Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu nhằm khảo sát khả năng kháng HSV của các diterpen lacton chiết xuất từ cây xuyên tâm liên nhằm tìm kiếm các loại thuốc mới có nguồn gốc từ thảo dược có khả năng kháng HSV.
NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG KHÁNG VIRUS HERPES SIMPLEX (HSV)CỦA CÁC DITERPEN LACTON TỪ XUYÊN TÂM LIÊN Hứa Thị Như Cẩm∗, Trần Công Luận*, Huỳnh Thị Kim Loan∗∗, Trần Thu Hoa∗∗∗ TÓM TẮT Mục tiêu: Khảo sát khả kháng HSV diterpen lacton chiết xuất từ Xuyên tâm liên nhằm tìm kiếm loại thuốc có nguồn gốc từ thảo dược có khả kháng HSV Phương pháp: Nhuộm xanh methylen ño mật ñộ quang bước sóng 620 nm dùng để xác định tính ñộc tế bào chất thử ñối với tế bào Vero khảo sát khả kháng virus cách so sánh tế bào Vero không nhiễm virus tế bào Vero nhiễm virus Hoạt tính kháng virus biểu theo hệ số chọn lọc SI giá trị CC50/ IC50, với SI >10 có ý nghĩa trị liệu Kết kết luận: Andrographolid, neoandrographolid dehydroandrographolid ñều có khả sử dụng làm thuốc trị liệu; với hệ số SI ñối với HSV-1 HSV-2 nằm khoảng từ 12,8 ñến 63, ngoại trừ dehydroandrographolid HSV-2 Từ khoá: Diterpen lacton, andrographolid, neoandrographolid, dehydrographolid, HSV, CPE ABSTRACT STUDY ON ANTI-HERPES SIMPLEX VIRUS ACTIVITY OF DITERPEN LACTONES ISOLATED FROM ANDROGRAPHIS PANICULATA (BURM.F.) WALL EX NEES IN VITRO Hua Thi Nhu Cam, Tran Cong Luan, Huynh Thi Kim Loan, Tran Thu Hoa Background and aims:In order to study antiherpetic activity of diterpenlacton extracted from Andrographis paniculata in vitro to replace the currently antiviral agents that cause the adverse side effects associated with longterm therapy as well as and restrict the sources of resistant virus Methods:Methylene blue staining method for CPE inhibition assay and for evaluation the effects of samples on untreated Vero cells or Vero cells infected with HSV-1 or HSV-2 Antiviral activity was finally expressed as a selectivity index (SI), the value of CC50 divided by 50% inhibitory concentration (EC50) Results and conclusion:Andrographolid, neoandrographolid and dehydroandrographolid exhibit a potent antiherpetic activity with the SI of more than 12 to 63, except dehydroandrographolid on HSV-2 Key words: Diterpen lacton, andrographolid, neoandrographolid, dehydrographolid, HSV, CPE ĐẶT VẤN ĐỀ Virus Herpes simplex (HSV) tác nhân gây bệnh thường gặp, gây bệnh khác từ nhẹ ñến nặng, số trường hợp chúng gây tử vong, ñặc biệt bệnh nhân tổn thương miễn dịch Sau nhiễm trùng ban ñầu, HSV tồn ký chủ suốt toàn thời gian sống sau ñó Các ñồng ñẳng nucleosid acyclovir, penciclovir v.v…là thuốc thức phê chuẩn cho điều trị nhiễm HSV Các thuốc thường có hiệu ñiều trị nhiễm HSV ban ñầu tái nhiễm Tuy nhiên việc sử dụng tràn lan thuốc nucleosid ñã làm nảy sinh chủng HSV ñề kháng với thuốc tương ñồng, ñặc biệt bệnh nhân tổn thương miễn dịch Nhiều quốc gia có chương trình tìm kiếm