Nội dung bài viết trình bày về protein vỏ E2 tái tổ hợp của virut Chikunguya (CHIKV) được biểu hiện trên hệ E.coli và ứng dụng trong phương pháp ELISA phát hiện kháng thể kháng CHIKV. Protein tái tổ hợp phát hiện IgG của CHIKV với tỷ lệ 58,6% khi so sánh với phương pháp miễn dịch huỳnh quang trên 29 mẫu dương tính với CHIKV bằng phương pháp ELISA.
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2013 NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PROTEIN E2 TÁI TỔ HỢP CỦA VIRUT CHIKUNGUNYA PHÁT HIỆN KHÁNG THỂ KHÁNG VIRUT CHIKUNGUNYA BẰNG PHƢƠNG PHÁP ELISA Vũ Xuân Nghĩa*; Axel Rethwilm** TÓM TẮT Protein vỏ E2 tái tổ hợp virut Chikunguya (CHIKV) biểu hệ E.coli ứng dụng phương pháp ELISA phát kháng thể kháng CHIKV Protein tái tổ hợp phát IgG CHIKV với tỷ lệ 58,6% so sánh với phương pháp miễn dịch huỳnh quang 29 mẫu dương tính với CHIKV phương pháp ELISA Kết cho thấy, protein vỏ E2 ứng dụng chẩn đốn huyết học * Từ khóa: CHIKV; Protein tái tổ hợp APPLICATION OF CHIKUNGUNYA VIRUS E2 RECOMBINANT PROTEIN TO DETECT CHIKUNGUNYA VIRUS IgG BY ELISA summary Chikungunya virus E2 recombinant protein was expressed in E.coli system and applied in ELISA to detect Chikungunya IgG The recombinant protein identified CHIKV IgG with 58.6% when comparing with immunofluorescence assay in 30 positive CHIKV sera by ELISA The results showed the recombinant protein could be applied in serology assays * Key words: CHIKV; The recombinant protein ĐẶT VẤN ĐỀ Virut Chikungunya Alphavirus, thuộc họ Togaviridea CHIKV gây vụ dịch sốt xuất huyết với biểu hiện: sốt cao, phát ban đau đa khớp [4] CHIKV truyền bệnh thông qua vector muỗi Ae agypti Ae albopictus [1, 3] Genome CHIKV có độ lớn khoảng 12 kb, chứa gen mã hóa cho protein không cấu trúc protein cấu trúc Protein cấu trúc gồm capsid protein hai protein vỏ E1, E2 [5] Protein tái tổ hợp có nhiều ưu ứng dụng rộng rãi chẩn đoán huyết học Vì vậy, nghiên cứu này, protein tái tổ hợp E2 CHIKV ứng dụng chẩn đoán huyết học ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu - Chứng dương: 29 mẫu huyết tương chứa IgG CHIKV, chuẩn hóa phương pháp miễn dịch huỳnh quang từ Berhard Nocht Institut (BNI), Đại học Humburg (CHLB Đức) * Học viện Quân y ** Đại học Tổng hợp Wuerzburg, CHLB Đức Chịu trách nhiệm nội dung khoa học: PGS TS Trịnh Thị Xn Hòa PGS TS Nguyễn Lĩnh Tồn 39 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2013 - Chứng âm: 100 mẫu huyết tương người Đức khỏe mạnh bình thường, từ Viện Virut-Miễn dịch học, Đại học Wuerzburg (CHLB Đức) - Protein E2 tái tổ hợp biểu tinh hệ E.coli Phƣơng pháp nghiên cứu * Phương pháp biểu tinh protein tái tổ hợp E2: Vector pET200/D-recombinant E2 protein biến nạp vào tế bào BL21 star, nuôi tế bào 50 ml môi trường LB với kanamycine 50 μg/ml qua đêm 370C máy lắc Ngày hôm sau, pha dung dịch nuôi cấy với LB-Kana-medium tiếp tục nuôi đến giá trị OD600 = 0,6 Để biểu protein, cho IPTG vào dung dịch nuôi cấy với nồng độ cuối mM Thu vi khuẩn