Xác định biofilm trong viêm amiđan mạn tính ở trẻ em

Nội dung bài viết với mục tiêu xác định tỷ lệ màng sinh học biofilm trong amiđan mạn tính bằng phương pháp nhuộm HE và soi qua kính hiển vi quét SEM, tìm mối tương quan giữa việc dùng kháng sinh, thời gian viêm amiđan với việc phát hiện ra biofilm.

Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 Nghiên cứu Y học XÁC ĐỊNH BIOFILM TRONG VIÊM AMIĐAN MẠN TÍNH Ở TRẺ EM Nhan Trừng Sơn* Phú Quốc Việt** TÓM TẮT Mục tiêu: Xác định tỷ lệ màng sinh học biofilm amiđan mạn tính phương pháp nhuộm HE soi qua kính hiển vi qt SEM, tìm mối tương quan việc dùng kháng sinh, thời gian viêm amiđan với việc phát biofilm Phương pháp thực hiện: Cắt ngang mơ tả 70 bệnh nhi có định cắt amiđan BV Nhi Đồng Kết quả: Bằng phương pháp nhuộm HE: số bệnh nhân phát màng sinh học biofilm 38 (54,3%), không phát biofilm 32 (45,7%) Bằng phương pháp SEM: số bệnh nhân phát biofilm 30 (42,86%), không phát biofilm 40 (57,14%), không thấy liên quan tổng thời gian bệnh bệnh nhân với việc tạo màng biofilm, liên quan việc dùng kháng sinh ngắn ngày, hay dài ngày với việc tạo biofilm vi khuẩn Kết luận: Phương pháp nhuộm HE phương pháp soi SEM phương pháp triển vọng để xác định biofilm Phương pháp nhuộm HE phương pháp dễ thực sở, giá thành thấp, hiệu việc xác định biofilm Phương pháp soi kính hiển vi điện tử qt đòi hỏi mẫu phải xử lý kỹ trước soi, mẫu cần vận chuyển đến trung tâm có máy SEM để soi, giá thành cao, phương tiện tốt để xác định biofilm Từ khóa: Màng sinh học, viêm amiđan ABSTRACT THE PRESENCE OF BACTERIAL BIOFILM IN CHRONIC TONSILLITIS IN CHILDREN Nhan Trung Son, Phu Quoc Viet * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 17 - Supplement of No - 2013: 29 - 33 Background: The presence of bacterial biofilms in inflamed tonsils may explain the chronicity and recurrent characteristic of tonsillitis Objective: To assess biofilm rate in chronic tonsilitis by Hematoxyllin- Eosin (HE) staining and by Scanning Electron Microscopy (SEM), and to clarify if there are relations among using antibiotics, tonsillitis time and biofilm detection Methods: Cross-sectional study on 70 paediatric patients undergone tonsillectomy at Children Hospital Results: Biofilms were identified in 38 patients (54.3%) by using HE method and in 30 (42.86%) patients by using SEM method There was neither relation between tosillitis time and biofilm forming nor relation between using antibiotics (short-term (from 1to days) or long-term (from 6-10 days)) and biofilm forming Conclusion: HE and SEM are two potential methods for detecting biofilms HE is a low-cost method, effective to detect biofilm and easy to apply at hospital SEM is a high-cost method It requires careful prepararion samples before scanning and transportation to SEM center Từ khóa: Biofilm, tonsillitis * Bộ môn Tai Mũi Họng, Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch ** Khoa Tai Mũi Họng, Bệnh viện Nhi Đồng Tác giả liên lạc: Ths Phú Quốc Việt ĐT: 0989818652 Email: bstheviet@gmail.com Chuyên Đề Tai Mũi Họng – Mắt 29 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 ĐẶT VẤN ĐỀ Amiđan tổ chức bạch huyết vòng bạch huyết Waldeyer ngã tư đường ăn đường thở Sự tiếp xúc thường xun với mơi trường bên ngồi họng điều kiện làm cho vi khuẩn dễ cơng vùng Chính vòng bạch huyết Waldeyer pháo đài chống lại công thông qua chức miễn dịch Viêm amiđan thuật ngữ đến viêm amiđan Đây bệnh lý thường gặp lâm sàng chuyên khoa Nội Nhi nói chung chuyên khoa Tai Mũi Họng Nhi nói riêng Việt Nam tồn giới Tại Việt Nam, theo niên giám thống kê Bộ Y tế năm 2002, bệnh mắc cao toàn quốc, viêm họng viêm amiđan cấp đứng hàng thứ (251,39 trường hợp mắc 100.000 dân) Theo thống kê bệnh viện Tai Mũi Họng TP HCM năm 2007, viêm amiđan chiếm 21% bệnh Tai Mũi Họng Từ lâu, vi khuẩn gây bệnh viêm amiđan mạn tính xác định tác giả nuớc Việc sử dụng kháng sinh hợp lý trường hợp viêm amiđan mạn tính song viêm amiđan tái tái lại, chúng tơi cho có khả vi khuẩn hình thành biofilm để chống lại tác dụng kháng sinh đề kháng ký chủ Vì vậy, chúng tơi mạnh dạn tiến hành thực nghiên cứu đề tài: “Xác định biofilm viêm amiđan mạn tính trẻ em phương pháp nhuộm Hematoxylin - Eosin (HE) soi qua kính hiển vi điện tử quét Scanning Electron Microscope (SEM)” TỔNG QUAN TÀI LIỆU Biofilm tập hợp tế bào vi sinh vật kết hợp với bám bề mặt Những tổ chức có biofilm thường khác so với tổ chức tương tự việc giải mã gen, đề kháng kháng sinh đề kháng hệ thống miễn dịch người(1,3) 30 Chúng cho việc sử dụng kháng sinh lâu dài không đạt hiểu có khả vi khuẩn kháng kháng sinh qua chế tạo màng biofilm, nên sau vào việc xác định màng biofilm bề mặt mơ amiđan Trước đây, có nhiều nghiên cứu màng biofilm mô amiđan: Khalid (2008) nghiên cứu 76 trường hợp trẻ em có độ tuổi trung bình 5,7 tuổi bị viêm amiđan VA 46 trường hợp tìm thấy biofilm vi khuẩn phương pháp soi qua kính điện tử quét (SEM) (chiếm 61%) Trong 26 bệnh nhi phải cắt amiđan nạo VA tình trạng nhiễm trùng mạn tính có 22 trường hợp tìm thấy biofilm (85%) Richard (2008) nghiên cứu 19 bệnh nhân bị viêm amiđan mạn tính có 15 bệnh nhân có biofilm (79%) Rafael Ramirez(6) nghiên cứu bệnh nhân với tiền sử bệnh viêm amiđan tái tái lại cần phải cắt amiđan, mẫu mơ quan sát kính hiển vi điện tử qt thơng thường kính vi điện tử quét phù hợp môi trường Kết 8/9 bệnh nhân phát có biofilm bề mặt amiđan R R Diaz (2010)(4) 36 bệnh nhân chọn để cắt amiđan, tuổi từ đến tuổi, không bệnh nhân sử dụng kháng sinh 30 ngày trước cắt amiđan Mẫu amiđan nhuộm Hematoxylin – eosin, nhuộm gram, soi kính hiển vi huỳnh quang, soi kín h hiển vi laser tiêu điểm,có 77.28% bệnh nhân có biofilm amiđan(4) Galli J(5) (2007) 10 trường hợp cắt amiđan, bệnh nhân viêm amiđan VA mạn tính, hay viêm tái hồi nhiều lần, khơng đáp ứng với kháng sinh kháng viêm liệu pháp Nghiên cứu nhằm phát biofilm mẫu mô, mẫu mô cấy soi kinh hiển vi điện tử quét, kết cho thấy có 15/15 mẫu VA 6/10 mẫu amiđan có thấy vi khuẩn dạng hình cầu bám bề mặt mơ tập trung thành khúm nhỏ(5) Chuyên Đề Tai Mũi Họng – Mắt Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 Romain E Kania (2007) ơng so sánh hình ảnh thấy vi khuẩn chất glycocalyx kính hiển vi quét laser đồng tiêu điểm (CLSM) kết hợp với phương pháp nhuộm đôi để so sánh với kết kính hiển vi