Mục tiêu nghiên cứu của đề tài này nhằm khảo sát khả năng kháng virus herpes týp 1 và týp 2 của các cao chiết từ Hạ khô thảo thu hái ở Việt Nam nhằm tìm kiếm các loại thuốc mới có nguồn gốc từ thảo dược có khả năng kháng HSV.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG KHÁNG VIRUS HERPES SIMPLEX (HSV) CỦA CAO CHIẾT HẠ KHÔ THẢO (PRUNELLA VULGARIS L.) Đào Thị Kim Đính*, Huỳnh Thị Kim Loan**, Trần Thu Hoa***, Trần Cơng Luận* TĨM TẮT Mục tiêu: Khảo sát khả kháng virus herpes týp týp cao chiết từ Hạ khô thảo thu hái Việt Nam nhằm tìm kiếm loại thuốc có nguồn gốc từ thảo dược có khả kháng HSV Phương pháp: Chiết cao toàn phần, tách phân đoạn ethylacetat phân đoạn nước Hạ khô thảo Nhuộm tế bào Vero với xanh methylen đo mật độ quang bước sóng 620 nm, so sánh tế bào Vero tiếp xúc/không tiếp xúc với cao chiết, tế bào Vero không nhiễm virus tế bào Vero nhiễm virus để xác định độc tính tế bào cao chiết khả kháng virus Kết quả: Ba loại cao đạt tiêu chuẩn theo qui định độ ẩm DĐVN III Cao toàn phần phân đoạn ethylacetat phân đoạn nước Hạ khơ thảo có tác dụng ức chế HSV tốt với số hệ số chọn lọc CC50/ IC50 HSV-1 HSV-2 từ 16,29 đến 28,08 Như vậy, ba loại cao có ý nghĩa trị liệu (có hệ số chọn lọc >10) Kết luận: Cao tồn phần Hạ khơ thảo, phân đoạn ethyl acetat phân đoạn nước chứng minh có tác dụng ức chế HSV-1 HSV-2, sử dụng để làm thuốc kháng herpes hiệu Từ khóa: Hạ khơ thảo, kháng herpes, HSV-1 HSV-2 Chữ viết tắt: CC, nồng độ gây độc; CC50, liều gây chết 50% tế bào nuôi cấy; IC50, nồng độ ức chế 50% tế bào nuôi cấy; HSV, Herpes simplex virus; CPE, bệnh tích tế bào; SI, hệ số chọn lọc; TCID50, liều gây nhiễm 50% tế bào nuôi cấy ABSTRACT STUDY ON IN VITRO ANTI-HERPES SIMPLEX VIRUS ACTIVITY OF EXTRACTS FROM VIETNAMESE MEDICINAL HERB PRUNELLA VULGARIS L Dao Thi Kim Dinh, Huynh Thi Kim Loan, Tran Thu Hoa, Tran Cong Luan * Y Hoc TP Ho Chi Minh* Vol 15 - Supplement of No - 2011: 313 - 317 Objective: To investigate the in vitro antiherpetic activity of extracts from Prunella vulgaris Methods: Methylene blue staining method for CPE inhibition assay and for evaluation the effects of samples by comparison untreated Vero cells or Vero cells infected with HSV-1 or HSV-2 Antiviral activity was finally expressed as a selectivity index (SI), the value of CC50 divided by 50% inhibitory concentration (EC50) Results: Prepare water extract, ethyl acetate fraction and aqueous fraction from Prunella vulgaris L All three extracts exhibit a potent antiherpetic activity with the SI of more than 16.29 to 28.08 Conclusion: Extracts from Prunella vulgaris L are potential antiherpetic agents as herbal products Keywords: Prunella vulgaris L., Antiherpetic, HSV-1, HSV-2 Abbreviation: CC, cytotoxic concentration; CC50, 50% cytotoxic concentration; CPE, cytopathic effect; IC50, 50% Inhibitory concentration; HSV, Herpes simplex virus; SI, selectivity index, TCID50, 50% tissue culture infectious dose * Trung tâm Sâm Dược liệu Tp HCM Tác giả liên lạc: PGS.TS Trần Công Luận Chuyên Đề Dược Khoa ** ***ĐH Y Dược Tp HCM Viện Pasteur Tp HCM ĐT: 0903671323 Email: congluan53@gmail.com 313 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học ĐẶT VẤN ĐỀ Hạ khô thảo (Prunella vulgaris L Lamiaceae) mọc số vùng núi cao từ 1000 m trở lên củaViệt Nam, Tam Đảo (Vĩnh Phúc); Sa Pa, Mường