sau phá hủy dung dịch đệm B (100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris-HCl, M urea, pH 8,0) Ly tâm dung dịch tế bào 30 phút, 13.000 rpm máy siêu ly tâm rotor SS34, loại phần cặn tế bào khơng hòa tan Trộn phần nước chứa protein tái tổ hợp với Ni-NTA-agarose beads theo tỷ lệ 1:10 Rửa hỗn dịch với ml dung dịch đệm C (100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris-HCl, M urea, pH 6,3) tách tinh protein tái tổ hợp 0,5 ml dung dịch đệm D (100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris-HCl, M urea, pH 5,9 ) dung dịch đệm E (100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris-HCl, M urea, pH 4,5) Phân tích protein tái tổ hợp phương pháp điện di protein SDS-PAGE nhuộm Coomassie blue Western blot sử dụng monoclonal anti-HIS-antibodies * Phương pháp ELISA gián tiếp đánh giá khả phát IgG protein tái tổ hợp E2: Pha loãng protein PBSN (phosphate dung dịch đệm saline natriumazid) nồng độ 220 μg/ml Ủ 50 μl dung dịch protein pha loãng giếng đĩa ELISA Sau đó, phủ kín đĩa plastic ủ qua đêm 40C Ngày hôm sau, bỏ dịch ủ, rửa đĩa lần với nước cất không ion Tiến hành bước block ủ với 50 μl blocking dung dịch đệm 30 phút nhiệt độ phòng Rửa đĩa lần với nước cất không ion Ủ với huyết tương chứng dương kháng thể cho 50 μl huyết tương chứng dương vào giếng (pha loãng huyết tương dung dịch blocking dung dịch đệm, tỷ lệ 1:100) Che phủ với plastic, ủ nhiệt độ phòng Rửa đĩa lần với nước cất không ion Thêm 50 μl kháng thể thứ (IgG), pha loãng 1:5.000 dung dịch blocking dung dịch đệm Che phủ đĩa với plastic ủ nhiệt độ phòng Rửa đĩa lần với nước cất không ion Cho phụ gia đo kết pipet 75 μl NPP (p-nitrophenyl phosphate) vào giếng, ủ nhiệt độ phòng Sau phát triển màu (màu vàng), đọc đĩa máy ELISA bước sóng 405 nm KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Để phát triển phương pháp chẩn đoán huyết học, protein tái tổ hợp 41 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2013 biểu ứng dụng phát kháng thể kháng CHIKV bệnh nhân nhiễm CHIKV Kết biểu tinh protein E2 tái tổ hợp CHIKV Quá trình tinh thu phân đoạn protein tái tổ hợp CHIKV Phân tích tồn phân đoạn protein tái tổ phương pháp điện di protein SDS-PAGE nhuộm Coomassie blue (hình 1) Western blot (hình 2) phân đoạn rửa (cột - 4) phân đoạn tách protein với dung dịch đệm D (cột - 8); dung dịch đệm E (cột - 12) Cột 1: protein marker Cả hai phương pháp phân tích thấy: protein thu phù hợp với kích thước protein E2 tái tổ hợp Protein bắt đầu tách khỏi hỗn dịch phân đoạn sử dụng dung dịch đệm D Khi tách với dung dịch đệm E, protein tái tổ hợp tách nhiều (cột - 12, hình 2) Trong trình tinh với dung dịch đệm E xuất band không phù hợp (các protein E.coli khơng đặc hiệu, cột - 12, hình 2) Nhưng phân đoạn tách với dung dịch đệm D (cột - 8, hình 2), protein đặc hiệu Kết ELISA Hình 1: Phân tích protein tái tổ hợp E2 phương pháp điện di protein SDS-PAGE Vi khuẩn phá vỡ sau kích hoạt IPTG (cột 2); phân đoạn rửa (cột - 4) phân đoạn