Đề tài này được tiến hành với mục tiêu nhằm xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm chế phẩm thuốc bột phối hợp từ các dược liệu xạ can, bọ mắm và dâu tằm. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm rõ nội dung chi tiết của đề tài nghiên cứu này.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN KIỂM NGHIỆM CHẾ PHẨM THUỐC BỘT PHỐI HỢP TỪ CÁC DƯỢC LIỆU XẠ CAN, BỌ MẮM VÀ DÂU TẰM Nguyễn Thị Dịu Hiền*, Nguyễn Thị Ngọc Đan**, Lâm Bích Thảo**, Trần Cơng Luận**, Dương Thị Mộng Ngọc**, Lã Văn Kính*** TĨM TẮT Mục tiêu: Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm chế phẩm thuốc bột phối hợp từ dược liệu Xạ can, Bọ mắm Dâu tằm Phương pháp: Định tính hợp chất saponin, alkaloid, flavonoid rutin phản ứng hoá học sắc ký lớp mỏng Định lượng flavonoid tồn phần tính theo rutin chế phẩm phương pháp quang phổ tử ngoại khả kiến Kết quả: Đã xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm chế phẩm thuốc bột phối hợp từ dược liệu Xạ can, Bọ mắm Dâu tằm Xác định diện nhóm hợp chất flavonoid, saponin, alkaloid Trên hình ảnh sắc ký đồ chế phẩm cho thấy có diện loại dược liệu hoạt chất rutin Hàm lượng flavonoid tồn phần tính theo rutin chế phẩm 0,088% Kết luận: Phương pháp phân tích đáng tin cậy, đơn giản nên ứng dụng vào công tác kiểm tra đánh giá chất lượng chế phẩm giúp ích cho việc ổn định quy trình sản xuất Từ khoá: Xạ can, Bọ mắm, Dâu tằm, rutin, sắc ký lớp mỏng, quang phổ tử ngoại khả kiến ABSTRACT THE STANDARDIZATION OF THE POWDER PREPARATION FROM SOME MEDICINAL PLANTS: BELAMCANDA CHINENSIS, POUZOLZIA ZEYLANICA AND MORUS ALBA Nguyen Thi Diu Hien, Nguyen Thi Ngoc Dan, Lam Bich Thao, Tran Cong Luan, Duong Thi Mong Ngoc, La Van Kinh * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 18 - Supplement of No – 2014: 216 - 221 Objectives: The aim of this study to develop the standardization for anlyzing the powder preparation from some medicinal plants: Belamcanda chinensis, Pouzolzia zeylanica and Morus alba Methods: Chemical reactions and Thin Layer Chromatography (TLC) were used to identify the presence of saponins, alkaloids, flavonoids and rutin in the powder preparation Quantitative determination of total flavonoid expressed in rutin by UV spectrophotometric method Results: The testing standardization of the powder preparation were establised The presence of saponins, alkaloids, flavonoids were determined by chemical reactions TLC showed the presence of the medicinal plants and rutin in the preparation Total flavonoid content expressed in rutin was determined to be 0.088% Conclusions: The preparation have been standardized for stabilizing the producing process as well as the quality of product The analytical method was proven to be reliable This result is used to further study Keywords: Belamcanda chinensis, Pouzolzia zeylanica, Morus alba, rutin, TLC, UV spectrophotometric ∗ Trường Đại Học Nông Lâm TP HCM ∗∗ Trung Tâm Sâm & Dược Liệu TP HCM Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam Tác giả liên lạc: PGS.TS Lã Văn Kính ĐT: 0913916201 email: lakinh@hcmgmail.com ∗∗∗ 216 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 ĐẶT VẤN ĐỀ Nghiên cứu Y học Dụng cụ: Máy siêu âm (εlma, LC60H); tủ sấy; Ngày nay, với phát triển y học cổ truyền, loại thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên nghiên cứu đưa vào sản xuất nhiều Những loại thuốc tốt cho sức khỏe người sử dụng, tác dụng phụ thuốc có nguồn gốc tổng hợp hóa học Từ xa xưa, Xạ can coi vị thuốc quý chữa bệnh họng, viêm amidan có mủ, ho nhiều đờm, khản tiếng Lá Dâu tằm có vị đắng, ngọt, tính hàn, có tác dụng chữa cảm mạo, phong nhiệt, sốt nóng, ho, viêm họng Bọ mắm chữa viêm họng, ho lâu ngày, bệnh phổi Nhằm góp phần cho cho phát triển loại thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên, chế phẩm thuốc bột phối hợp từ dược liệu Xạ can, Bọ mắm Dâu tằm để điều trị bệnh hô hấp tiến hành nghiên cứu Trong nghiên cứu này, áp dụng phương pháp lý hóa để khảo sát độ ẩm, định tính nhóm hoạt chất chủ yếu có chế phẩm Áp dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng để xác định diện dược liệu thành phần chế phẩm Đồng thời, áp dụng phương pháp quang phổ để xác định hàm lượng flavonoid tồn phần tính theo rutin Từ đó, góp phần tiêu chuẩn hóa kiểm nghiệm chất lượng chế phẩm nghiên cứu triển khai tiến tới giới thiệu sản phẩm cho cộng đồng bể cách thủy; bình sắc ký; cân có độ xác ĐỐI TƯỢNG– PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU MeOH, lọc Dịch lọc cô đến cắn Hoà cắn Nguyên liệu Chế phẩm thuốc bột bào chế Bộ mơn Hố – chế phẩm – Trung tâm Sâm dược liệu Tp HCM Thành phần gồm cao Xạ can (4,75%), cao Bọ mắm (3,55%), cao Dâu tằm (2,8%) tá dược làm dạng bột (88,90%) Phương tiện Hóa chất: methanol (TQ); anhydric acetic (Merck); diethyl ether (TQ): ethyl acetate (TQ); cloroform (TQ); toluene (TQ), rutin chuẩn (Sigma - Aldrich, độ tinh khiết ≥ 95%) Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 0,1mg (Mettler Tolerdo, AB204); máy quang phổ tử ngoại khả kiến (Thermo Spectronic - Heλios γ) Phương pháp khảo sát độ ẩm, độ mịn, độ đồng khối lượng (1) Khảo sát độ ẩm (mất khối lượng sấy khô) theo DĐVN IV, phụ lục 9.6, trang PL-182: Cân 1g chế phẩm, sấy 1050C đến khối lượng khơng đổi Lặp lại thí nghiệm lần Khảo sát độ mịn theo DĐVN IV, phụ lục 3.5, trang PL-110 Khảo sát độ đồng khối lượng theo DĐVN IV, phụ lục 11.3, trang PL-221, thực với 20 gói, lấy ngẫu nhiên Định tính phương pháp hóa học (2,4) Thực phản ứng hóa học để xác định diện hợp chất alkaloid, flavonoid, saponin chế phẩm Hợp chất alkaloid: Dùng dịch chiết H2SO4 5% 5g bột chế phẩm, chiết siêu âm 15 phút với H2SO4 5% (3 lần x 5ml), làm phản ứng màu với thuốc thử (TT) đặc trưng hợp chất alkaloid (Mayer, Bouchardat, Dragendroff) Hợp chất flavonoid: Dùng dịch chiết methanol 3g chế phẩm, chiết siêu âm 15 phút với 20ml với 15ml ethanol, siêu âm cho tan hết cắn, lọc, làm phản ứng với thuốc thử (TT) đặc trưng hợp chất flavonoid (NaOH 