Bài viết trình bày việc xây dựng quy trình tổng hợp 4-[5-(3-methylphenyl)-3-(trifluoromethyl)-1H-pyrazol-1yl]benzensulfonamid (tạp A của celecoxib) và xác định độ tinh khiết tạp A.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học TỔNG HỢP 4-[5-(3-METHYLPHENYL)-3-(TRIFLUOROMETHYL)-1HPYRAZOL-1-YL]BENZENSULFONAMID (TẠP A CỦA CELECOXIB) Nguyễn Minh Trí*, Lâm Nguyễn Đoan Trang**, Huỳnh Phương Nguyên**, Lê Thị Thu Cúc***, Trương Ngọc Tuyền** TÓM TẮT Đặt vấn đề: Tạp A celecoxib tạp chất (tạp A B) celecoxib quy định Dược điển Anh Dược điển Mỹ, đóng vai trò quan trọng công tác kiểm nghiệm thành phẩm thuốc celecoxib thị trường Việt Nam Mục tiêu: Xây dựng quy trình tổng hợp 4-[5-(3-methylphenyl)-3-(trifluoromethyl)-1H-pyrazol-1yl]benzensulfonamid (tạp A celecoxib) xác định độ tinh khiết tạp A Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Tạp A celecoxib tổng hợp qua giai đoạn từ nguyên liệu đầu đơn giản Tinh chế sắc ký cột kết tinh lại Xác định cấu trúc phương pháp phổ IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR, HSQC HMBC Kiểm tra độ tinh khiết phương pháp HPLC Kết quả: Tổng hợp tạp A celecoxib với hiệu suất tổng cộng 33,99% độ tinh khiết đạt 99,15% đủ điều kiện để thiết lập chất đối chiếu Kết luận: Đã tổng hợp thành công tạp A xác định cấu trúc Sản phẩm có độ tinh khiết cao đạt tiêu chuẩn để thiết lập chất đối chiếu Từ khóa: Tạp A celecoxib, tổng hợp, chất đối chiếu ABSTRACT SYNTHESIS OF 4-[5-(3-METHYLPHENYL)-3-(TRIFLUOROMETHYL)-1H-PYRAZOLE1-YL]BENZENESULFONAMIDE (CELECOXIB RELATED COMPOUND A) Nguyen Minh Tri, Lam Nguyen Doan Trang, Huynh Phuong Nguyen, Le Thi Thu Cuc, Truong Ngoc Tuyen * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol 23 - No 2- 2019: 77-82 Backgrounds: Celecoxib related compound A is one of the two major impurities (A and B) of celecoxib which is specified in the British Pharmacopoeia and the US Pharmacopoeia Synthesis of celecoxib related compound A provides reference material for impurity testing of celecoxib in Vietnam Objectives: Design the procedure for synthesis of 4-[5-(3-methylphenyl)-3-(trifluoromethyl)-1Hpyrazole-1-yl]benzenesulfonamide (celecoxib related compound A) and determination of its impurity for reference material Methods: Celecoxib related compound A was synthesized via steps from simple starting material Final product was purified by column chromatography and recrystallization Confirmation its structure by using IR, 1H-NMR, 13C-NMR, HMBC and HSQC Results: Overall yields of synthesis of celecoxib related compound A is 33.99% and the purity of the product was 99,15% by HPLC and met the requirements for reference material * Công ty Dược phẩm Korean United Pharma Khoa Dược, ĐH Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh ***Viện Kiểm nghiệm Thuốc Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: PGS TS Trương Ngọc Tuyền ĐT: 0903330604 ** Chuyên Đề Dược Email: truongtuyen@ump.edu.vn 77 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Conclusions: Celecoxib related compound A were successfully synthesized with high purity (99.15%) and met requirement for establishment reference material Key words: Celecoxib related compound A, synthesis, reference material ĐẶT VẤNĐỀ ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU Tạp A celecoxib tạp chất (tạp A B) quy định Dược điển Anh(3) Dược điển Mỹ(6), tạp đóng vai trò quan trọng