tách protein với dung dịch đệm D (cột - 8); dung dịch đệm E (cột - 12) Cột 1: protein marker Elution W Buffer D Buffer E E2 Hình 2: Phân tích phân đoạn tinh kỹ thuật Western blot với monoclonal Histag antibody hòa tan PBS 1:10.000 Phá vỡ vi khuẩn sau kích hoạt IPTG (cột 2); Protein tái tổ hợp E2 dùng thử nghiệm với 29 mẫu huyết tương dương tính IgG CHIKV 100 mẫu huyết tương người Đức khỏe mạnh bình thường theo phương pháp ELISA Protein tái tổ hợp E2 cho thấy khả phát kháng thể kháng CHIKV IgG 58,6% 29 mẫu huyết tương dương tính (17/29) cho kết âm tính nhóm chứng âm Kết quả, protein tái tổ hợp E2 có khả phát tốt kháng thể kháng CHIKV Trong phương pháp trung hòa thực chuột thấy E2 có khả sinh đáp ứng kháng thể bảo vệ chuột chống lây nhiễm virut [2] Tuy nhiên, so sánh với phương pháp IFA từ BNI Hamburg, protein tái tổ hợp E2 phương pháp ELISA phát Sự khác biệt kết phương pháp khác biệt dòng CHIKV 42 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2013 khác biệt cấu trúc epitops diện virut protein tái tổ hợp Hơn nữa, phương pháp IFA, protein tiền thân protein cấu trúc diện E2 KẾT LUẬN Protein tái tổ hợp E2 CHIKV biểu ứng dụng phát IgG virut CHIKV phương pháp ELISA gián tiếp Kết cho thấy, protein tái tổ hợp biểu tốt hệ E.coli có khả phát tới 58,6% lưu hành kháng thể IgG kháng CHIKV phương pháp ELISA Kết mở hướng phát triển kít chẩn đốn huyết học với protein tái tổ hợp Mathews JH and Roehrig JT Determination of the protective epitopes on the glycoproteins of Venezuelan equine encephalomyelitis virus by passive transfer of monoclonal antibodies The Journal of Immunology 1982, Vol 129, Issue 6, pp.2763-2767 Mourya.D.T, Yadav, P Vector biology of Dengue & Chikungunya viruses Indian 2006, 15, 368 (9531), pp.186-187 Queyriaux, B, Simon, F, Grandadam, M, Michel, R, Tolou, H, Boutin, J.P Clinical burden of Chikungunya virus infection Lancet Infect Dis 2008, (1), pp.2-3 Simizu, B, Yamamoto, K, Hashimoto, K, Ogata, T Structural proteins of Chikungunya virus J Virol 1984, 51, pp.254-258 TÀI LIỆU THAM KHẢO Bodenmann, P, Genton, B Chikungunya: an epidemic in real time Lancet 2006, 368, p.258 Clinical burden of chikungunya virus infection Lancet Infect Dis 8, pp.2-3 Ngµy nhËn bài: 15/10/2012 Ngày giao phản biện: 5/1/2013 Ngày giao th¶o in: 6/2/2013 43 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2013 44 ... LUẬN Protein tái tổ hợp E2 CHIKV biểu ứng dụng phát IgG virut CHIKV phương pháp ELISA gián tiếp Kết cho thấy, protein tái tổ hợp biểu tốt hệ E.coli có khả phát tới 58,6% lưu hành kháng thể IgG kháng. .. thấy E2 có khả sinh đáp ứng kháng thể bảo vệ chuột chống lây nhiễm virut [2] Tuy nhiên, so sánh với phương pháp IFA từ BNI Hamburg, protein tái tổ hợp E2 phương pháp ELISA phát Sự khác biệt kết phương. .. biểu ứng dụng phát kháng thể kháng CHIKV bệnh nhân nhiễm CHIKV Kết biểu tinh protein E2 tái tổ hợp CHIKV Quá trình tinh thu phân đoạn protein tái tổ hợp CHIKV Phân tích toàn phân đoạn protein tái