Đề tài được tiến hành để phân lập một số hợp chất từ cỏ mực, mật nhân (2 thành phần của bài thuốc) để có thể tiến hành các nghiên cứu tiếp theo - xây dựng tiêu chuẩn cho bài thuốc. Mời các bạn cùng tham khảo.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ DƢỢC LIỆU CỎ MỰC VÀ MẬT NHÂN TRONG BÀI THUỐC CÓ TÁC DỤNG CAI NGHIỆN RƢỢU CỦA ÔNG LÊ VĂN LÂM Huỳnh Thị Thanh Tâm*, Huỳnh Trần Quốc Dũng*, Nguyễn Ngọc Thạch*, Nguyễn Đức Hạnh*, Hồ Việt Sang***, Nguyễn Minh Đức*,*** TÓM TẮT Mở đầu – mục tiêu: Nền y học cổ truyền có nhiều dược liệu b|i thuốc quý gi{ để điều trị bệnh nghiện rượu cho tác dụng tốt v| an to|n cho người sử dụng Trong đó, khơng thể khơng nhắc đến thuốc cai rượu ông Lê Văn L}m B|i thuốc cai rượu n|y sử dụng từ l}u đời Đề t|i tiến h|nh để phân lập số hợp chất từ Cỏ mực, Mật nhân (2 thành phần thuốc) để tiến hành nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cho thuốc Phương ph{p nghiên cứu: Cỏ mực chiết xuất với EtOH 70%, cô dịch chiết; ph}n t{n nước chiết phân bố với ete dầu, n – butanol bão hòa nước Cao khô Mật nh}n ph}n t{n nước, chiết phân bố với n-BuOH bão hòa nước Tiến hành phân lập từ ph}n đoạn n-BuOH cách kết hợp c{c phương pháp sắc ký Các hợp chất x{c định cấu trúc dựa vào phổ NMR Kết quả: Từ kg dược liệu khô Cỏ mực ph}n lập 108 mg hợp chất eclalbasaponin I, 217 mg hợp chất echalbasaponin II Từ 60 g cao khô Mật nh}n ph}n lập 124 mg eurycomanon Kết luận: eclalbasaponin I, eclalbasaponin II, eurycomanon thu tinh khiết, ứng dụng vào công tác nghiên cứu, kiểm nghiệm dược liệu Cỏ mực, Mật nhân Từ khóa: Cỏ mực, Mật nhân, eclasaponin I, eclasaponin II, eurycomanon ABSTRACT ISOLATION OF COMPOUNDS FROM HERBA ECLIPTAE AND RADIX EURYCOMAE Huynh Thi Thanh Tam, Huynh Tran Quoc Dung, Nguyen Ngoc Thach, Nguyen Duc Hanh, Ho Viet Sang, Nguyen Minh Duc * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement Vol 22 - No 1- 2018: 293 - 297 Introduction - objectives: Traditional medicine has many herbs as well as valuable remedies for alcoholism to work very well and to be safe for users In a particular way, the remedy of Mr Le Van which has been used for a long time was one of them In order to achieve this long-term goal, the research was carried out with the following specific objectives: Study on the isolation of some compounds from medicinal herbs (E alba, E longifolia) to ensure the quality of medicinal herbs and the remedy Methods: Herba Ecliptae was refluxed with 70% ethanol Then the ethanolic solution was evaporated under low pressure to obtain an ethanolic extract The extract was then dispersed in water and partitioned with petroleum ether and water saturated n-butanol, consecutively Dry extract of Radix Eurycomae was dispersed in water and partitioned with water saturated n-butanol These n-butanol extracts were used for chromatography analysis And the structures were identified based on NMR spectrum Results: Herba ecliptae: 108 mg of eclalbasaponin I and 217 