Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm chế tạo que thử nhanh phát hiện độc tố vi khuẩn tả. Kết quả nghiên cứu cho thấy học viện Quân y đã bước đầu chế tạo thành công que thử nhanh phát hiện độc tố CTX của vi khuẩn tả. Que thử nhanh có giá thành thấp, dễ sử dụng, khả năng áp dụng cao.
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015 NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO TEST THỬ NHANH PHÁT HIỆN ĐỘC TỐ VI KHUẨN TẢ Phạm Đức Minh*; Hoàng Văn Lương* TãM T¾T Mục tiêu: chế tạo que thử nhanh phát độc tố vi khuẩn tả (VKT) Đối tượng phương pháp nghiên cứu: sử dụng kháng thể đơn dòng kháng độc tố CTX VKT Que thử dựa nguyên lý phản ứng miễn dịch kháng nguyên - kháng thể xảy màng mỏng Có đối chiếu với kỹ thuật ELISA mẫu nhiễm CTX Kết quả: que thử có khả phát độc tố CTX nồng độ 50 ng/ml có độ đặc hiệu 100% Ở nồng độ 50 ng/ml 25 ng/ml độc tố CTX mẫu thử, que thử có độ nhạy 95% 53% so với kỹ thuật ELISA Que thử nhanh có giá thành thấp, dễ sử dụng, khả áp dụng cao thực tiễn y học cộng đồng Kết luận: Học viện Quân y bước đầu chế tạo thành công que thử nhanh phát độc tố CTX VKT Que thử nhanh có giá thành thấp, dễ sử dụng, khả áp dụng cao * Từ khóa: Vibrio cholerae; Độc tố tả; Que thử nhanh Studying Development of Rapid Test to Detect Vibrio Cholerae Toxin Summary Objective: Production of test strips for rapid detection of Cholera toxin Subjects and methods: The study used monoclonal antibodies against CTX toxin of Vibrio cholerae The strips based on the principle of antigen-antibody immune response occur on thin films The result will be compared to ELISA in samples infected with CTX Results: The strips have the ability to detect CTX toxin at concentrations of 50 ng/mL and a specificity of 100% At the concentration of 50 ng/mL and 25 ng/mL of CTX toxin in the sample, the test strip has a sensitivity of 95% and 53%, respectively, compared to ELISA The strips are low cost, easy to use, and have high applicability in medicine practice and community Conclusion: Military Medical University has initial successfully made the rapid test strips to detect CTX toxin of Vibrio cholerae The strips are low cost, easy to use, and have high applicability in medicine practice and community * Key words: Vibrio cholerae; CTX; Rapid test ĐẶT VẤN ĐỀ Vi khuẩn tả mầm bệnh nguy hiểm, sinh độc tố gây dịch tiêu chảy cấp [1, 7] Độc tố VKT có nguy sử dụng trực tiếp vũ khí sinh học nguy hiểm [4] Hiện Việt Nam có vắcxin phòng bệnh tả, hiệu đạt từ 66 - 90% [6] chưa phổ biến Chẩn đốn nhanh * Häc viƯn Qu©n y Người phn hi (Corresponding): Phạm Đức Minh (drminh103@yahoo.com) Ngy nhn bi: 15/01/2015; Ngày phản biện đánh giá báo: 22/01/2015 Ngày báo đăng: 26/01/2015 18 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QN SỰ SỐ 2-2015 xác mẫu có chứa độc tố CTX VKT giúp ích cho q trình phát