Nghiên cứu thực hiện các khảo sát ban đầu về những hoạt tính sinh học liên quan đến khả năng điều trị vết thương áp‐ xe của các cao chiết từ dược liệu tứ bạch long (blepharis maderspatensis (L.) roth). Mời các bạn cùng tham khảo bài viết.
Trang 1BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA DƯỢC LIỆU TỨ BẠCH LONG (BLEPHARIS MADERSPATENSIS (L.) ROTH)
Văn Đức Thịnh*, Lê Thị Hồng Quý**, Trần Công Luận*
TÓM TẮT
Đặt vấn đề - Mục tiêu nghiên cứu: Thực hiện các khảo sát ban đầu về những hoạt tính sinh học liên quan
đến khả năng điều trị vết thương áp‐ xe của các cao chiết từ dược liệu Tứ Bạch Long (Blepharis maderaspatensis (L.) Roth)
Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu: Chiết dược liệu bằng 2 loại dung môi là cồn 96% và nước Cao
cồn tổng được lắc phân đoạn bằng 4 dung môi có độ phân cực tăng dần: ether dầu hỏa, chloroform, ethyl acetat,
và n‐buthanol bão hòa nước Khảo sát tính kháng khuẩn trên ba chủng vi khuẩn gram âm (Escherichia coli, E coli kháng ampiciclin, Pseudomonas aeruginosa), ba vi khuẩn gram dương (Staphylococcus aureus, MRSA, Streptococcus pyogenes), nấm men Candida albicans và nấm da Trychophyton mentagrophytes bằng phương pháp đặt đĩa giấy tẩm và xác định MIC bằng phương pháp pha vi pha loãng trên phiến 96 giếng.Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa bằng đánh giá năng lực khử, khả năng quét gốc tự do DPPH và khả năng quét gốc hydroxyl
tự do.Thăm dò hoạt tính kháng viêm, giảm đau bằng khả năng ức chế biến tính albumin do nhiệt
Kết quả: MIC của cao phân đoạn chloroform và ethyl acetat trên S aureus, MRSA, St pyogenes, P
aeruginosa, E coli và C albicans lần lượt từ 12,5 – 50 mg/ml và 32,5 – 250 mg/ml.Cao cồn tổng thể hiện khả năng chống oxy hóa tốt hơn cao nước tổng Cao ethyl acetat quét gốc DPPH tự do tốt nhất (IC50=8,3µg/ml), cao ether quét gốc hydroxyl tự do tốt nhất.Cao cồn tổng và cao nước tổng đều có tiềm năng kháng viêm và cao cồn tổng nổi trội hơn Phân đoạn ethyl acetat thể hiện tiềm năng kháng viêm mạnh nhất
Kết luận: Tứ Bạch Long có hoạt tính kháng khuẩn rất yếu Trong khi đó, hoạt tính chống oxy hóa thể hiện
rất tốt Ngoài ra còn ghi nhận được tiềm năng về hoạt tính kháng viêm, giảm đau, có thể tiến hành khảo sát in
vivo để có kết luận chính xác hơn
Từ khóa: Blepharis maderaspatensis, kháng khuẩn, kháng oxy hóa, kháng viêm
SUMMARY
PRELIMINARY STUDY ON BIOACTIVITIES OF BLEPHARIS MADERSPATENSIS (L.) ROTH
Van Đuc Thinh, Le Thi Hong Quy, Tran Cong Luan
* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 16 - Supplement of No 1 – 2012 : 199 – 206
Background: Preliminarily evaluate the bioactivities relating the healing abces ability of the herbal extracts
from Blepharis maderaspatensis (L.) Roth
Materials and Methods: Extracting with two solvents: 96% alcohol and water The alcohol crude extract
antibiotic resistance on (1) ‐ three Gram‐negative bacteria: Wild‐typed Escherichia coli, Ampicillin‐resistant E coli, and Pseudomonas aeruginosa, (2) – three Gram‐positive bacteria: Staphylococcus aureus, MRSA, Streptococcus pyogenes, (3) – two types of fungi: Candida albicans, and Trychophyton mentagrophytes by using diffusion method (5µl of 500 mg/ml extracts in DMSO) The MIC of the extracts were test using the micro‐ dilution method.Antioxidant activity of the extracts was carried out with reduction power, DPPH radical
* Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp HCM Khoa Sinh học - Trường ĐH Khoa học tự nhiên TPHCM
Tác giả liên lạc: CN Văn Đức Thịnh ĐT: 0908992221 , Email: princetoad1985@yahoo.com
Trang 2scavenging and hydroxyl radical scavenging tests.Evaluating the potentiality of the anti‐ inflammatory activity of extracts by the inhibition of the heat denaturation of serum albumin
Results: The MIC of chloroform and ethyl acetate extracts on S aureus, MRSA, St pyogenes, P
aeruginosa, E coli, and C albicans were 12.5 – 50 mg/ml, and 32.5 – 250 mg/ml, respectively.Both alcohol crude extract and water crude extract had antioxidant activity, but the alcohol crude extract was better The ethyl acetate
the best in hydroxyl radical scavenging activity.Both alcohol crude extract and water crude extract had anti‐ inflammatory potentiality, but the alcohol crude extract was better The ethyl acetate extract was the best in all of extract separated from the alcohol crude extract
Conclusion: Blepharis maderaspatensis show weak antimicrobial activity However, B maderaspatensis
displayed a strong antioxidant activity Besides, B maderaspatensis also had anti‐ inflammatory potentiality, that must be studied further on experiments in vivo
Key words: Blepharis maderaspatensis, antibacteria, antioxidant, antiinflammatory
ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong suốt thời gian kháng chiến và đến
nhiều năm sau giải phóng, nhân dân tỉnh Bình
Thuận sử dụng Tứ Bạch Long (TBL), một loài
cây thân thảo mọc bò ven rạch nước, như một
dược liệu điều trị vết thương áp- xe phần mềm
sau khi đã được nạo hút hết mủ Sau khi định
danh, TBL được xác định tên khoa học là
Blepharis maderaspatensis (L.) Roth, một loài thuộc
họ Acanthaceae (họ Ô rô)(4).Theo những khảo sát
về cây thuốc dân gian nhiều vùng trên thế giới,
TBL cũng được sử dụng nhiều trong các bài
thuốc chữa vết thương phần mềm, viêm họng,
phỏng, gout…(2)
Nhằm góp phần phát huy tiềm lực cây
thuốc của Việt Nam và củng cố cho phương
pháp điều trị dân gian, chúng tôi đã bước đầu
khảo sát về những hoạt tính liên quan đến khả
năng làm lành vết thương áp- xe của TBL Các
khả năng kháng khuẩn, khả năng chống oxy hóa
và tiềm năng kháng viêm của TBL sẽ được làm
rõ trong báo cáo này
VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP
TBL được cung cấp bởi Hội Đông y huyện
Bắc Bình, tỉnh Bình Thuận, dưới dạng phơi khô
cả rễ, thân và lá, trong đó, thân và lá chiếm sinh
khối chủ yếu
Chiết xuất dược liệu
2 kg bột dược liệu khô chiết với cồn 96%
bằng phương pháp ngấm kiệt (tỷ lệ 1:10), và 50 g bột dược liệu khô chiết với nước bằng phương pháp siêu âm gia nhiệt 60 oC (tỷ lệ 1:25) Cao cồn tổng được tiến hành lắc phân đoạn với các dung môi có độ phân cực tăng dần là ether dầu hỏa, chloroform, ethyl acetat và n-buthanol bão hòa nước Gộp dịch chiết của từng dung môi, cô giảm áp đến cắn, thu được 5 phân đoạn cao(8)
Xác định tính kháng khuẩn
Thăm dò tính kháng khuẩn bằng phương pháp đặt đĩa giấy tẩm 5 µl cao hoà trong DMSO
ở nồng độ 500 mg/ml, trên môi trường TSA Xác định MIC dựa vào phương pháp vi pha loãng trên phiến 96 giếng Các chủng khuẩn thử