điện tử quét (SEM) mẫu mơ amiđan Kết có 17/24 (70,8%) trường hợp thí nghiệm cho thấy diện màng sinh học vi khuẩn Richard A Chole(2) (2003) Nghiên cứu tháng 6/2003 15 bệnh nhân bị viêm amiđan tái tái lại, kết có 11/15 trường hợp tìm thấy biofilm (73%) 3/4 trường hợp amiđan phát có biofilm (75%) Bằng kính hiển vi điện tử Nghiên cứu Y học ĐỐI TƯỢNG– PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU Đối tượng nghiên cứu Tiêu chuẩn chọn mẫu Tất bệnh nhi từ đến 15 tuổi khám phòng khám Tai Mũi Họng Bệnh Viện Nhi đồng I có triệu chứng viêm amiđan tái tái lại lần/ năm, từ 10-2011 đến 31-07-2012 Tiêu chuẩn loại trừ Bệnh nhân có chống định cắt amiđan Các mẫu xác nhận giải phẫu bệnh lý viêm amiđan mạn bị loại trừ Viêm amiđan tái tái lại lần/ năm Phương pháp nghiên cứu Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu cắt ngang mô tả Mẫu nghiên cứu Cỡ mẫu xác định phù hợp theo nghiên cứu mẫu nhỏ N = 70 N= C2 x Hình 1: (A) Biofilm amiđan (hình hoa thị) nhuộm với hematoxylin- eosin mơ viêm thâm nhiễm xung quanh (hình mũi tên), hình ảnh vật kính x400 (B) Nhìn tồn cảnh khe hốc amiđan với biofilm (mũi tên) với nhiều nang giãn nở khơng có xơ hóa (hình hoa thị), xem vật kính x32 (C) Đáy hốc amiđan với nhiều khúm vi khuẩn (hình mũi tên) q trình viêm mạnh mẽ, hình ảnh vật kính x100 (D) Đáy hốc amiđan với chất sừng (hình hoa thị) nhiều biofilm (hình mũi tên) hình ảnh vật kính x150 (C =1,96 ; p = 90% ; ε = 7%) Cách tiến hành nghiên cứu Thực phẫu thuật cắt amiđan Lấy mô amiđan lưu giữ lọ formol 10% Một lọ gửi làm giải phẫu bệnh tìm biofilm nhuộm HE Một lọ sau xử lý khô gửi Viện công nghệ Nano, mẫu bọc platinium sau đem chụp biofilm máy SEM Phân tích thống kê phần mềm Stata/SE 10 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Đặc điểm mẫu nghiên cứu Tổng số bệnh nhân 70 bệnh nhân (21 nữ (30%), 49 nam(70%)) Hình 2: Biofilm mẫu amiđan quan sát kính hiển vi điện tử quét Chuyên Đề Tai Mũi Họng – Mắt Tuổi trung bình 92,15 tháng ± 33 (tuổi nhỏ 55 tháng, tuổi lớn 184 tháng) Về nơi ở: 43 bệnh nhân tỉnh, 27 bệnh nhân thành phố Hồ Chí Minh 31 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 Nghiên cứu Y học Tổng thời gian bị viêm amiđan: 53,57 tháng ± 32,9 tháng (thời gian bị viêm amiđan ngắn 15 tháng, thời gian bị amiđan dài 144 tháng) Bảng 3: Mức độ đồng thuận để đánh giá xem HE cho kết giống SEM phần trăm Thời gian sử dụng kháng sinh ngắn đợt điều trị: trung bình ngày ± ngày (ngắn ngày, dài ngày) KẾT LUẬN Thời gian sử dụng kháng sinh dài đợt đợt điều trị: trung bình ngày ± ngày (ngắn ngày, dài 10 ngày) Số lần viêm amiđan trung bình là: lần ± lần (ít lần, nhiều lần) Bảng 1: Độ lớn amiđan Độ amiđan Xơ teo Độ Độ Độ Độ Tổng số Nam (10,2%) 16 (32,65%) 28 (57,14% 49 (100%) Nữ (9,52%) 11 (52,38%) (38,1%) 21 (100%) Tổng số (10%) 27 (38,57%) 36 (51,43%) 70 (100%) Bằng phương pháp nhuộm HE: Số bệnh nhân phát màng sinh học biofilm 38 Số bệnh nhân không phát màng sinh học biofilm 32 Bằng phương pháp SEM: Số bệnh nhân phát màng sinh học biofilm 30 Số bệnh nhân không phát màng sinh học biofilm 40 Bảng 2: Tỷ lệ phát Biofilm Phương pháp HE (+) HE (-) SEM (+) 25 (65,79%) (15,63%) 30 SEM (-) 