mg of eclalbasponin II were isolated from kg of * Khoa Dƣợc, Đại học Y Dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh *** Khoa Dƣợc, Đại học Tôn Đức Thắng Tác giả liên lạc: GS Nguyễn Minh Đức ĐT: 0908988820 Chuyên Đề Dƣợc ** Hội Dƣỡng sinh tâm thể tỉnh DakLak Email: ducng@hcm.vnn.vn 293 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 crude materials Radix erycomae: 124 mg of eurycomanone was isolated from 60 g of the crude extract Conclutions: Isolated eclalbasaponin I, eclalbasaponin II, eurycomanon can be used in building the quality of medicinal herbs and the remedies Keywords: Herba Eclipta, Radix Eurycomae, eclalbasaponin I, eclalbasaponin II, eurycomanone Ban Nghiên cứu khoa học – Thƣ viện, Khoa ĐẶT VẤN ĐỀ Dƣợc, Đại học Y Dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh Nghiện rƣợu gây biến chứng gan, Trang thiết bị tim, thần kinh,< để lại hậu nặng Hệ thống HPLC LC-8A, LC – 20AD, SPDnề cho th}n, gia đình ngƣời nghiện mà 20A (Shimazu – Nhật) Cột Phenomenex Luna gánh nặng cho xã hội(1-4) Để khắc phục C18, cột Discovery HS C18 với detector UV (Mỹ) tình trạng đó, y học đại chủ yếu sử dụng Bản mỏng tráng sẵn silica gel 60 F254 (Merck – nhiều thuốc hóa dƣợc, nhiên, thuốc Đức), đèn UV 254 nm v| 365 nm (Đức) M{y đo thƣờng kèm với nhiều tác dụng phụ nghiêm phổ khối LC–MS Agilent 1260 (Mỹ) M{y đo phổ trọng Nền y học cổ truyền có nhiều dƣợc liệu cộng hƣởng từ hạt nhân Brüker AVANCE 500 nhƣ b|i thuốc quý gi{ để điều trị bệnh (Mỹ) Silica gel sắc ký cột (Kích thƣớc hạt 0,043 nghiện rƣợu cho tác dụng tốt an tồn cho 0,06 mm) (Mỹ) Tủ sấy chân khơng Gallentkamp ngƣời sử dụng Trong đó, khơng thể khơng nhắc (Anh) Bình chiết phân bố, hệ thống lọc chân đến thuốc cai rƣợu ông Lê Văn L}m Qua không, m{y cô quay dƣới áp suất giảm, bếp đun thực tế điều trị sở khám chữa bệnh bác cách thủy sỹ Hồ Việt Sang cho thấy thuốc hiệu mà không ghi nhận tác dụng phụ n|o đ{ng kể Bài thuốc gồm thành phần Bình tinh, Dong riềng, Cỏ mực, Mật nhân, Cà gai leo Cỏ mực (Herba Eclipta) l| dƣợc liệu cổ truyền nƣớc ta, có thành phần hóa học saponin, alkaloid, flavonoid, coumarin, đƣợc sử dụng làm thuốc bổ toàn thân, cầm máu, chữa ứ tắc bệnh phì đại gam lách(6,10) Mật nhân (Radix Eucomiae) với thành phần hóa học đặc trƣng l| quassinoid, alkaloid, triterpen, biphenyl neolignan v| steroid cho nhiều tác dụng đ{ng quý(8,9) Do thuốc đƣợc bào chế phƣơng pháp sắc thuốc nên nghiên cứu tập trung vào việc phân lập hợp chất ph}n đoạn phân cực để làm chất đ{nh dấu cho dƣợc liệu cao chiết từ thuốc ĐỐI TƢỢNG-PHƢƠNGPH[P NGHIÊNCỨU Đối tƣợng nghiên cứu - Dƣợc liệu Cỏ mực đƣợc cung cấp bác sĩ Hồ Việt Sang, hội Dƣỡng sinh tâm thể tỉnh Đắk Lắk - Cao sấy phun Mật nh}n đƣợc chiết xuất 294 Phƣơng ph{p nghiên cứu kg Cỏ mực đƣợc chiết hồi lƣu với EtOH 70% giờ, cô thu hồi dung môi đƣợc 217 g cao toàn phần Cao toàn phần đƣợc phân tán nƣớc chiết phân bô lỏng lỏng lần lƣợt với été dầu n-BuOH bão hòa nƣớc Ph}n đoạn n-BuOH đƣợc loại