nghiệm gồm Staphylococcus aureus (MSSA), S
Streptococcus pyogenes (StrP), Escherichia coli
(ASEC), E coli đề kháng ampiciclin (AREC),
Pseudomonas aeruginosa (PA), nấm men Candida albicans (CA) và nấm da Trychophyton
Xác định hoạt tính chống oxy hóa
Xác định năng lực khử
Theo phương pháp của Yen và Duh (1993)(11) Thí nghiệm được thực hiện 3 lần lặp
Trang 3lại Năng lực khử của mẫu được xác định dựa
trên công thức: ∆OD = ODthử - ODchứng
ODthử là mật độ quang của hỗn hợp sau
phản ứng của mẫu thử
ODchứng là mật độ quang của hỗn hợp sau
phản ứng có mẫu thử được thay thế bằng
nước cất
Xác định khả năng quét gốc tự do DPPH
Theo phương pháp của
Brand-Williams-1995(9) Thí nghiệm được thực hiện 3 lần lặp lại
Hoạt tính chống oxi hóa (HTCO) được tính theo
công thức:
ODc là mật độ quang của dung dịch DPPH
và MeOH
ODt là mật độ quang của dung dịch DPPH
và mẫu thử
Xác định khả năng quét gốc hydroxyl tự do
Theo phương pháp của Li và cộng sự (2007)
(7) Thí nghiệm được thực hiện 3 lần lặp lại
Hoạt tính chống oxi hóa (KGOH) được tính theo
ODtk ODdc
ODtk ODm
KGOH
ODm: độ hấp thu của mẫu thử ở bước sóng
520 nm
ODtk: độ hấp thu của mẫu thử không ở bước
sóng 520 nm
ODdc: độ hấp thu của mẫu đối chứng ở bước
sóng 520 nm
Xác định khả năng kháng viêm
Theo phương pháp khảo sát tác dụng ức chế
biến tính albumin do nhiệt của Mizushima
(1964)(5) Thí nghiệm được thực hiện 3 lần lặp lại
Hoạt tính chống oxi hóa (UCBT) được tính theo
ODc
ODm ODc
ODm: mật độ quang của mẫu thử có mang
chất thử nghiệm
ODc: mật độ quang của mẫu mà chất thử
nghiệm được thay bằng đệm
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Hoạt tính kháng khuẩn
Ở nồng độ mẫu thử là 500 mg/ml, chỉ có cao cồn tổng và 2 cao phân đoạn là chloroform, ethyl acetat thể hiện khả năng kháng khuẩn Khả năng kháng khuẩn chủ yếu là đối với Gram
dương là Staphylococcus aureus, Streptococcus
pyogenes; ngoài ra còn có khả năng kháng đối
với Gram âm là Pseudomonas aeruginosa và nấm men Candida albicans Trong đó, S aureus đặc biệt nhạy cảm và P aeruginosa cũng bị đáp ứng khá
cao
Bảng 1 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn
MSS
A
MRS
ARE
Cao nước
Cao
Cao ethyl
Cao n –
Cao nước
Phân đoạn chloroform và ethyl acetat thể hiện tính kháng khuẩn nhưng đều cho kết quả MIC rất cao, 12,5 – > 50 mg/ml đối với phân đoạn chloroform và 62,5 – 250 mg/ml đối với phân
đoạn ethyl acetat
Bảng 2 Kết quả MIC cao chloroform và ethyl acetat
MIC cao chloroform (mg/ml)
MIC cao ethyl acetat (mg/ml)
Trang 4Hoạt tính chống oxi hóa
Năng lực khử
Năng lực khử của các loại cao tăng theo
nồng độ khảo sát và so với chất đối chiếu
vitamin C thì năng lực khử của các loại cao thấp
hơn nhiều
Bảng 3 Năng lực khử của TBL
Mẫu
Năng lực khử
200 µg/ml
400 µg/ml
600 µg/ml
800 µg/ml
1000 µg/ml
Hình 1 Năng lực khử của các loại cao chiết TBL
Trong 2 dạng cao tổng thì cao cồn tổng có
năng lực khử mạnh hơn cao nước tổng Năng
lực khử của 5 phân đoạn cao chiết từ cao cồn
tổng giảm dần theo thứ tự sau: ethyl acetat >
chloroform > ether > n-buthanol > nước Phân
đoạn ethyl acetat cho năng lực khử mạnh nhất
và nổi trội hơn hẳn so với các phân đoạn khác
Khả năng quét gốc tự do DPPH
Bảng 4 Kết quả quét gốc tự do DPPH của TBL
(µg/ml)
hỏa