10%, FeCl3 10%, chì acetat 5%, Mg/HCl đđ) Hợp chất saponin: Cân khoảng 3g bột chế phẩm, thêm 30ml ethanol 70%, đun cách thủy 30 phút, lọc Dịch lọc chia làm hai phần: Phần 1: Cô dịch lọc đến cắn Hòa cắn với 5ml nước nóng, lọc vào ống nghiệm Pha loãng với nước cất cho đủ khoảng 10ml, lắc dọc theo chiều thẳng đứng ống nghiệm 217 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 Phần 2: dịch lọc đến cắn Hòa cắn với diện Xạ can, Dâu tằm, Bọ mắm 0,5ml anhydric acetic, 1ml cloroform cho vào Ethyl acetate – acid formic – acid acetic – ống nghiệm, cho từ từ vào ống nghiệm H2SO4 đđ nước (100:11:11:26) để xác định diện (phản ứng Lieberman) hoạt chất rutin Định tính phương pháp sắc ký lớp mỏng Dung dịch mẫu thử Bọ mắm Cân khoảng 20g nguyên liệu 100g chế phẩm, cho vào cốc có mỏ 250ml, chiết siêu âm với cồn 96% đến dịch chiết hết màu, tiếp tục chiết siêu âm bã nguyên liệu với cồn 72% cồn 48% đến kiệt Tập trung toàn dịch chiết được, lọc cô giảm áp thu hồi dung môi đến cắn Cắn hòa với 50ml nước cất, siêu âm cho tan cắn Dịch nước lắc với ether ethylic đến dịch ether hết màu Tập trung dịch ether 2ml làm dung dịch chấm sắc ký Dung dịch mẫu thử Dâu tằm, Xạ can hoạt chất rutin Cân khoảng 20g nguyên liệu 100g chế phẩm, cho vào cốc có mỏ 250ml, chiết siêu âm với cồn 96% đến dịch chiết hết màu, tiếp tục chiết siêu âm bã nguyên liệu với cồn 72% cồn 48% đến kiệt Tập trung toàn dịch chiết được, lọc cô giảm áp thu hồi dung mơi đến cắn Cắn hòa với 50ml nước cất, siêu âm cho tan cắn Dịch nước lắc với ether ethylic đến dịch ether hết màu, loại dịch ether Dịch nước lắc tiếp với chloroform, loại dịch chloroform Dịch nước lắc tiếp với ethyl acetat Tập trung dịch ethyl acetat 2ml làm dung dịch chấm sắc ký nguyên liệu Dung dịch chuẩn rutin Hoà tan rutin chuẩn methanol để dung dịch 1mg/ml Điều kiện sắc ký Bản mỏng nhôm Silicagel 60F254 (dày 0,25 mm, 20 x 20 cm) Merck, Germany Hệ dung mơi khai triển Thể tích chấm : 20µl dd nguyên liệu, 10µl dd chế phẩm 10µl dd chuẩn Phát Soi UV 254nm, UV 365nm thuốc thử FeCl3 5% cồn để phát Xạ Can, rutin Soi UV 365nm thuốc thử Anisaldehyd để phát Dâu tằm, Bọ mắm Định lượng flavonoid toàn phần tính theo rutin chế phẩm phương pháp quang phổ tử ngoại khả kiến (4) Thuốc thử AlCl3 5% methanol 70% Mẫu thử Cân xác 10g chế phẩm cho vào bình soxhlet Thêm 250ml ether dầu, chiết đến dịch chiết khơng màu Để nguội gạn bỏ dịch ether Bột chế phẩm bình Soxhlet chiết tiếp tục với 250ml methanol 70%, dịch chiết khơng màu Dịch chiết methanol 70% chuyển vào bình định mức 250ml, bổ sung methanol 70% vừa đủ đến vạch, lắc đều, thu dung dịch A Lấy xác ml dung dịch A micropipet, cho vào ống nghiệm có nắp vặn, thêm xác 4ml methanol 70% 75µl dung dịch AlCl3 5% methanol 70%, lắc (tiến hành mẫu thử tương tự để lấy giá trị trung bình) Mẫu trắng thử Lấy xác 1ml dung dịch A cho vào ống nghiệm có nút vặn, thêm xác 4,075ml methanol 70%, lắc Mẫu chuẩn Thêm xác vào ống nghiệm chứa 50 µg chuẩn rutin 5ml methanol 70% 75µl dung dịch AlCl3 