Trong nghiên cứu so sánh bệnh nhân ung thư dạ dày và nhóm tình nguyện, các đoạn VNTR ngắn hơn có liên quan đến ung thư dạ dày ở MUC1[7] và MUC6[6]. Ảnh hưởng này có thể phần nào đó là do sự thay đổi về mức độ nhạy cảm với tình trạng nhiễm H. pylori, vì H. pylori là yếu tố quan trọng trong nguyên nhân ung thư dạ dày[8].
Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ - số 2(50)/năm 2009 SỰ ĐA DẠNG CỦA KIỂU GEN MUC5AC KHÔNG ẢNH HƯỞNG ĐẾN TRẠNG NHIỄM H PYLORI Y- Dược học TÌNH Nguyễn Văn Thái - Phạm Hùng Lực (Trường Đại học Y Dược Cần Thơ) Phần giới thiệu Lớp nhày dày bảo vệ lớp tế bào biểu bì chống lại acid dày, men phân hủy protein, chấn thương lí hóa vi sinh vật gây bệnh Thành phần lớp nhày glycoprotein lớn có tên mucin Có nhiều loại mucin khác nhau, dày có loại mucin1, mucin5AC mucin6[1] Tất loại mucin bao gồm khung polypeptide gắn chuỗi oligosaccharide bên cạnh, chuỗi có vai trò định khả bảo vệ mucin tác nhân lí hóa[2] Một điều đáng quan tâm có khác biệt cá thể số chuỗi bên Điều xảy đa dạng VNTR gen mã hóa mucin Các VNTR bao gồm hệ lập lại DNA số lần lập lại có khác biệt cao Kết có lập lại trình tự amino acid phần trung tâm khung polypeptide, khung để oligosaccharide gắn vào Vì vậy, đa dạng dẫn tới việc tạo polypeptide mucin có khác biệt chiều dài glycosyl hóa[4-5] Do vậy, đa dạng ảnh hưởng đến khả bảo vệ mucin Do hệ mặt cấu trúc có ý nghĩa đa dạng VNTR, số nghiên cứu tìm hệ mặt sinh lí bệnh Trong nghiên cứu so sánh bệnh nhân ung thư dày nhóm tình nguyện, đoạn VNTR ngắn có liên quan đến ung thư dày MUC1[7] MUC6[6] Ảnh hưởng phần thay đổi mức độ nhạy cảm với tình trạng nhiễm H pylori, H pylori yếu tố quan trọng nguyên nhân ung thư dày[8] Vinall cộng sự[9] chứng minh cặp allele ngắn MUC1 có liên quan đến nhiễm H pylori, gần kết tương tự báo cáo cho MUC6[10] Tuy nhiên, chưa có cơng bố ảnh hưởng đa dạng VNTR gen MUC5AC tình trạng nhiễm H pylori MUC5AC quan trọng Van den Brink cộng cho thấy H pylori dễ định vị MUC5AC[11] Hơn nữa, MUC5AC thụ thể H pylori[12-13] Vì vậy, mục tiêu nghiên cứu tìm hiểu ảnh hưởng đa dạng VNTR MUC5AC tình trạng nhiễm H pylori Phương pháp nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu Từ tháng đến tháng 12/2003 tất bệnh nhân có triệu chứng tiêu hóa đến khám phòng khám tiêu hóa bệnh viện Đa khoa Cần Thơ có định nội soi mời tham gia nghiên cứu Chẩn đoán dựa vào quan sát nội soi Bệnh nhân điều trị tiệt trừ H pylori trước đồng ý viết tờ tự nguyện tham gia nghiên cứu đưa vào nhóm nghiên cứu Bảng thu thập số liệu ban đầu gồm có tuổi, giới, nghề nghiệp, thói quen hút thuốc, uống rượu Chẩn đốn nhiễm H pylori Nhiễm H pylori chẩn đoán thử nghiệm qua thở sử dụng 14 C đánh dấu (Thụy Điển) Bệnh nhân không phép sử dụng thuốc ức chế bơm proton thuốc kháng H2 kháng sinh tuần trước làm xét nghiệm Sáng bệnh nhân nhịn đói qua đêm, uống viên thuốc có urê với 14 C đánh dấu 50ml nước 10 phút sau bệnh Tạp chí Khoa học & Công nghệ - số 2(50)/năm 2009 Y- Dược học nhân thổi vào bọc có sẵn thử nghiệm, đưa vào máy phân tích phóng xạ phút Nếu đo 50 đơn vị H pylori (+), < 25 đơn vị âm tính, từ 25 - 50 nghi ngờ Xác định chiều dài cặp alelle MUC5AC Mẫu máu lấy để ly trích DNA(Bộ kit Gentra systems, Minneapolis, Mỹ) Chiều dài đoạn alelle MUC5AC đo phân tích Southern blot Mẫu DNA cắt men SacI mô tả trước Escande cộng sự[14] Men cắt bên phạm vi lập