Khương, Bát Sát, Bắc Hà (Lào Cai); Đồng Văn, Mèo Vạc, Quản Bạ (Hà Giang); Sìn Hồ, Tủa Chùa (Lai Châu); Mù Cang Chải (Yên Bái)(7) Thành phần hóa học Hạ khơ thảo gồm có acid triterpenoic, flavonoid, phenolic diterpen Các chất tan nước Hạ khơ thảo có tác dụng hạ huyết áp ổn định, kháng đột biến an thần Khả kháng virus herpes polysaccharid tách từ Hạ khơ thảo đặc biệt quan tâm(3) Ngồi ra, tanin (polyphenol) chiết từ Hạ khơ thảo có tác dụng kháng HIV chứng minh(5) Virus Herpes simplex (HSV) tác nhân gây bệnh thường gặp, gây bệnh khác từ nhẹ đến nặng, số trường hợp chúng gây tử vong Các thuốc nucleosid dùng điều trị nhiễm HSV thường có hiệu điều trị nhiễm HSV ban đầu tái nhiễm, nhiên việc sử dụng tràn lan thuốc làm nảy sinh chủng HSV đề kháng với thuốc tương đồng, đặc biệt bệnh nhân tổn thương miễn dịch Tìm thuốc có nguồn gốc tự nhiên có tác dụng kháng virus mà độc quan tâm, Hạ khô thảo nghiên cứu theo hướng này(3,6,9) Báo cáo nhằm chứng minh tác dụng ức chế HSV cao toàn phần, phân đoạn ethyl acetat phân đoạn nước Hạ khô thảo chưa khảo sát Việt Nam NGUYÊN LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên vật liệu - Phần mặt đất Hạ khô thảo (Prunella vulgaris L.) thu hái Phó Bảng, Hà Giang định danh Nguyễn Tập – Khoa Tài nguyên dược liệu, Viện Dược liệu (Hình 1) Nguyên liệu xác định độ ẩm, độ tro toàn phần độ tro khơng tan acid theo DĐVN III Phân tích sơ thành phần hóa thực vật phương pháp trường đại học dược Rumani có cải tiến Hình Cành mang hoa tươi cụm khô Hạ khô thảo nước cô cách thủy đến dạng cao đặc - Chiết xuất dược liệu: 100 g bột dược liệu (10,8% độ ẩm) Dùng 10 g cao tồn phần hòa đun hồi lưu lần với nước 1000C trong nước cất lắc chiết phân đoạn kỹ lần theo tỷ lệ 1:15 (dược liệu:nước) Dịch 314 Chuyên Đề Dược Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 thuật lỏng – lỏng với dung mơi từ phân cực đến phân cực thu phân đoạn ethyl acetat, n-butanol nước - Acyclovir (Sigma) - HSV týp HSV týp từ bệnh phẩm phân lập, định danh lưu trữ Viện Pasteur Tp.HCM - Tế bào Vero CCL-81 (ATCC), nuôi cấy môi trường CMRL (Gibco) có chứa 5% huyết bào thai bê Tế bào nhân định kỳ ngày Tế bào dùng gây nhiễm virus nhân theo tỷ lệ 2x105 tế bào ml-1 tạo thành lớp sau nhân 2-3 ngày Tạo nguồn HSV chuẩn HSV gây nhiễm vào tế bào Vero, ủ o 37 C, quan sát tế bào ngày, tế bào có tượng CPE hồn tồn, đem đơng tan băng lần, ly tâm lấy nước nổi, bổ sung 20% huyết bào thai bê bất hoạt, phân chia lượng nhỏ 1ml, bảo quản -70oC làm phản ứng Xác định hiệu giá TCID50 hỗn dịch virus(8) Dựa vào tượng CPE xác định TCID50 theo công thức Karber Log TCID50 = L - d(S-0,5), với L: log độ pha loãng thấp dung thử nghiệm, d: tỷ lệ khác biệt độ pha loãng, S: tổng tỷ lệ giếng dương tính giếng gây nhiễm nồng độ virus Kỹ thuật nhuộm tế bào xanh methylen thực theo qui trình cơng bố(4) Chuẩn bị dịch thử Các cao chiết toàn phần phân đoạn chiết Hạ khô thảo pha môi trường CMRL cho dung dịch mẹ có nồng độ 20 mg ml-1; acyclovir pha mơi trường CMRL cho dung dịch mẹ có nồng độ mg/ml Từ dung dịch mẹ, pha lỗng mơi trường CMRL thành nhiều nồng độ để khảo sát Xác định tính độc tế bào chất thử tế bào Vero(1,4) Cho vô giếng 100 µl nồng độ chất thử, nồng độ lặp lại ba lần phiến Chuyên Đề Dược Khoa Nghiên cứu Y học 96 giếng có tế bào Vero phủ kín thành lớp, ủ 370C, 5% CO2 48 giờ, đổ bỏ chất không hấp