hiện, điều trị dự phòng ngộ độc độc tố VKT [3, 4] Hiện nay, que thử nhanh chiếm ưu ứng dụng y học lĩnh vực liên quan [3] Que thử nhanh Singer J M Plotz C M (1956) [8] nghiên cứu phát triển, cải tiến nhiểu Với ưu điểm giá thành thấp, dễ áp dụng, độ xác cao, que thử nhanh mục tiêu nhiều phòng thí nghiệm công ty sản xuất sản phẩm liên quan đến sinh học phân tử Học viện Quân y quản lý dây chuyền sản xuất que thử nhanh Hệ thống nhập từ Công ty Arista (Hoa Kỳ), có khả hoạt động tự động hồn tồn bán tự động Hiện có số phương pháp thường dùng để phát VKT độc tố thực phẩm, bao gồm nuôi cấy, phương pháp ELISA, phương pháp khuếch đại gen (PCR), que thử nhanh [1, 3, 4] Trong đó, que thử có ưu sàng lọc ưu tiên sử dụng Xuất phát từ yêu cầu đó, đề tài thực nhằm: Chế tạo que thử nhanh phát độc tố CTX VKT ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu Trong nghiên cứu chúng tơi chọn nhóm vi khuẩn sau: - Độc tố chuẩn: CTX code G-117 Lot # P5351 (Enza Life Sciences) 19 - Độc tố đối chứng: độc tố không chịu nhiệt LT (heat labile toxin) vi khuẩn E coli; độc tố ruột SEB (Staphylococcal enterotoxin B) vi khuẩn Staphylococcus aureus Vật liệu nghiên cứu * Dụng cụ, thiết bị: Dụng cụ thiết bị chuyên dụng Khoa Vi sinh vật Trung tâm nghiên cứu Y Dược học - Học viện Quân y Hệ thống sản xuất que thử nhanh Hãng Arista (Hoa Kỳ) * Kháng thể: Bảng 1: Các kháng thể sử dụng nghiên cứu TÊN KHÁNG THỂ VẬT CHỦ TYPE: KÝ HIỆU ISOTOPE (Catalog #) MAb to Cholera Toxin Monoclonal Antibody to Cholera Toxin beta subunit MAb to Cholera Toxin Monoclonal Antibody to Cholera Toxin beta subunit Chuột MAb-IgG1 C01593M Meridian Chuột MAb-IgG1 C01594M Meridian Anti Mouse IgG Dê IgG ABCAM0500 HÃNG SẢN XUẤT ABCAM Có kháng thể gắn lên màng: kháng thể phát (KT1), kháng thể bắt giữ (KT2) kháng thể kiểm tra (KT3) Kháng thể phát (Detection Antibody) C01594M, gắn với hạt vàng, sau gắn lên màng chứa cộng hợp (Conjugate pad) Kháng thể bắt giữ (Capture antibody) C01593M, gắn lên màng NC vị trí test line Kháng thể kiểm tra ABCAM-0500, gắn lên màng NC vị trí vạch đối chứng (control line) TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015 * Màng gắn que thử: Mỗi test cấu tạo phận chính: màng hút mẫu (Sample pad); màng chứa chất cộng hợp màu (Conjugate pad); màng nitrocellulose (Nitrocellulose membrance); màng hút (Absorbent pad) đế nhựa giữ (Plastic adhesive backing card) que thử, đặt mua Công ty Ahlstrom, P.O Box 329, Salmisaarenaukio 1, FI-00180 Helsinki (Phần Lan) Công ty Advanced Microdevices (mdi), 20-21 Industrial Area, Ambala Cantt 133 006 (Ấn Độ) * Dung môi xử lý màng: Các màng có chức riêng biệt để tối ưu hóa hoạt động que thử, loại màng cần phải xử lý trước gắn lên test Mỗi dung môi đặc hiệu cho loại màng định làm tăng hoạt tính màng sau xử lý Phƣơng pháp nghiên cứu * Phương pháp chế tạo que thử nhanh: - Thiết kế: chế tạo que thử nhanh dựa theo quy trình Cơng ty Arista (Hoa Kỳ) Trước tiên, xử lý loại màng dung mơi thích hợp, để khơ Tiếp theo, phun kháng thể lên màng, cuối lắp ghép giữ chặt phận đế nhựa Quá trình tiến hành điều kiện nhiệt độ khoảng 25oC, độ ẩm tương đối < 40% Sau hoàn thành, cất giữ sản phẩm gói hàn nhiệt kín, có vật liệu chống ẩm bảo quản 20 1: Màng hút mẫu 2: Màng chứa chất cộng hợp màu (chứa KT1) 3: Màng phát 4: Màng Nitrocellulose 5(a): Vạch phát mẫu (chứa KT2) 5(b): Vạch đối chứng (Chứa KT3) 6: Màng hút 7: Đế nhựa giữ Hình 1: Sơ đồ cấu tạo test phát nhanh - Nguyên lý hoạt động que thử: kháng thể phát (KT1) gắn với kháng nguyên đặc hiệu gặp kháng thể bắt giữ (KT2) Nếu phản ứng miễn dịch đặc hiệu xảy cho kết vạch dương tính Tất phức hợp tiếp gặp kháng thể kiểm tra (KT3) làm xuất màu vạch đối chứng - Tối ưu hóa: cơng đoạn tối ưu hóa cho cơng thức phối hợp tối ưu nồng độ kháng thể hóa chất khác que nhúng, phải đảm bảo nguyên tắc “sử dụng hàm lượng tối thiểu chất để tạo thiết bị có tính tối ưu” * Phương pháp thử nghiệm que nhúng với mẫu thử: Que nhúng đối chiếu với kỹ thuật ELISA thử nghiệm với mẫu TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015 độc tố để xác định độ nhạy độ đặc hiệu Đánh giá độ nhạy que thử qua khả phát mẫu CTX nồng độ pha loãng khác từ - 200 ng/ml Kiểm chứng độ đặc hiệu với độc tố không chịu nhiệt LT vi khuẩn E coli độc tố ruột SEB vi khuẩn S aureus * Địa điểm thời gian nghiên cứu: Nghiên cứu thực Labo Vi sinh Mầm bệnh sinh học, Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học Quân Khoa Vi sinh vật, Bệnh viện Quân y 103 từ 10 2012 đến - 2014 * Xử lý số liệu: số liệu quản lý phân tích phần mềm Epi.info KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Chế tạo tối ƣu hóa que nhúng * Nồng độ kháng thể màng que thử: Hình 2: Que thử có hàm lượng KT1: 0,25 µg/card; KT2: 0,5 µg/card; KT3: 0,25 µg/card Hình 3: Que thử có hàm lượng KT1: 0,5 µg/card; KT2: 0,5 µg/card; KT3: 0,25 µg/card 21 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015 Hình 4: Que thử có hàm lượng KT1: 0,5 µg/card; KT2: µg/card; KT3: 0,25 µg/card (Vị trí KT3: vạch chứng; Vị trí KT2: vạch test) Que thử có hàm lượng KT1: 0,5 µg/card; KT2: 0,5 µg/card; KT3: 0,25 µg/card cho tín hiệu nhận biết * Khả phát que thử mẫu độc tố chuẩn: Hình 5: Thử que nhúng với độc tố CTX nồng độ 50 ng/ml Hình 6: Thử que nhúng với độc tố CTX nồng độ 100 ng/ml (Vị trí KT3: vạch chứng; Vị trí KT2: vạch test) Que thử cho kết dương tính (2 vạch) rõ nét mẫu CTX nồng độ 50 ng/ml (hình 5) 23 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015 Tính đặc hiệu que thử Hình 7: Thử que nhúng với độc tố SEB nồng độ 100 ng/ml vi khuẩn Staphycoccocus aureus Hình 8: Thử que nhúng với độc tố LT nồng độ 100 ng/ml vi khuẩn Escherichia coli (Vị trí KT3: vạch chứng; Vị trí KT2: vạch test) Que thử cho kết âm tính (tín hiệu vạch chứng