13 (34,21%) 27 (84,37%) 40 38 32 70 Nếu ta coi SEM chuẩn vàng đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu HE Tính độ nhạy HE 83,3% (KTC 95% độ đặc hiệu HE 67,5% (KTC 95% 81,4%) Tỷ lệ đồng thuận phương pháp 32 Tỷ lệ đồng thuận Hệ số Kappa P 74,29% 0,49 0,000 Qua nghiên cứu biofilm vi khuẩn bệnh nhi bệnh viện Nhi Đồng TPHCM hai phương pháp nhuộm Hematoxylin – Eosin soi kính hiển vi điện tử quét, thu nhận số kết Từ đó, chúng tơi có số kết luận đề xuất sau: Phương pháp nhuộm Hematoxylin – Eosin phương pháp soi kính vi điện tử quét phương pháp triển vọng để xác định màng biofilm vi khuẩn Phương pháp nhuộm Hematoxylin – Eosin phương pháp dễ thực sở, giá thành thấp, hiệu việc xác định màng biofilm vi khuẩn Phương pháp soi kính hiển vi điện tử quét đòi hỏi mẫu phải xử lý kỹ trước soi, mẫu cần vận chuyển đến trung tâm có máy SEM để soi, giá thành cao, phương tiện tốt để xác định màng biofilm vi khuẩn, phương tiện sử dụng lâu giới sử dụng lần TPHCM để xác định màng biofilm vi khuẩn Hiện giới cơng trình nghiên thời gian bệnh liên quan tới việc tạo biofilm, liên quan việc dùng kháng sinh ngắn ngày, hay dài ngày việc tạo biofilm vi khuẩn Trong nghiên cứu chúng tôi, không thấy liên quan tổng thời gian bệnh bệnh nhân với việc tạo màng biofilm Chúng không ghi nhận liên quan việc dùng kháng sinh ngắn ngày, hay dài ngày đợt điều trị viêm amiđan với việc tạo biofilm vi khuẩn Chuyên Đề Tai Mũi Họng – Mắt Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 TÀI LIỆU THAM KHẢO Al-Mazrou KA, Al-Khattaf AS “Adherent biofilms in adenotonsillar diseases in children” Arch Otolaryngol Head Neck Surg, 2008; 134(1):20-23 Chole RA, Faddis BT “Anatomical evidence of microbial biofilms in tonsillar tissues: a possible mechanism to explain chronicity” Arch Otolaryngol Head Neck Surg 2003;129(6):634636 Costerton JW, Stewart PS, Greenberg EP “Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections” Science 1999;284(5418):1318-1322 Chuyên Đề Tai Mũi Họng – Mắt Nghiên cứu Y học Diaz RR, Picciafuoco S et al “Relevance of biofilms in pediatric tonsillar disease” Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2011; 30:1503– 1509 Galli J, Calo L, Ardito F et al “Biofilm formation by Haemophilus influenzae isolated from adeno-tonsil tissue samples, and its role in recurrent adenotonsillitis” Acta Otorhinolaryngol Ital 2007;27(3):134-8 Ramírez-Camacho R, González-Tallón AI et al “Environmental scanning electron microscopy for biofilm detection in tonsils” Acta Otorrinolaringol Esp 2008;59(1):16-20 33 ... gây bệnh viêm amiđan mạn tính xác định tác giả nuớc Việc sử dụng kháng sinh hợp lý trường hợp viêm amiđan mạn tính song viêm amiđan tái tái lại, chúng tơi cho có khả vi khuẩn hình thành biofilm. .. kháng sinh đề kháng ký chủ Vì vậy, chúng tơi mạnh dạn tiến hành thực nghiên cứu đề tài: Xác định biofilm viêm amiđan mạn tính trẻ em phương pháp nhuộm Hematoxylin - Eosin (HE) soi qua kính hiển... chứng viêm amiđan tái tái lại lần/ năm, từ 10-2011 đến 31-07-2012 Tiêu chuẩn loại trừ Bệnh nhân có chống định cắt amiđan Các mẫu xác nhận giải phẫu bệnh lý viêm amiđan mạn bị loại trừ Viêm amiđan