phụ, nhuộm màu xanh methylen đo mật độ quang 620 nm Tính nồng độ gây độc (CC) theo công thức CC = (A – B)/A x 100 Trong A giá trị OD chứng tế bào (tế bào không tiếp xúc với chất thử), B giá trị OD tế bào tiếp xúc với chất thử Xác định nồng độ chất thử gây độc 50% tế bào (CC50) từ phương trình tuyến tính biểu diễn phần trăm gây độc tế bào CC theo nồng độ chất thử Phương pháp thử nghiệm hoạt tính kháng virus Cho chất thử tiếp xúc với virus, sau cho xâm nhiễm vào tế bào(2) Nồng độ virus sử dụng để khảo sát HSV-1 HSV-2 dựa vào hiệu giá TCID50 Tính phần trăm ức chế virus dịch thử theo công thức IC = (C – D)/(A – D) x 100 Trong C giá trị OD tế bào tiếp xúc với virus cao chiết, D giá trị OD tế bào tiếp xúc với virus (chứng virus), A giá trị OD tế bào không tiếp xúc với virus dịch thử (chứng tế bào) Xác định nồng độ dược liệu ức chế 50% (IC50) xâm nhiễm virus từ phương trình tuyến tính biểu diễn IC nồng độ virus đáp ứng tốt với chất thử Chỉ số chọn lọc SI (hay Hệ số trị liệu) tính theo cơng thức SI = CC50/ IC50(1) KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Đặc tính dược liệu Bột dược liệu có độ ẩm 11,47 ± 0,04, đạt tiêu chuẩn theo qui định độ ẩm DĐVN III (không 13%) Độ ẩm cao toàn phần 10,83 ± 0,03, quy định DĐVN III áp dụng cho cao đặc khơng q 20%; độ tro tồn phần 10,12 ± 0,05 độ tro không tan acid 1,18 ± 0,009 Kết phân tích sơ thành phần hóa thực vật bột Hạ khơ thảo có tinh dầu, carotenoid, triterpenoid, anthraquinon, polyphenol, saponin, acid hữu cơ, chất khử polyuronic, điều phù hợp với nghiên cứu trước 315 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 dây Namba, 1994(3) Từ 100 g bột dược liệu thu 32,43 g cao tồn phần Cao tồn phần Hạ khơ thảo có nhiều polyphenol, triterpenoid chất khử, nhiều tinh dầu, acid hữu polyuronic, có carotenoid, anthraquinon saponin Từ 10 g cao toàn phần thu 0,50 g cao phân đoạn ethyl acetat, 1,61 g cao phân đoạn n-butanol 7,82 g cao phân đoạn nước Xác định hiệu giá virus theo TCID50 Kết xác định hiệu giá TCID50 HSV-1 HSV-2 theo bảng Như tiến hành khảo sát khả ức chế virus chất thử với nồng độ virus HSV-1 từ 103,6, 104,6 105,6; HSV-2 từ 103,7, 104,7 105,7 Bảng Kết hiệu giá chủng virus HSV-1 HSV-2 dùng thử nghiệm TCID50= log [ L- d(S- 0,5)] HSV-1 (S6) HSV-2(S8) -4,8 10 /0,1ml 10-4,2/0,1ml Virus TCID50 L: Log độ pha loãng thấp dùng thử nghiệm; d: Sự khác độ pha lỗng; S: [Tổng tỷ lệ giếng hình thành đám hoại tử] x [tổng số giếng tiếp xúc]-1 Khả ức chế HSV-1 HSV-2 tế bào Vero Các cao Hạ khơ thảo bao gồm cao tồn phần, phân đoạn ethyl acetat phân đoạn nước có số SI HSV-1 HSV-2 nằm khoảng từ 16,29 đến 28,08; riêng phân đoạn nbutanol có số SI < 10 Như vậy, cao Hạ khô thảo có khả ức chế HSV-1 HSV-2 tốt, đặc biệt phân đoạn nước so với acyclovir (Bảng 2) Kết phù hợp với công bố Hong-Xi cộng (1999) polysaccharid kiềm tách từ dịch chiết nước nóng Hạ khơ thảo có khả ức chế HSV1 HSV-2(3) Công bố Zhang cộng cho thấy phức hợp lignin–carbohydrat từ dịch chiết nước cụm hoa (spike) có khả kháng mạnh HSV-1 HSV-2 theo tác động ức chế trình bám đính truyền vào tế bào virus, kể chủng HSV-1 đề kháng acyclovir(9) Tuy nhiên phân đoạn ethyl acetat với thành phần polyphenol chiếm ứu có số SI HSV-1 HSV-2 nằm khoảng từ 17,76 đến 19,46 tương đương với SI cao tồn phần Điều cho thấy ngồi nhóm hợp chất polysaccharid thể tác dụng ưu