thuốc từ nguồn gốc tự nhiên có tác dụng kháng virus mà độc Các nhóm hợp chất tự nhiên có tác dụng HSV týp HSV týp ña dạng ñó có nhóm diterpen lacton từ Xuyên tâm liên[8] Hợp chất diterpen lacton có Xuyên tâm liên (Andrographis paniculata (Burm.f.) Wall ex Nees) chứng minh có nhiều tác dụng chữa bệnh kháng viêm, giảm ñau, hạ huyết áp, bảo vệ gan, ngừa ñái tháo ñường, kháng virus chống ung thư,…[1, 3, 8] Nhiều chế phẩm chứa hoạt chất từ Xuyên tâm liên ñã ñược sản xuất nhằm phục vụ cho người bệnh Tuy nhiên nghiên cứu khả kháng HSV Xuyên tâm liên chưa nhiều, có cơng bố ngắn khả ức chế HSV-1 diterpen lacton, bao gồm andrographolid, neoandrographolid, dehydroandrographolid từ Xuyên tâm liên[5] Đề tài tiến hành nhằm góp phần tìm loại thuốc có nguồn gốc từ thảo dược Việt Nam có khả kháng HSV NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên vật liệu - Cao chiết methanol từ Xuyên tâm liên, ñược loại màu (chlorophill) than hoạt tính (Cao loại màu) diterpen lacton từ Xuyên tâm liên gồm andrographolid (AP), neoandrographolid (NP), dehydroandrographolid (DP) có độ tinh khiết > 98% Trung tâm Sâm Dược liệu Tp.HCM cung cấp - HSV týp týp từ bệnh phẩm ñược phân lập, ñịnh danh lưu trữ Viện Pasteur Tp.HCM - Nuôi cấy tế bào [2],[6] Sử dụng dòng tế bào Vero CCL-81 (ATCC) Ni cấy tế bào môi trường CMRL 5% huyết bào thai bê Tế bào ñược nhân ñịnh kỳ ngày Tế bào dùng gây nhiễm virus ñược nhân theo tỷ lệ x 105 tế bào/ml tạo thành lớp sau 2-3 ngày nhân ∗ Trung tâm Sâm Dược liệu Tp HCM Viện Pasteur Tp HCM, ∗∗∗ Đại học Y Dược Tp HCM Địa liên hệ: TS Trần Công Luận ĐT: 0903671323 ∗∗ Email: cong luan53@Gamail.com 142 Tạo nguồn HSV chuẩn[6] HSV ñược gây nhiễm vào tế bào Vero sau nhân 2-3 ngày, ủ tế bào 370C, quan sát tế bào ngày, tế bào có tượng CPE hồn tồn, đem đơng tan băng lần, ly tâm lấy nước nổi, bổ sung huyết bào thai bê 20%, phân chia lượng nhỏ, bảo quản -700C cho ñến làm phản ứng Xác ñịnh TCID50 (Tissue Culture Infective Dose 50%) hỗn dịch virus [6] Dựa vào tượng CPE, Xác ñịnh nồng ñộ virus gây chết 50% tế bào theo công thức Karber Chuẩn bị dịch thử Cao chiết loại chlorophill (250mg/ml), andrographolid (20mg/ml), dehydroandrographolid (10mg/ml), neoandrographolid (10mg/ml), acyclovir chuẩn (1000µg) Từ dung dịch pha lỗng mơi trường CMRL 5% huyết bào thai bê thành nhiều nồng ñộ ñể khảo sát Phương pháp nhuộm tế bào xanh methylen [5] Dựa vào bắt màu xanh methylen màng tế bào cho giá trị OD xác ñịnh Sau tiếp xúc với virus dịch thử, tế bào phiến 96 giếng ñược nhuộm xanh methylen ño mật ñộ tế bào máy ño mật ñộ quang bước sóng 620 nm Xác định tính độc tế bào chất thử ñối với tế bào Vero Cho vơ giếng 100 µl chất thử, nồng ñộ lặp lại ba lần phiến 96 giếng có tế bào Vero phủ kín thành lớp, ủ 370C, 5% CO2 48 giờ, ñổ bỏ chất khơng hấp phụ, nhuộm màu xanh methylen đo mật độ quang 620nm Tính nồng độ gây độc (CC) theo công thức CC = (A – B)/A x 100 Trong A giá trị OD