Hai dạng cao chiết đều có hoạt tính chống oxy hóa bằng cơ chế quét gốc tự do DPPH, nhưng cao chiết bằng cồn có hoạt tính cao hơn cao chiết bằng nước Trong các phân đoạn dịch chiết từ cao chiết cồn thì phân đoạn ethyl acetat cho hoạt tính quét gốc tự do DPPH mạnh nhất, mạnh hơn gấp nhiều lần các phân đoạn ether dầu và gần bằng với hoạt tính của vitamin C tinh khiết
Khả năng quét gốc hydroxyl tự do
Bảng 5 Khả năng quét gốc hydroxyl tự do của TBL
Mẫu
Khả năng kháng hydroxyl tự do (%)
200 µg/ml
400 µg/ml
600 µg/ml
800 µg/ml
1000 µg/ml
Hình 2 Khả năng kháng gốc tự do của các loại cao
chiết TBL
Cao cồn tổng có khả năng kháng gốc hydroxyl tự do và khả năng có liên quan đến nồng độ của cao chiết Trong khi đó, cao nước
Khả năng kháng gốc hydroxyl tự do
0 10 20 30 40 50 60 70
200 400 600 800 1000
nồng độ mẫu (µg/ml)
Cao tổng cồn Cao tổng nước Cao ether dầu Cao chloroform Cao ethyl acetat Cao n-Buthanol Cao nước còn lại Vitamin C
Năng lực khử
0
0.5
1
1.5
2
2.5
Nồng độ mẫu (µg/ml)
Cao tổng cồn Cao tổng nước Cao ether dầu Cao chloroform Cao ethyl acetat Cao n-Buthanol Cao nước còn lại Vitamin C
Trang 5tổng thể hiện khả năng kháng gốc hydroxyl tự
do rất thấp và không ổn định khi thay đổi nồng
độ của cao chiết Như vậy có thể xem như cao
cồn tổng của TBL có khả năng kháng hydroxyl
tự do và cao nước tổng lại không có khả năng
này Tương tự trên, trong các phân đoạn cao
chiết từ cao cồn tổng của TBL, 3 phân đoạn thể
hiện khả năng kháng gốc hydroxyl tự do theo
trật tự giảm dần là ether > chloroform > ethyl
acetat; và 2 phân đoạn n-buthanol, phân đoạn
nước còn lại không có khả năng kháng gốc hydroxyl tự do
Hoạt tính kháng viêm
Thuốc kháng viêm không có steroid (NSAIDs – Non- steroidal anti- inflammatory drugs) ở nồng độ thấp, dưới 1mM đối với chất tinh khiết, sẽ làm giảm độ nhớt và làm giảm sự biến tính dưới tác nhân nhiệt Những hợp chất hay dịch chiết từ cây thuốc có khả năng kháng viêm cũng có hoạt tính này (1, 5, 7, 10)
Bảng 6 Kết quả khảo sát khả năng ức chế biến tính albumin của TBL
Mẫu
(µg/ml)
Khả năng ức chế biến tính (%)
-450
-400
-350
-300
-250
-200
-150
-100
-50
0
50
nồng độ (µg/ml)
Cao ether dầu Cao chloroform Cao ethyl acetat Cao n-Buthanol Cao nước còn lại Cao tổng cồn Cao tổng nước Indom ethacin
Hình 3 Kết quả khảo sát khả năng ức chế biến tính
albumin của TBL nồng độ cao
Tác động ức chế biến tính albumin do nhiệt
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
nồng độ (µg/m l)
Cao ether dầu Cao chloroform Cao ethyl acetat Cao n-Buthanol Cao nước còn lại Cao tổng cồn Cao tổng nước Indomethacin
Hình 4 Kết quả khảo sát khả năng ức chế biến tính
albumin của TBL nồng độ thấp
Williams và cộng sự chọn mức hoạt tính ức
chế biến tính albumin do nhiệt là trên 20% làm
ngưỡng đánh giá tiềm năng kháng viêm của chất khảo sát (10) Như vậy, dựa vào nồng độ ức chế biến tính được trên 20% albumin (IC20) ta có thể dự đoán được khả năng kháng viêm của dịch chiết từ TBL Dựa vào các giá trị khảo sát được từ bảng 6, ta có thể xác định một cách tương đối giá trị IC20 của các loại cao chiết từ TBL và được thể hiện như bảng 7
Bảng 7 Khả năng ức chế biến tính albumin của TBL
(µg/ml)
(µg/ml)
Kết quả đánh giá IC20 cho thấy cao cồn tổng
có khả năng ức chế biến tính albumin cao hơn cao cao nước tổng Trong 5 phân đoạn cao chiết,