kháng HSV-1 HSV-2 có nhóm hợp chất khác phân đoạn ethyl acetat có tác dụng Nhóm hợp chất nhóm polyphenol phân tích đề cập đến theo cơng bố Nolkemper cộng (2006)(6) với hai hợp chất acid rosmarinic acid caffeic Nhưng nhóm chất dường khơng có hiệp lực với nhóm hợp chất polysaccharid làm cho khả ức chế HSV1 HSV-2 cao toàn phần thấp so với phân đoạn nước mà thành phần chủ yếu nhóm polysaccharid Đây vấn đề chưa đề cập trước cần có nghiên cứu sâu để làm sáng tỏ Bảng Kết khả ức chế HSV-1 HSV-2 Hạ khô thảo CC50 (μg/ml) Cao toàn phần Cao ethyl acetat Cao n-butanol Cao nước Acyclovir 170,48 191,31 81,08 307,03 1531,03 HSV-1 IC50 10,47 10,77 29,06 11,31 6,82 KẾT LUẬN Cao tồn phần Hạ khơ thảo, phân đoạn ethyl acetat phân đoạn nước chứng 316 HSV-2 SI 16,29 17,76 2,79 27,15 224,51 IC50 8,22 9,83 30,74 10,49 5,49 SI 20,74 19,46 2,64 28,08 279,07 minh có tác dụng ức chế HSV-1 HSV-2 lựa chọn hợp lý việc làm thuốc kháng herpes Cảm ơn: Đề tài thực với kinh phí Bộ Y tế hỗ trợ Chuyên Đề Dược Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 TÀI LIỆU THAM KHẢO Dargan D.J (1998), Investigation of the anti-HSV activity of candidate antiviral agents, Methods in Molecular Medrone, Vol 10 Herpes simplex virus Protocols, 387-405 Freshney R I (2005), Culture of animal cells: A manual of basic technique, Fith Edition, John Wiley & Sons, Inc, 199-216 Hong-Xi X., Spencer H.S L., Song F L., Robert L W., Jonathan B (1999) Isolation and characterization of an antiHSV polysaccharide from Prunella vulgaris Antiviral Res., 44, 43-54 Hứa Thị Như Cẩm, Trần Công Luận, Huỳnh Thị Kim Loan, Trần Thu Hoa (2010) Nghiên cứu tác dụng kháng virus herpes simplex (HSV) diterpen lacton từ Xuyên tâm liên Tạp chí Y học Tp Hồ Chí Minh, 14, 142-146 Liu S., Jiang S., Wu Z., Lin L., Zhang J., Zhu Z., Wu S (2002) Identification of inhibitors of the HIV-1 gp41 six-helix bundle Chuyên Đề Dược Khoa Nghiên cứu Y học formation from extracts of Chinese medicinal herbs Prunella vulgaris and Rhizoma cibotte Life Sciences, 71, 1779–1791 Nolkemper S., Reichling J., Stintzing F.C., Carle R., Schnitzler P (2006) Antiviral effect of aquueous extracts from species of the Lamiaceae family against Herpes simplex type and type in vitro Planta med., 72, 1378-1382 Võ Văn Chi (1999) Từ điển thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y Học, Hà Nội World Health Organization (2004) Polio laboratory manual, immunization, vaccines and biologicals, 4th Edit., 76-78 Zhang Y., But P.P.H., Ooi V.E.C., Xu H.X., Delaney G.D., Lee S.S.H, Lee S.F (2007) Chemical properties, mode of action, and in vivo anti-herpes activities of a lignin–carbohydrate complex from Prunella vulgaris Antiviral Research 75, 242– 249 317 ... herpes polysaccharid tách từ Hạ khơ thảo đặc biệt quan tâm(3) Ngồi ra, tanin (polyphenol) chiết từ Hạ khơ thảo có tác dụng kháng HIV chứng minh(5) Virus Herpes simplex (HSV) tác nhân gây bệnh thường... Hạ khơ thảo gồm có acid triterpenoic, flavonoid, phenolic diterpen Các chất tan nước Hạ khơ thảo có tác dụng hạ huyết áp ổn định, kháng đột biến an thần Khả kháng virus herpes polysaccharid tách... polysaccharide from Prunella vulgaris Antiviral Res., 44, 43-54 Hứa Thị Như Cẩm, Trần Công Luận, Huỳnh Thị Kim Loan, Trần Thu Hoa (2010) Nghiên cứu tác dụng kháng virus herpes simplex (HSV) diterpen lacton