cơng tác phân tích tạp chất thành phẩm thuốc celecoxib thị trường Việt Nam 4-[5-(3-Methylphenyl)-3-(trifluoromethyl)1H-pyrazol-1-yl]benzensulfonamid gọi tạp A celecoxib Theo Dược điển Anh, tạp A xuất trình tổng hợp celecoxib sản phẩm 4-hydrazinobenzensulfonamid với 4,4,4-trifluoro-1-(3-methylphenyl)butan-1,3dion, xem tạp chất với giới hạn cho phép nguyên liệu không 0,4% Bên cạnh đó, tạp A thuộc nhóm GHS06 gây độc cho gan, thận hít hay nuốt phải Do việc kiểm nghiệm tạp nguyên liệu hay thành phẩm thuốc cần thiết Hóa chất Sulfanilamid, natri acetat, natri hydroxid, natri sulfit, acid hydrocloric, acid nitric, acid sulfuric, methanol, 1,4-dioxan, n-hexan, petroleum ether (Trung Quốc); ethanol, ethyl acetat (Việt Nam); acetonitril, methanol (HPLC grade); 3-methylacetophenon (Acros, Bỉ); anhydrid trifluoroacetic (Prolabo, Pháp) Thiết bị celecoxib từ nguyên liệu đơn giản ban đầu để Máy khuấy từ gia nhiệt IKA, máy lọc áp suất giảm Velp, máy quay chân khơng Buchi, cân phân tích Sartorius, cân điện tử Chaus, máy đo điểm nóng chảy SanyoGallenkamp, máy đo quang phổ hồng ngoại IRAFFINITY-1S Shimadzu, máy đo quang phổ MS Agilent LC-MS/MS; LC-MS Shimadzu, máy quang phổ NMR Bruker Avance III 500 MHz, máy sắc ký lỏng hiệu cao HPLCPDA Shimadzu Prominence phục vụ cho việc thiết lập chất đối chiếu nhằm Phương pháp nghiên cứu giúp giảm giá thành sản phẩm Tạp A celecoxib tổng hợp qua giai đoạn mô tả sơ đồ Hiện để phục vụ cho kiểm nghiệm thuốc, tạp chuẩn nhập từ nước ngồi với giá cao Do đó, nhóm nghiên cứu định tiến hành việc tổng hợp tạp A Tạp A Sơ đồ 1: Quy trình tổng hợp tạp A celecoxib 78 Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Tổng hợp methyl trifluoroacetat (SP1) Cho thật chậm anhydrid trifluoroacetic (105 g; 0,5 mol) vào methanol (120 mL) bình cầu 500 mL °C Thêm mL H2SO4 đậm đặc vào đun hồi lưu Hỗn hợp sau phản ứng trung tính hóa với Na2CO3 NaOH 10%, sau chưng cất 41-45 °C Sản phẩm chưng cất làm khan với CaCl2 với Na2SO4 Sản phẩm bảo quản lạnh chai kín(1) Tổng hợp 4,4,4-trifluoro-1-(3-methylphenyl) butan-1,3-dion (SP2) Hòa tan natri methylat (4,1 g; 75 mmol) toluen (100 mL) bình cầu Ổn định nhiệt độ phản ứng 20-25 oC, cho từ từ 3methylacetophenon (6,7 g; 50 mmol) toluen vào bình cầu 30 phút Tiếp tục khuấy hỗn hợp 30 phút Dung dịch methyl trifluoroacetat (9,6 g; 75 mmol) toluen cho từ từ vào hỗn hợp 20 – 25 oC giờ, sau nâng nhiệt độ lên 110 oC, khuấy 24 Hỗn hợp phản ứng làm nguội 30 oC cho vào cốc chứa dung dịch HCl, khuấy để yên đến sản phẩm tách lớp Chiết sản phẩm lại dung dịch nước toluen Rửa sản phẩm với nước cất, loại bỏ dung môi cô quay(2) Tổng hợp 4-hydrazinobenzensulfonamid (SP3) Hòa tan sulfanilamid (12,9 g; 0,075 mol) hỗn hợp đồng lượng gồm 21 mL HCl đậm đặc 21 mL nước, làm lạnh nhanh đến oC để thu dạng muối hydroclorid dạng bột mịn Muối diazoni tạo cách cho từ từ dung dịch chứa NaNO2 (5,2 g; 0,075 mol) 12 mL nước Kiểm tra phản ứng giấy tẩm KI - hồ tinh bột Tiếp tục khuấy vài phút, sau cho vào dung dịch lạnh chứa Na2SO3 (19,66 g; 0,156 mol) NaOH (4 g; 0,1 mol) l00 mL nước; tiếp tục khuấy hỗn hợp phút Để yên phút, acid hóa với 70 mL dung dịch HCl Chuyên Đề Dược Nghiên cứu Y học đậm đặc đun cách thủy 30 oC phút, tinh thể màu vàng tươi tách Để yên tủ lạnh giờ, lọc tinh thể, thêm 50 mL HCl đậm đặc, đun cách thủy 10 phút để nguội Lọc lấy tủa gồm 4-hydrazinobenzensulfonamid hydroclorid muối