chứng tế bào (tế bào không tiếp xúc với chất thử), B giá trị OD tế bào ñã ñược tiếp xúc với chất thử Xác ñịnh nồng ñộ chất thử gây độc 50% tế bào (CC50) từ phương trình tuyến tính biểu diễn phần trăm gây độc tế bào CC theo nồng ñộ chất thử Phương pháp thử nghiệm hoạt tính kháng virus Cho chất thử tiếp xúc với virus, sau cho xâm nhiễm vào tế bào [4] Nồng ñộ virus sử dụng ñể khảo sát HSV-1 -2,6 10 10-3,6; HSV-2 10-2,7 10-3,7 Tính phần trăm ức chế virus dịch thử theo công thức IC = (C – D)/(A – D) x 100 Trong C giá trị OD tế bào tiếp xúc với virus dược chất, D giá trị OD tế bào tiếp xúc với virus (chứng dương virus), A giá trị OD tế bào không tiếp xúc với virus dịch thử (chứng tế bào) Xác ñịnh nồng ñộ dược liệu ức chế 50% (IC50) xâm nhiễm virus từ phương trình tuyến tính biểu diễn IC nồng độ virus đáp ứng tốt với chất thử Chỉ số chọn lọc (hay Hệ số trị liệu) tính theo cơng thức SI = CC50/ IC50[6] KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN Xác ñịnh hiệu giá virus theo TCID50 Chỉ số TCID50 virus ñược khảo sát ñể xác ñịnh liều virus gây nhiễm 50% tế bào nuôi cấy trước sử dụng virus thử nghiệm đánh giá hoạt tính kháng virus Kết Bảng cho thấy 0,1 ml huyền dịch virus HSV-1 HSV-2 ban đầu chưa pha lỗng chứa 104,6 104,7 liều gây nhiễm 50% tế bào ni cấy (TCID50 tính 10-4,6 10-4,7) hay độ pha lỗng cho CPE 50% HSV-1 HSV-2 10-4,6 10-4,7 Như tiến hành khảo sát khả ức chế virus chất thử với nồng ñộ virus từ 10-2 ñến 10-5 Bảng Kết hiệu giá chủng virus HSV-1 HSV-2 TCID50= log [ L- d(S- 0,5)] Virus L d S 10 10 HSV-1 (S6) -1 + 10 10 + 10 10 + 10 10 + HSV-2(S8) -1 1 10 = ,1 10 10 + 10 10 -4,6 + 10 10 + 10 + 10 = ,2 -4,7 TCID50 10 /0,1ml 10 /0,1ml Khả ức chế HSV-1 HSV-2 tế bào Vero cao chiết (CLM) Kết thử nghiệm khả ức chế HSV-1 HSV-2 CLM trình bày Bảng Bảng Hệ số SI HSV-1 HSV-2 CLM 2,5 5,6, cho thấy CLM thể khả ức chế HSV-1 HSV-2, chưa có khả dùng ñiều trị Bảng Kết thể khả ức chế HSV-1 CLM Nồng ñộ cao loại màu (µg/ml) 97,7 195,3 390,6 781,3 1562,5 3125 0,51 2,4 5,87 7,81 40,06 96,9 CC -3,6 IC (10 ) PT biểu diễn CC PT biểu diễn IC 5,4 16,6 33,3 y = 0,0323x 7,5539 y = 0,0649x + 2,8691 51,3 -454 R = 0,9782 R = 0,9612 143 CC50 1781,8 IC50 726,2 Hệ số chọn lọc 2,5 (SI) Bảng Kết thể khả ức chế HSV-2 CLM Nồng độ cao loại màu (µg/ml) 97,7 195,3 390,6 781,3 1562,5 CC 0,4 -3,7 IC (10 ) PT biểu diễn CC PT biểu diễn IC 2,4 3,9 5,3 40,1 29,3 36,5 57,4 62,3 -311,1 CC50 y = 0,0326x - 8,615 R = 0,9717 y = 0,0977x + R = 0,993 18,815 1798 IC50 319,2 Hệ số chọn lọc 5,6 (SI) Khả ức chế HSV-1 HSV-2 tế bào Vero andrographolid (AP) Kết thử nghiệm khả ức chế HSV-1 HSV-2 AP trình bày Bảng Bảng Hệ số SI HSV-1 HSV-2 AP 2,8 12,8, chứng tỏ AP có khả ức chế HSV-1 HSV-2, dùng AP trị liệu HSV-2 Bảng Kết thể khả ức chế HSV-1 AP Nồng độ AP (µg/ml) 7,81 15,62 31,25 62,5 CC 125 6,96 5,53 3,42 5,75 22,88 250 500 96,79 96,91 -2,6 IC (10 ) 12,35 23,23 37,23 52,88 -120,84 -541,96 -542,64 PT biểu diễn y = 0,4426x – 19,652 R = 0,9503 CC PT biểu diễn IC y = 0,7098x + 10,63 R = 0,9558 CC50 157,4 IC50 55,5 Hệ số chọn lọc 2,8 (SI) Bảng Kết thể khả ức chế HSV-2 AP Nồng độ AP (µg/ml) 15,625 31,25 62,5 125 250 CC 6,18 8,39 9,7 10,11 49,23 -3,7 IC (10 ) 43,6 56,6 71,4 91,1 -141,3 y = 0,3895x – PT biểu diễn CC 1,8251 R = 0,9696 y = 0,8281x + PT biểu diễn IC 41,395 R = 0,9641 CC50 133,1 IC50 10,4 Hệ số chọn lọc (SI) 12,8 Khả ức chế HSV-1 HSV-2 tế bào Vero neoandrographolid (NP) Kết thử nghiệm khả ức chế HSV-1 HSV-2 NP ñược trình bày Bảng Bảng Hệ số SI HSV-1 HSV-2 AP 22,6 63,4 chứng tỏ NP có khả ức chế HSV-1 HSV-2, dùng NP trị liệu hai loại virus Bảng Kết thể khả ức chế HSV-1 NP 144 Nồng độ NP (µg/ml) 15,625 31,25 62,5 125 0,7 1,6 2,8 6,7 62,2 48,5 34,2 12,8 250 CC 14,8 -2,6 IC (10 ) -24,9 PT biểu diễn y = 0,0681x – 2,408 R = 0,9594 CC PT biểu diễn y = -0,4297x + 64,603 R = 0,9689 IC CC50 769,6 IC50 34,0 Hệ số chọn 22,6 lọc (SI) Bảng Kết thể khả ức chế HSV-2 NP Nồng độ NP (µg/ml) 15,625 31,25 62,5 125 250 CC 16,5 13,8 17,4 19,7 30,2 -3,7 IC (10 ) 55,8 22,2 14,0 - 35,2 - 78,3 PT biểu diễn CC y = 0,0521x + 13,6 R = 0,9638 y = - 0,7536x PT biểu diễn IC +58,351 R = 0,9407 CC50 698,7 IC50 11,08 Hệ số chọn lọc (SI) 63,04 Khả ức chế HSV-1 HSV-2 tế bào Vero dehydroandrographolid (DP) Kết thử nghiệm khả ức chế HSV-1 HSV-2 DP trình bày Bảng Bảng Hệ số SI HSV-1 HSV-2 DP 22,76 -54,3, chứng tỏ DP có khả ức chế HSV-1 dùng DP trị liệu virus Bảng Kết thể khả ức chế HSV-1 DP Nồng độ DP (µg/ml) CC -2,6 IC (10 ) 7,81 15,62 6,43 11,32 40,2 28,7 31,25 15,16 - 40,1 62,5 125 27,18 96,82 - 94,3 - 562,1 PT biểu diễn CC y = 0,7599x – 5,4251 R = 0,9386 PT biểu diễn IC y = - 2,5446x + R = 0,9576 58,155 72,94 3,2 22,76 CC50 IC50 Hệ số chọn lọc (SI) Bảng Kết thể khả ức chế HSV-2 DP Nồng ñộ DP (µg/ml) CC -3,7 IC (10 ) 7,81 15,62 31,25 62,5 125 4,48 10,54 14,58 33,03 96,8 29,5 18,4 -17,3 -141,1 -715,6 PT biểu diễn CC y = 0,7816x – 5,968 R = 0,9694 PT biểu diễn IC y = - 2,035x + R = 0,9889 47,315 CC50 71,6 IC50 -1,3 -54,3 Hệ số chọn lọc (SI) Khả ức chế HSV-1 HSV-2 tế bào Vero acyclorvir (ACV) 145 Khảo sát khả kháng HSV-1 HSV-2 ACV ñể làm ñối chiếu cho khảo sát mẫu thử Kết thử nghiệm khả ức chế HSV-1 HSV-2 ACV trình bày Bảng 10 Bảng 11 ACV cho hệ số SI HSV-1 HSV-2 46,9 52,3, phù hợp với hiệu ñiều trị HSV-1 HSV-2 ACV Bảng 10 Kết thể khả ức chế HSV-1 ACV Nồng độ ACV (µg/ml) 195,3 390,6 781,3 1562,5 3125 0,46 3,66 3,41 7,88 8,25 CC -3,6 IC (10 ) 62,14 46,46 -1,85 -3,17 - 49,74 PT biểu diễn CC y = 0,0033x - 0,4291 R = 0,9677 y = - 0,1113x + PT biểu diễn IC 86,295 R = 0,9908 CC50 15281,5 IC50 326,1 Hệ số chọn lọc 46,9 (SI) Bảng 11 Kết thể khả ức chế HSV-2 ACV Nồng độ ACV (µg/ml) 195,3 390,6 781,3 1562,5 3125 CC 0,3 -3,7 IC (10 ) 3,6 53,31 42 7,7 27,93 11,8 15,1 26,81 -71,36 PT biểu diễn CC y = 0,0037x + 2,6855 R = 0,976 y = - 0,0423x + PT biểu diễn IC R = 0,9839 