dung môi thu đƣợc 131,1 g cao Cao tiếp tục đƣợc tiến hành sắc ký cột pha thuận với hệ dung môi CH2Cl2 – MeOH (gradient) thu đƣợc phân đoạn AB1 – AB4 Ph}n đoạn AB2 (7 g) đƣợc tiến hành sắc ký cột C18 với hệ dung môi MeOH – H2O (gradient) thu đƣợc 217 mg hợp chất Ph}n đoạn AB3 (1,02 g) đƣợc tiến hành sắc ký cột C18 với hệ dung môi MeOH – H2O (gradient) thu đƣợc 108 mg hơp chất Các hợp chất phân lập đƣợc xác định cấu trúc phổ NMR so sánh liệu với tài liệu tham khảo 60 g cao khô Mật nh}n đƣợc phân tán nƣớc chiết phân bố với n-BuOH bão hòa nƣớc Ph}n đoạn n-BuOH đƣợc loại dung môi thu đƣợc 37 g cao Cao n|y đƣợc tiến hành sắc ký cột pha thuận với hệ dung môi CH2Cl2 – MeOH (gradient) thu đƣợc phân Chuyên Đề Dƣợc Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 đoạn CB1 – CB3 Ph}n đoạn CB2 (3,4 g) đƣợc tiếp tục tinh chế HPLC điều chế với hệ dung môi MeOH – H3PO4 0,01% (12 : 88) thu đƣợc 124 mg hợp chất Cấu trúc đƣợc xác định dựa liệu phổ MS NMR phù hợp với tài liệu tham khảo KẾT QUẢ Hợp chất (Eclasaponin II) Eclalbasaponin I Phổ 1H-NMR hợp chất đo 500 MHz dung mơi pyridin-d5 cho tín hiệu proton đặc trƣng sau tín hiệu proton 0,89 ppm (3H, s); 1,02 ppm (6H, s); 1,06 ppm (3H, s); 1,09 ppm (3H, s); 1,21 ppm (3H, s); 1,33 ppm (3H, s) thể cho nhóm -CH3 Theo 33 tài liệu tham khảo(7) gắn lần lƣợt cho nhóm -CH3 vị trí 18, 21; 27; 26; 28, 29, 30 eclalbasaponin II + Tín hiệu proton H anomer 1’ đƣờng tƣơng ứng với tín hiệu 4,97 ppm (1H, d, J = 7,5 Hz) nên đ}y l| đƣờng dãy β Vùng 3,0 - 5,0 ppm mang nhiều tín hiệu gán cho proton nhóm -CH-OH- khung chuỗi đƣờng Các tín hiệu bị chồng phủ nên khó x{c định xác Phổ 13C-NMR hợp chất I phân lập đo 125 MHz dung môi pyridin-d5 cho tất 42 tín hiệu: tín hiệu vùng khoảng 100 ppm (107,0 ppm) tín hiệu C-1’ đƣờng glucose Vùng 60 - 90 ppm cho tín hiệu Chuyên Đề Dƣợc Nghiên cứu Y học Bảng 1: Bảng so sánh liệu phổ NMR (pyridin-d5, 125/500 MHz) hợp chất liệu phổ NMR (pyridin-d5, 125/500 MHz) eclalbasaponin II theo tài liệu tham khảo(7) Vị trí 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Glc 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ Eclalbasaponin II δC ppm δH ppm 38,8 26,5 88,7 39,4 55,8 18,4 33,3 39,9 47,2 36,9 23,7 122,0 145,1 41,7 36 74,6 49 42,1 47,2 30,8 36,0 33,3 28,2 0,89 s 16,9 1,00 s 15,7 1,01 s 17,6 1,04 s 27,9 1,17 s 180,1 33,3 1,30 s 28,1 1,77 s 106,7 4,92 d 75,6 78,6 71,7 78,0 62,8 Hợp chất δC ppm δH ppm 38,98 24,93 89,01 39,70 56,11 18,70 33,03 40,09 47,35 37,23 23,99 122,55 145,34 41,63 36,33 74,92 49,09 42,31 47,48 31,22 36,40 33,52 28,43 0,89 s 17,23 1,02 s 15,76 1,06 s 17,67 1,09 s 26,79 1,21 s 180,17 33,70 1,33 s 27,43 1,89 s 107,04 4,97 d 75,99 78,94 72,07 78,44 63,24 Trong đó, gồm carbon gắn với nhóm OH đƣờng (5 tín hiệu đƣờng glucose) tín hiệu -C-O- khung aglycon vị trí 3, 16 + Vùng có độ dịch chuyển < 60 ppm cho tín hiệu carbon sp3 Hợp chất I có 25 tín hiệu carbon sp3 + tín hiệu vùng > 180 ppm (180,2 ppm) tín hiệu nhóm –COOR + tín hiệu vùng 115-150 ppm 295 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 (122,6 ppm 145,3 ppm) cho thấy có tín hiệu nối đơi vị trí 12, 13 Kết so sánh liệu phổ NMR hợp chất eclasaponin II đƣợc trình bày Bảng Hợp chất (eclasaponin I) Eclalbasaponin II Phổ 1H-NMR hợp chất đo 500 MHz dung môi pyridin-d5 cho tín hiệu proton đặc trƣng sau: + tín hiệu proton nhóm -CH3 Trong đó, có tín hiệu 1,00 ppm có tích phân 6,0 tín hiệu nhóm -CH3 bị chập Vậy tín hiệu 0,89 ppm (3H, s); 1,00 37 ppm (6H, s); 1,05 ppm (3H, s); 1,13 ppm (3H, s); 1,29 ppm (3H, s); 1,85 ppm (3H, s) thể cho nhóm -CH3 theo tài liệu tham khảo(7) gán lần lƣợt cho nhóm -CH3 vị trí 23, 24, 25, 26, 27, 29, 30 eclaclbasaponin I Vùng 3,0 - 5,0 ppm mang nhiều tín hiệu gán cho proton nhóm -CH-OH- khung chuỗi đƣờng Các tín hiệu bị chồng phủ nên khó x{c định xác Phổ 13C-NMR hợp chất phân lập đo 125 MHz dung môi pyridind5 cho tất 41 tín hiệu: tín hiệu vùng 106,7 ppm tín hiệu C-1’ đƣờng glucose Ngồi có tín hiệu 96,7 ppm downfield gắn với -COO- Vùng 60 - 90 ppm cho 12 tín hiệu Trong đó, gồm 10 carbon gắn với nhóm -OH đƣờng (5 tín hiệu đƣờng glucose) tín hiệu -C-O- khung aglycon vị trí 3, 16 Vùng có độ dịch chuyển < 60 ppm cho tín hiệu carbon sp3 296 Bảng 2: Bảng so sánh liệu phổ NMR (pyridin-d5, 125/500 MHz) hợp chất liệu phổ NMR (pyridin-d5, 125/500 MHz) eclalbasaponin I theo tài liệu tham khảo(7) Vị trí 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Glc 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ Glc 1’’ 2’’ 3” 4” 5” 6’ Hợp chất δC ppm δH ppm 38,6 26,3 88,6 39,2 55,7 18,3 33,3 40 47 37 23,7 122,5 144,3 41,9 36 74,2 49 41,1 47 30,5 35,8 32 28 0,89 s 16,8 1,00 s 15,5 1,01 s 17,4 1,05 s 27,1 1,13 s 175,8 33 1,29 s 24,4 1,85 s 106,7 4,94 d 75,6 79,2 71,7 78,6 62,9 96,7 4,05 m 74 78,7 71 78,1 62,1 Eclalbasaponin I δC ppm δH ppm 38,7 26,4 88,7 39,3 55,8 18,4 33,2 39,8 46,9 36,8 23,6 122,4 144,2 41,8 35,8 74 48,8 41 46,9 30,6 35,7 32 28,1 0,89 s 16,8 1,02 s 15,5 1,06 s 17,3 1,09 s 27 1,21 s 175,7 33 1,33 s 24,4 1,89 s 106,5 4,97 d 75,4 79 71,4 78,3 62,2 95,6 4,07 m 73,8 78,4 70,7 77,9 61,9 Có 24 tín hiệu carbon sp3 + tín hiệu vùng 175,8 tín hiệu nhóm –COOR + tín hiệu vùng 115-150 ppm (122,5 ppm Chuyên Đề Dƣợc Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 144,3 ppm) cho thấy có tín hiệu nối đơi vị trí 12, 13 Kết so sánh liệu phổ NMR hợp chất v| eclasaponin I đƣợc trình bày Bảng Hợp chất (eurycomanon) Nghiên cứu Y học BÀN LUẬN Eclalbasaponin I, eclalbasaponin II sử dụng để chất làm đại diện cho nhóm saponin Cỏ mực Đồng thời, eurycoumanon đƣợc sử dụng làm chất đánh dấu cho Mật nhân Kết ứng dụng vào kiểm nghiệm sản phẩm từ thuốc KẾT LUẬN Eurycomanon Bảng 3: Bảng so sánh liệu phổ 13C-NMR (pyridind5, 125 MHz) hợp chất liệu phổ 13CNMR (pyridin-d5, 125 MHz) eurycomanon theo tài liệu tham khảo(5) Vị trí 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Hợp chất δC ppm 83,9 197,5 125,8 162,2 42 25,2 71,5 52,4 47,6 