lại bộc lộ rõ đa dạng VNTR MUC5AC Các đoạn DNA tách thạch agarose (0.7% agarose in 0.04M Tris, 0.001M EDTA, pH 8.0) 35V 18 Chúng tơi dùng -HindIII marker chiều dài đoạn DNA Sau đoạn DNA đưa vào màng nylon (Gene Screen PlusTM hybridization transfer membrane, Boston, USA) Sau đó, màng nylon xử lí xạ tia cực tím chuẩn bị lại môi trường đệm Church Probe bao gồm phần giàu cysteine tạo PCR với mồi nhử 5’-ACCAGCACAAGCCATCTTTC-3’ and reverse primer 5’-CAGGGAAGGATACAGAGCATTG-3’ đánh dấu ngẫu nhiên a-32PdCTP Các sản phẩm sau làm PCR xác định theo trình tự Sau 18 nhân probe lên chất đệm chứa phosphate 0,5M 7% SDS 0.001M EDTA, dung dịch SSPE/SDS dùng loại bỏ probe không chuyên biệt Sử dụng λ III tham khảo, chiều dài đoạn allele MUC5AC riêng biệt tính tốn theo TotallabTM (Nonlinear Dynamics) Phân tích số liệu Kết ban đầu nghiên cứu có hay khơng có diện H pylori Những đặc điểm nhóm bệnh nhân nhiễm hay không nhiễm so sánh với sử dụng test chi bình phương t test sau cho phù hợp Phân bố chiều dài đoạn alelle MUC5AC so sánh nhóm nhiễm khơng nhiễm H pylori Ngồi ra, biểu đồ dạng chấm kết hợp khác biệt (ví dụ kiểu gen) chiều dài đoạn alelle MUC5AC cấu trúc để thấy kiểu khác biệt hình ảnh cho bệnh nhân nhiễm không nhiễm H pylori Ý nghĩa thống kê xác định với p < 0.05 Những giá trị loại trừ phân tích, tồn phân tích thực phần mềm thống kê SAS (Viện SAS, Mỹ) Kết nghiên cứu Mẫu nghiên cứu Có 170 bệnh nhân đưa vào nghiên cứu (tuổi trung bình 43, 35% nam, 52% bị nhiễm H pylori) Bảng cho thấy bệnh nhân nhiễm khơng nhiễm H pylori có đặc điểm giống nhau, có khác biệt tuổi Chiều dài đoạn alelle MUC5AC Hình chiều dài đoạn alelle MUC5AC cắt men SacI phân bố từ 6.2 đến 11.2 kbp Tuy nhiên, chủ yếu (92%) tập trung khoảng hẹp từ - 9kbp Cùng với hình ảnh số lần lặp lại ước lượng việc trừ phạm vi khơng VNTR vị trí cắt (tồn 2.1kbp) từ chiều dài đoạn alelle chia cho chiều dài lặp lại đơn (24bp) Có thể tính số lặp lại mức từ 170 - 380 (trung bình 243) Trong nghiên cứu trước đây, chiều dài đoạn alelle MUC6 đo bệnh nhân mẫu nghiên cứu chúng tơi Hình cho thấy, chiều dài đoạn alelle MUC5AC chiều dài đoạn alelle MUC6 độc lập Tạp chí Khoa học & Công nghệ - số 2(50)/năm 2009 Y- Dược học Chiều dài đoạn alelle MUC5AC tình trạng nhiễm H pylori Chiều dài trung bình đoạn MUC5AC xác định bệnh nhân nhiễm không nhiễm H pylori (7.9 so với 7.9) Hình cho thấy, phân bố chiều dài đoạn MUC5AC giống nhóm (p = 0.7) Hình trình bày biểu đồ chấm kết hợp khác biệt (ví dụ kiểu gen) chiều dài đoạn alelle MUC5AC cho bệnh nhân nhiễm không nhiễm H pylori riêng biệt Chiều dài đoạn alelle nhỏ (trục) chấm chống lại với chiều dài đoạn alelle dài (trục) Vì vậy, vùng khác trống Kích thước biểu tượng tương quan với số bệnh nhân có kiểu gen đặc biệt Khi so sánh hình ảnh cho thấy khơng có khác biệt phát nhóm bệnh nhân nhiễm khơng nhiễm H pylori Hình Sự phân bố chiều dài cặp allele MUC5AC SacI Hình Sự phân bố chiều dài cặp allele MUC5AC bệnh nhân H pylori (-) (+) Hình Biểu đồ hình chấm kiểu gene MUC5AC bệnh nhân H pylori (-) (+) Bả ng Những đ ặ c đ iể m bả n bệ nh nhân có H pylori (-) (+) Tuổi trung bình (SD)* Nam Giới Nữ Có Hút thuốc Khơng Có Uống rượu Khơng Số (%) H pylori(+) (n=89) 46 (12) 28 (47%) 61 (55%) 22 (51%) 67 (53%) 17 (53%) 72 (52%) * Số (%) H pylori(-)(n=81) 39 (13) 31 (53%) 50 (45%) 21 (49%) 60 (47%) 15 (47%) 66 (48%) p