5% methanol 70%, lắc Toluene - Ethyl acetate (7:3) để xác định 218 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 Tất mẫu để nhiệt độ phòng lạnh, đậy kín ống nghiệm, sau 30 phút tiến hành đo, lắc nhẹ cho phản ứng xảy hoàn toàn Tiến hành đo độ hấp thu mẫu đỉnh hấp thu cực đại λmax = 425nm, dùng methanol 70% làm mẫu trắng để chỉnh máy Hàm lượng flavonoid tồn phần tính theo rutin có chế phẩm tính theo cơng thức sau: X= ' t −4 At − A 250×10 × mc × d × Ac m Nghiên cứu Y học Hợp chất Chế phẩm Kết Xuất tủa đỏ nâu với thuốc thử + Bouchardat Dung dịch tăng màu với thuốc thử ++ NaOH 10% Dung dịch có màu xanh rêu với thuốc ++ thử FeCl3 10% Flavonoid Dung dịch có tủa trắng với thuốc thử ++ chì acetat 5% Dung dịch có màu hồng với Mg/HCl đđ + Saponin Xuất lớp bọt bền ++ Vòng ngăn cách có màu nâu đỏ ++ Trong chế phẩm có diện hợp chất alkaloid, flavonoid, saponin Định tính sắc ký lớp mỏng Trong đó: At : Độ hấp thu mẫu thử A’t: Độ hấp thu mẫu trắng thử Ac : Độ hấp thu mẫu chuẩn mc : Khối lượng chất chuẩn (µg) d: Độ tinh khiết chất chuẩn (95%) m : Khối lượng chế phẩm cần định lượng trừ ẩm(g) Sắc ký đồ chế phấm với nguyên liệu đối chiếu Toluene : Ethyl acetate (7: 3) KẾT QUẢ Độ ẩm, độ đồng khối lượng chế phẩm dạng bột Bảng Độ ẩm, độ đồng khối lượng chế phẩm Chỉ tiêu Độ ẩm (%) Độ đồng khối lượng (g) Số lần lặp lại thí nghiệm 20 Yêu cầu phải đạt 5,414 ± 0,0015 ≤9 Trung bình 20,166 ± 0,125 ±7,5 Độ ẩm chế phẩm 5,414% đạt yêu cầu độ ẩm thuốc bột theo quy định Dược điển Việt Nam IV Chế phẩm Xạ can Soi UV 254 nm Chế phẩm Xạ can Soi UV 366 nm Chế phẩm Xạ can Phun TT FeCl3 5% cồn quan sát ánh sáng thường Toluene : Ethyl acetate (7: 3) Chế phẩm Bọ mắm Chế phẩm Bọ mắm Khối lượng bột thuốc gói trung bình 20,166 g, nằm giới hạn cho phép (18,654 ≤ khối lượng trung bình ≤ 21,678), đạt yêu cầu độ đồng khối lượng theo quy định Dược điển Việt Nam IV Chế phẩm dạng bột mịn (180/125) theo quy định Dược điển Việt Nam IV Định tính phương pháp hóa học Bảng Kết định tính hợp chất có viên nang BKHH phương pháp hóa học Chế phẩm Bọ mắm Hợp chất Chế phẩm Kết Xuất tủa trắng với thuốc thử Mayer + Alkaloid Xuất tủa cam với thuốc thử + Dragendroff Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 219 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 Qua kỹ thuật phân tích sắc ký lớp mỏng chứng minh chế phẩm có diện dược liệu Đặc biệt, hình ảnh sắc ký đồ cho thấy chế phẩm có vết giá trị Rf màu sắc với hoạt chất rutin Dâu tằm Chế phẩm Soi UV365nm Dâu tằm Dâu tằm Chế phẩm Chế phẩm Phun TT Phun TT Anisaldehyd Anisaldehyd soi quan sát ánh UV365nm sáng thường Sắc ký đồ chế phẩm với hoạt chất rutin Ethyl acetate – acid acetic – acid formic – nước (100 : 11 : 11 : 26) Chế phẩm Rutin Quan sát ánh sáng thường Chế phẩm Rutin Soi UV 254 nm Chế phẩm Rutin Soi UV 366 nm Chế phẩm Rutin Phun TT FeCl3 5% cồn quan sát ánh sáng thường Định lượng flavonoid tồn phần tính theo rutin chế phẩm phương pháp quang phổ tử ngoại khả kiến rutin chế phấm 0,088% Bảng Hàm