KT3) với độc tố SEB vi khuẩn Staphylococcus aureus, độc tố LT vi khuẩn Escherichia coli cho kết âm tính So sánh que thử với kỹ thuật ELISA phát độc tố CTX Bảng 2: Kết thử nghiệm que thử nhanh ELISA mẫu thực phẩm nhiễm CTX nồng độ 50 ng/ml ELISA T æ n g K Õ t (+) (-) (+) 38 38 (-) 2 40 40 Que thử nhanh Tổng Độ nhạy [95%CI] = 0.95 [0.82 - 0.99] 24 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015 Bảng 3: Kết thử nghiệm que thử nhanh ELISA mẫu thực phẩm nhiễm CTX nồng độ 25 ng/ml ELISA T æ n g K Õ t (+) (-) (+) 21 21 (-) 19 19 40 40 Que thử nhanh Tổng Độ nhạy [95%CI] = 0.53 [0.36 - 0.68] Ở nồng độ 50 ng/ml 25 ng/ml độc tố CTX mẫu thử, que thử có độ nhạy 95% 53% so với kỹ thuật ELISA BÀN LUẬN Quy trình chế tạo que thử nhanh Nghiên cứu sử dụng kết từ khảo sát trước 04 kháng thể đơn dòng phát độc tố CTX cho thấy kháng thể có khả phát kháng nguyên khác nhau, xếp theo thứ tự tăng dần độ nhạy kháng thể C01238M, C01592M, C01593M, C01594M [2] Bên cạnh đó, nghiên cứu sử dụng phương pháp Western blot để kiểm tra phát xác tiểu phần B độc tố CTX VKT gây bệnh kháng thể đơn dòng, cho thấy kháng thể phát độc tố CTX tiểu phần B, phần quan trọng định hoạt tính độc tố Trong đó, kháng thể C01594M có khả phát xác độc tố vi khuẩn V cholerae với độ nhạy cao (5 ng/ml) Dựa kết đó, q trình sàng lọc lựa chọn cho cặp kháng thể tối ưu để sử dụng que thử Kết khảo nghiệm cho thấy, nồng độ kháng thể màng cộng hợp màng NC < 0,5 µg/card, tín hiệu que thử khơng có yếu Tín hiệu rõ hàm lượng kháng thể > 0,5 µg/card rõ > µg/card 25 Trong sản xuất que thử, cần quan tâm đến giá thành sản phẩm, nên sử dụng lượng nguyên liệu tối thiểu để đưa sản phẩm đạt u cầu Chính lý nên công thức phối hợp tối ưu hàm lượng kháng thể màng cộng hợp (KT1-kháng thể phát hiện), vạch kiểm tra (KT2-kháng thể bắt giữ), vạch đối chứng (KT3) là: 0,5; 0,5; 0,25 µg/card Trong tương lai, nghiên cứu dùng kháng thể polyclonal thay cho monoclonal nhằm tăng ngưỡng phát giảm chi phí tạo kit Độ ẩm phun kháng thể yêu cầu quan trọng, độ ẩm cao > 45% dẫn đến nhòe vạch phun, khả kháng thể bám dính vào màng khơng tốt, dẫn đến độ ổn định độ bền que thử không cao Khả phát que thử nhanh với độc tố CTX VKT Que thử nhanh sau tối ưu thử với độc tố CTX nồng độ khác Kết cho thấy tín hiệu que thử phát mắt thường nồng độ độc tố mẫu thử 50 ng/ml TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015 Que thử nhanh cho kết vòng - 10 phút Chính vậy, thực tế que thử nhanh giúp ích công tác sàng lọc nhanh mẫu thực phẩm nhiễm độc tố trước tiến hành xét nghiệm sâu hơn, điều làm giảm chi phí xét nghiệm chẩn đoán Khi phương pháp áp dụng với phương pháp khác, đặc biệt phương pháp khuếch đại gen định lượng miễn dịch định lượng, nhà khoa học trả lời nhanh xác chủng loại vi khuẩn, số lượng mầm bệnh bị nhiễm thực phẩm nồng độ độc tố có mẫu [4] Để đánh giá tính đặc hiệu que thử, đối