60,345 CC50 12787,7 IC50 244,6 Hệ số chọn lọc 52,3 (SI) KẾT LUẬN Cao Xuyên tâm liên có khả ức chế HSV-1 HSV-2, khơng có ý nghĩa điều trị hệ số SI HSV-1 HSV-2 cao 2,5 5,6 Andrographolid, neoandrographolid dehydroandrographolid có khả sử dụng làm thuốc trị liệu; với hệ số SI ñối với HSV-1 HSV-2 nằm khoảng từ 12,8 ñến 63, ngoại trừ dehydroandrographolid HSV-2 Chú thích chữ viết tắt: ACV acyclovir, CC50 50% cytotoxic concentration (liều gây chết 50% tế bào nuôi cấy), HSV Herpes simplex, CPE cytopathic effect (bệnh tích tế bào), HSV herpes simplex virus, HSV-1 herpes simplex virus type 1, HSV-2 herpes simplex virus type 2, IC50: 50%Inhibitory concentration, PT: phương trình, SI: selectivity index (hệ số chọn lọc), TCID50: 50% Tissue Culture Infectious Dose (liều gây nhiễm 50% tế bào nuôi cấy) Lời cảm ơn Đề tài thực với kinh phí Bộ Y tế hỗ trợ TÀI LIỆU THAM KHẢO Calabrese, C., Berman, S.G., Babish, J.G., Ma, X., Shinto, L M., Door, et al (2000) “A phase I trail of andrographolide in HIV positive patients and normal volunteer”, Phytother Research 14, pp 333-338 Freshney, R.I (2005), Culture of animal cells: A manual of Basic Technique, Fith Edition, John Wiley & Sons, Inc, pp 199-216 Jain, D.C., Gupta, M.M., Saxena, S., Kumar, S (2000), "LC analysis of hepatoprotective diterpenoids from Andrographis paniculata", Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, pp 22, 705-709 Li, Z., Liu, J., Zhao, Y (2004), “Possible Mechanism Underlying the Antiherpetic Activity of a Proteoglycan Isolated from the Mycella of Ganoderma lucidum in vitro”, Journal Biochemistry and Molecular Biology, 38 (1), pp 34- 40 Piret J., (2002), “Comparative Study of Mechanisms of Herpes Simplex Virus Inactivation by Sodium Lauryl Sulfate and nLauroylsarcosine”, Antimicrob Agents Chemother, 46(9), pp 2933- 2942 Viện Dược liệu (2004), Cây thuốc ñộng vật làm thuốc Việt Nam, 3, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, tr 1138-1143 Wiart, C., Kumar, K., Yusof, M.Y., Hamimah, H., Fauzi Z.M and Sulaiman, M (2005), Antiviral Properties of Ent-labdene Diterpenes of Andrographis paniculata Nees, Inhibitors of Herpes Simplex Virus Type Phytother Res pp 19, 1069–1070 World Health Organization (2004), Polio Laboratory Manual, Immunization, Vaccines and Biological, 146 ... Herpes simplex, CPE cytopathic effect (bệnh tích tế bào), HSV herpes simplex virus, HSV-1 herpes simplex virus type 1, HSV-2 herpes simplex virus type 2, IC50: 50%Inhibitory concentration, PT: phương... ñược khảo sát ñể xác ñịnh liều virus gây nhiễm 50% tế bào nuôi cấy trước sử dụng virus thử nghiệm đánh giá hoạt tính kháng virus Kết Bảng cho thấy 0,1 ml huyền dịch virus HSV-1 HSV-2 ban ñầu chưa... 10-4,7 Như tiến hành khảo sát khả ức chế virus chất thử với nồng ñộ virus từ 10-2 ñến 10-5 Bảng Kết hiệu giá chủng virus HSV-1 HSV-2 TCID50= log [ L- d(S- 0,5)] Virus L d S 10 10 HSV-1 (S6) -1 + 10