2 phân đoạn không có khả năng ức chế biến tính albumin là ether dầu và phần dịch nước còn lại,
do trong khoảng tuyến tính giữa nồng độ mẫu thử với khả năng ức chế, 2 phân đoạn này không thể đạt được giá trị IC20; 3 phân đoạn có khả năng ức chế biến tính albumin do nhiệt được xếp theo thứ tự khả năng giảm dần là ethyl
Trang 6acetat > chloroform > n-buthanol Trong đó,
phân đoạn ethyl acetat có hoạt tính gần như
ngang bằng với indomethacin
KẾT LUẬN
Tứ Bạch Long được địa phương sử dụng
như một kháng sinh thực vật, nhưng hoạt tính
kháng khuẩn, kháng nấm của Tứ Bạch Long rất
yếu, hầu như không có Tứ Bạch Long kháng
đặc biệt mạnh với Staphylococcus aureus,
Streptococcus pyogenes và Pseudomonas aeruginosa,
tuy nhiên, khả năng cũng chỉ thể hiện ở nồng độ
mẫu thử rất cao (MIC = 12,5 – 250mg/ml) Ở
nồng độ cao thì phân đoạn chloroform thể hiện
khả năng kháng khuẩn mạnh hơn phân đoạn
ethyl acetat, và 2 phân đoạn này là phân đoạn
chủ yếu thể hiện tính kháng khuẩn của Tứ Bạch
Long.Hoạt tính chống oxy hóa của Tứ Bạch
Long, được đánh giá bằng các phương pháp
khảo sát năng lực khử, khảo sát khả năng quét
gốc tự do, nhìn chung khá mạnh Phân đoạn
ethyl acetat có năng lực khử và khả năng quét
gốc tự do DPPH mạnh nhất, phân đoạn ether
dầu có hoạt tính quét gốc hydroxyl tự do mạnh
nhất.Thử nghiệm hoạt tính kháng viêm bằng
phương pháp khảo sát khả năng ức chế biến
tính albumin do nhiệt là phương pháp in vitro
mới lần đầu tiên được công bố tại Việt Nam
Theo phương pháp này, kết quả cho thấy Tứ
Bạch Long có tiềm năng là thực vật kháng viêm
và phân đoạn ethyl acetat quyết định hoạt tính
kháng viêm của Tứ Bạch Long
TÀI LIỆU THAM KHẢO
of serum albumin by anti‐inflammatory drugs, Biochem
Pharmacol 19, pp 715-722
Karandamalai, Dindigul District, Tamil Nadu, India,
Ethnobotany Leaflets 12, pp 195 – 203
characterization and antioxidant of naringenin schiff base and its
Cu (II), Ni(II), Zn (II) complexes, Chem Pharm Bull 55, pp 26 –
28
được chữa bằng “Kháng sinh thực vật”, Bài tham luận Hội thảo
Cây Dược liệu Quý Hiếm ở Địa phương, Hội Đông y tỉnh Bình Thuận
‐inflammatory drugs with serum proteins, especially with some biologically active proteins, J Pharm Pharm 20, pp 169-173
đánh giá chất có tiềm năng kháng khuẩn, Y học TP Hồ Chí Minh
6(1), pp 309-313
Silvestrini B (2001), Inhibition of heat‐induced denaturation of
albumin by nonsteroidal antiinflammatory drugs (NSAIDs), Arch
Pharm Res 24(2), pp 150-158
Bộ môn dược liệu , Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh,
tr 1-9, 33-36
lý của thuốc từ dược thảo, NXB Khoa học và kỹ thuật, tr
289-291
S., Whittaker J A., Conrad J., Vogler B., Rosner H., Kraus W
(2008), The in vitro Anti‐denaturation Effects Induced by Natural
Products and Non‐steroidal Compounds in Heat Treated (Immunogenic) Bovine Serum Albumin is Proposed as a Screening Assay for the Detection of Anti‐inflammatory Compounds, without the use of Animals, in the Early Stages of the Drug Discovery Process, West Indian Med J 57(4), pp 327-331
11 Zhang Z., Jin J., Shi L (2008), Antioxidant activities of the derivatives of polysaccharide extracted from Chinese medical
herb (Ramuulus mori), Food Sci.Technol Res., 14, pp 160-168