inhibition of connective tissue proliferation Autoimmun Rev 2008, 7, pp.305-308 H.Gerhard Vogel Drug Discovery and Evaluation: Pharmacological Assays Springer 2008 Turner A Screening methods in pharmacology Academic Press, New York and London 1965, pp.60-68 Vinegar R, Schreiber W, Hugo R Biphasic development of carrageenin edema in rats Pharmacol Exp Ther 1969, 166, pp.96-103 J WHO Research Guidelines For Evaluating the Safety and Efficacy of Herbal Medicines ROWP, Manila, Philippines 1993 WHO General Guidelines for Methodologies on Research and Evaluation of Traditional Medicine, EDM/TRM Geneva, Switzerland 2000  ... cao lỏng kiện khớp tiêu thống từ dược liệu sẵn có nước Để có khoa học chứng minh hiệu sản phẩm, tiến hành nghiên cứu nhằm: Đánh giá tác dụng giảm đau chống viêm cao lỏng kiện khớp tiêu thống động. .. thuốc 30 phút, lô dùng cao lỏng kiện khớp tiêu thống lô dùng thuốc chuẩn aspegic thể tác dụng giảm đau, làm tăng ngưỡng đau so với lô chứng sinh lý (p < 0,05) Tác dụng giảm đau thể rõ thời điểm... loại thuốc có tác dụng tốt cho điều trị chứng viêm đau viêm khớp (cả cấp mạn), viêm dây thần kinh Cao lỏng kiện khớp tiêu thống có tác dụng chống viêm (cả viêm cấp viêm mạn), giảm đau tốt mơ hình