tượng chọn độc tố không chịu nhiệt LT (heat labile toxin) vi khuẩn E coli độc tố ruột SEB (Staphylococcal enterotoxin B) vi khuẩn Staphylococcus aureus Trong đó, độc tố LT E coli có cấu trúc chế gây bệnh giống với độc tố CTX Kết cho thấy que thử khơng có phản ứng chéo với loại độc tố LT SEB So sánh khả phát độc tố CTX với kỹ thuật ELISA mẫu nghiên cứu nồng độ khác cho thấy que thử có độ tương đồng cao (95%) với ELISA nồng độ 50 ng/ml thấp (53%) nồng độ 25 ng/ml Điều ngưỡng phát ELISA (10 ng/ml) thấp nhiều so với que thử nhanh (50 ng/ml) [2], nên khả phát ELISA nhạy so với que thử nhanh, đặc biệt mẫu có nồng độ thấp Trên thực tế, để chẩn đốn xác cần phối hợp số kỹ thuật, que thử nhanh thường nghiệm pháp sàng lọc [3, 4] 25 KẾT LUẬN Đã chế tạo thành công que thử nhanh phát độc tố vi khuẩn Vibrio cholera Que thử sử dụng kháng thể phát C01594M với khối lượng 0,5 µg/card, kháng thể bắt giữ C01593M với khối lượng 0,5 µg/card kháng thể kiểm tra ABCAM-0500 với khối lượng 0,25 µg/card Que thử có khả phát độc tố CTX nồng độ 50 ng/ml, có độ đặc hiệu tuyệt đối độ nhạy 95% so với kỹ thuật ELISA TÀI LIỆU THAM KHẢO Phùng Đắc Cam Vibrio cholerae bệnh dịch tả NXB Y học 2003 Phạm Đức Minh, Nguyễn Hùng Long, Hoàng Văn Lương Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật ELISA phát độc tố VKT Tạp chí Y học Việt Nam 2014, tập 419, số (1), tr.46-49 Trần Linh Thước Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm môi trường NXB Giáo dục 2002 CDC Laboratory Methods for the Diagnosis of Epidemic Dysentery and Cholera 1999 CDC Agents for Bioterrorism 2003 Anh DD, Lopez AL, Tran HT, Cuong NV, Thiem VD, Ali M, Deen JL, von Seidlein L, Sack DA Oral cholera vaccine development and use in Vietnam PLoS Med 2014, Sep 2, 11 (9) Dalsgaard A, Forslund A, Tam NV, Vinh DX, Cam PD Cholera in Vietnam: changes in genotypes and emergence of class I integrons containing aminoglycoside resistance gene cassettes in vibrio cholerae O1 strains isolated from 1979 to 1996 J Clin Microbiol 1999, Mar, 37 (3), pp.734-941 Singer J M & Plotz C M The latex fixation test Application to the serologic diagnosis of rheumatoid arthritis American Journal of Medicine 1956, 21, pp.888-992 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015 26 ... đó, đề tài thực nhằm: Chế tạo que thử nhanh phát độc tố CTX VKT ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu Trong nghiên cứu chọn nhóm vi khuẩn sau: - Độc tố chuẩn: CTX code G-117... thử không cao Khả phát que thử nhanh với độc tố CTX VKT Que thử nhanh sau tối ưu thử với độc tố CTX nồng độ khác Kết cho thấy tín hiệu que thử phát mắt thường nồng độ độc tố mẫu thử 50 ng/ml TẠP... KT3) với độc tố SEB vi khuẩn Staphylococcus aureus, độc tố LT vi khuẩn Escherichia coli cho kết âm tính So sánh que thử với kỹ thuật ELISA phát độc tố CTX Bảng 2: Kết thử nghiệm que thử nhanh ELISA