45,5 108,9 80,4 146,8 79,2 77,8 173,8 22,3 120,1 10,1 67,4 Eurycomanon δC ppm 82,5 197,1 124,9 162,7 40,7 24,7 70,6 51,3 46,2 44,8 107,8 79,2 146 78 74,8 172,4 21 119 9,8 66,3 Phổ HR-MS hợp chất cho thấy ion pic [M+H]+ m/z 409,1160 tƣơng ứng với công thức phân tử C20H24O9 eurycomanon Kết so sánh liệu phổ NMR hợp chất eurycomanon đƣợc trình bày Bảng Chuyên Đề Dƣợc Từ kg dƣợc liệu Cỏ mực khô, đề t|i phân lập đƣợc hợp chất eclalbasaponin I (108 mg), eclalbasaponin II (217 mg) Từ 30 g cao khô Mật nh}n ph}n lập đƣợc 124 mg eurycomanon Các hợp chất đƣợc sử dụng để làm chất đ{nh dấu phục vụ cho công tác kiểm nghiệm dƣợc liệu Cỏ mực, Mật nhân nhƣ chất đ{nh dấu cho cao chiết từ thuốc cai rƣợu TÀI LIỆU THAM KHẢO Burns MJ, Price JB, Lekawa ME (2015) Delirium tremens (DTs) Medscape Drugs & Diseases Carrilho PE, Santos MB, Piasecki L, Jorge AC (2013), “Marchiafava-Bignami disease: a rare entity with a poor outcome”, Rev Bras Ter Intensiva, 25(1), pp 68-72 Chris D Meletis, N.D and Jason E Barker, N.D (2004), Herbs and Nutrients for the Mind, Praeger Publishers, USA, pp 17 Cremers I, Ribeiro S (2014), “Management of variceal and nonvariceal upper gastrointestinal bleeding in patients with cirrhosis”, Therap Adv Gastroenterol, 7(5), pp 206-216 Leonardus B.S Kardono et al (1991), “Cytotoxic and antimalarial constituents of the roots of Eurycoma longifolia”, Journal of Natural Products, 54(5), pp 1360- 1367 Mithun et al (2011), “Eclipta alba (L.) A Review on its Phytochemical and Pharmacological Profile”, Pharmacologyonline, 1, pp 345-357 Ning Ding, Shoji Yahara, and Toshihiro Nohara (1994), "Oleanane Glycosides from Eclipta alba", Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 42(6), pp 1336–1338 Rajeev Bhat, A.A Karim (2010), “Tongkat ali (Eurycoma longifolia Jack): A review on its ethnobotany and pharmacological importance”, Fitoterapia, 81, pp 669-679 Shaheed UR Rehman et al (2016), “ Review on a traditional herbal medicine, Eurycoma longifolia Jack (Tongkat Ali): Its traditional uses, chemistry, evidence – based pharmacology and toxicology”, Molecules, 21(331), pp 1–31 10 Viện dƣợc liệu (2006), Cây thuốc v| động vật làm thuốc Việt nam, Tập I, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, tr 800-807 Ngày nhận báo: 18/10/2017 Ngày phản biện nhận xét báo: 01/11/2017 Ng|y b|i b{o đăng: 15/03/2018 297 ... thấy thuốc hiệu mà không ghi nhận tác dụng phụ n|o đ{ng kể Bài thuốc gồm thành phần Bình tinh, Dong riềng, Cỏ mực, Mật nhân, Cà gai leo Cỏ mực (Herba Eclipta) l| dƣợc liệu cổ truyền nƣớc ta, có. .. nhiều tác dụng đ{ng quý(8,9) Do thuốc đƣợc bào chế phƣơng pháp sắc thuốc nên nghiên cứu tập trung vào việc phân lập hợp chất ph}n đoạn phân cực để làm chất đ{nh dấu cho dƣợc liệu cao chiết từ thuốc. .. dƣợc liệu Cỏ mực khô, đề t|i phân lập đƣợc hợp chất eclalbasaponin I (108 mg), eclalbasaponin II (217 mg) Từ 30 g cao khô Mật nh}n ph}n lập đƣợc 124 mg eurycomanon Các hợp chất đƣợc sử dụng để