lượng flavonoid toàn phần tính theo rutin phẩm thuốc bột (bảng 4) sau Khối lượng A’t chế phẩm At trừ ẩm (g) 9,470 0,565 0,330 9,558 0,561 0,325 9,536 0,562 0,331 Trung bình (%) RSD % Hàm lượng Ac flavonoid tồn phần tính theo rutin (%) 0,336 0,088 0,332 0,088 0,331 0,087 0,088 0,656 Hàm lượng flavonoid tồn phần tính theo 220 Từ kết thực nghiệm trên, đề nghị số tiêu chuẩn chất lượng cho chế Bảng Đề xuất tiêu chuẩn chất lượng chế phẩm Tiêu chuẩn Yêu cầu Mất khối lượng sấy Không 9% khô Độ mịn (rây 180/125) Bột mịn Độ đồng khối lượng ± 7,5% Định tính phương Phản ứng với thuốc thử pháp hóa học hợp chất flavonoid Phản ứng với thuốc thử hợp chất alkaloid Phản ứng với thuốc thử hợp chất saponin Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 Tiêu chuẩn Yêu cầu Định tính sắc ký lớp Các sắc ký đồ chế phẩm mỏng phải có vết tương ứng với vết dược liệu chuẩn: Bọ mắm, Xạ can, Dâu tằm vết rutin Định lượng phương Hàm lượng flavonoid toàn pháp quang phổ tử ngoại phần tính theo rutin 0,075% 0,10% KẾT LUẬN nghiệm tiêu chuẩn chất lượng chế phẩm, phục vụ cho nghiên cứu triển khai có triển vọng đóng góp với cộng đồng lựa chọn điều trị bệnh hô hấp TÀI LIỆU THAM KHẢO Từ kết thu từ thực nghiệm, chúng tơi có số kết luận sau: - Chế phẩm đạt yêu cầu độ ẩm, độ mịn, độ đồng khối lượng theo quy định Dược điển Việt Nam IV - Chế phẩm có hợp chất alkaloid, flavonoid, saponin - Chế phẩm có diện dược liệu: Bọ mắm, Xạ can, Dâu tằm - Hàm lượng flavonoid tồn phần tính theo rutin chế phẩm trung bình 0,088% Nghiên cứu Y học Bộ Y tế (2009) Dược điển Việt Nam IV, NXB Y học, tr PL110, 182, 221 Pereira C B, Marin A, Tiago D T Maki, Raquel M M.Necchi, Melania Palermo Manfron (2011) Physicochemical quality control and dosage of total polyphenols,flavonoids of Morus alba Leaves (MORACEAE), Saúde (Santa Maria) Ahead of Print, v.37, n.2, pp 5768 Trần Hùng (2006) Giáo trình phương pháp nghiên cứu dược liệu Đại học Y dược TP HCM Viện Dược liệu (2004) Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, Tập II NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, tr 219 - 220 (I), 613 – 618 (I),1095 - 1098 (II) Ngày nhận báo: 3/10/2013 Ngày phản biện nhận xét báo: 15/10/2013, 17/10/2013 Ngày báo đăng: 02/01/2013 Những kết thu từ nghiên cứu góp phần cho việc tiêu chuẩn hóa kiểm Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 221 ... chứng minh chế phẩm có diện dược liệu Đặc biệt, hình ảnh sắc ký đồ cho thấy chế phẩm có vết giá trị Rf màu sắc với hoạt chất rutin Dâu tằm Chế phẩm Soi UV365nm Dâu tằm Dâu tằm Chế phẩm Chế phẩm Phun... cắn Ngun liệu Chế phẩm thuốc bột bào chế Bộ mơn Hố – chế phẩm – Trung tâm Sâm dược liệu Tp HCM Thành phần gồm cao Xạ can (4,75%), cao Bọ mắm (3,55%), cao Dâu tằm (2,8%) tá dược làm dạng bột (88,90%)... bệnh phổi Nhằm góp phần cho cho phát triển loại thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên, chế phẩm thuốc bột phối hợp từ dược liệu Xạ can, Bọ mắm Dâu tằm để điều trị bệnh hô hấp tiến hành nghiên cứu