natri, hòa tan tủa vào nước trung hòa CH3COONa khan, xuất tủa 4-hydrazinobenzensulfonamid(2) Tổng hợp tạp A Cho 4-hydrazinobenzensulfonamid (4,675 g; 25 mmol) vào bình cầu 250 mL chứa sẵn methanol (75 mL) Điều chỉnh pH tới 2-3 HCl đậm đặc khuấy Cho từ từ dung dịch 4,4,4-trifluoro-1-(3-methylphenyl)butan1,3-dion (5,75 g; 25 mmol) methanol (15 mL) vào đun hồi lưu 16 giờ(2) Dung mơi loại bỏ hồn tồn quay, phần lại hòa tan 35 mL nước chiết ethyl acetat (3 x 50 mL) Rửa dịch chiết ethyl acetat nước Cô quay thu chất rắn Tinh chế Sản phẩm tinh chế phương pháp sắc ký cột pha tĩnh hấp phụ (silica gel-Si60), dung môi rửa giải clorofrom – ethyl acetat – petroleum ether (10:3:2) kết hợp với phương pháp kết tinh thay đổi dung môi Xác định cấu trúc Sản phẩm xác định cấu trúc phương pháp quang phổ IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR, HMBC HSQC đồng thời so sánh với tài liệu tham khảo(4) Xác định độ tinh khiết Dựa điều kiện sắc ký tham khảo(3,6), khảo sát thông số Cột sắc ký: Phenomenex Gemini C6 – phenyl (250 x 4,6 mm; µm) Dung mơi pha mẫu: nước – methanol (25 : 75) Pha động: Acetonitril – dung dịch đệm (50:50), dung dịch đệm dung dịch 79 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 KH2PO4 2,7 g/L điều chỉnh tới pH 3,0 H3PO4 Tốc độ dòng: mL/ phút Nhiệt độ cột: 50 oC Thể tích tiêm mẫu: µL Đầu dò PDA: bước sóng phát 215 nm Chuẩn bị mẫu thử: cân xác khoảng 10,0 mg tạp A, cho vào bình định mức 10 mL, thêm vào mL dung môi pha mẫu, siêu âm tạp A tan hết (khoảng phút), thêm nước cất vừa đủ 10 mL, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm Mẫu trắng: dung mơi pha mẫu KẾT QUẢ Methyl trifluoroacetat (M = 128,0502) (SP1) chất lỏng suốt khơng màu, nặng nước, có mùi thơm ester Hiệu suất 67,2% tos: 42 - 44 oC Tỷ trọng nhiệt độ sôi phù hợp với số liệu tham khảo hãng SigmaAldrich (d = 1,273 g/cm3, tos = 43 - 43,5 °C)(5) 4,4,4-Trifluoro-1-(3-methylphenyl)butan1,3-dion (M = 230,1832) (SP2) chất lỏng màu vàng cam Không tan nước, tan ethanol, ethyl acetat Hiệu suất: 80,5% Rf = 0,75 (cloroform-ethyl acetat-petroleum ether (10:3:2)) MS m/z: [M-H]- tìm thấy: 229,0473 ([M-H]- dự kiến: 229,0477) 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 7,96 (s, 1H, H2’); 7,92 (d, 1H, J = 7,5 Hz, H6’); 7,54 (d, 1H, J = 7,5 Hz, H4’); 7,47 (t, 1H, J = 7,5 Hz, H5’); 6,99 (s, 1H, H2); 4,41 (s, 1H, Henol); 2,40 (s, 3H, Hmethyl) 13CNMR (125 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 185,89 (C3); 174,07 (C1); 138,68 (C1’); 135,11(C2’); 132,49 (C6’); 128,99 (C4’); 128,31 (C5’); 125,17 (C3’); 114,28 121,05 (-CF3); 93,01 (C2); 20,69 (Cmethyl) 210,0300 ([M+Na]+ dự kiến 210,0313) Phổ 1HNMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 7,50 (d, 2H, J = Hz, H2, H6); 7,40 (s, 2H, Hsulfonamid); 6,91 (d, 2H, J = Hz, H3, H5); 6,88 (s, 2H, HNH2); 6,49 (s, 1H, HNH) 4-[5-(3-Methylphenyl)-3-(trifluoromethyl)1H-pyrazol-1-yl]benzensulfonamid (M = 381,3722) (Tạp A) tinh thể trắng sáng Tan methanol, ethyl acetat; không tan n-hexan Hiệu suất: 83,2% MP: 139,5 oC (phù hợp với thông số LGC Standard(6) 135-145 oC) khoảng nhiệt độ từ bắt đầu đến nóng chảy hoàn toàn oC Rf = 0,5 (Cloroformethyl acetat-petroleum ether (10:3:2)) Phổ IR (cm-1) (so sánh LGC Standard(6)): 3336 (3335, NH), 3236 (3236), 1593 (1592, C=N), 1494 (1494, C=Cbenzen), nhóm CF3 1157 (1157) cm-1, 1128 (1128) cm-1 MS m/z = [M+Na]+ tìm thấy 404,0613 ([M+Na]+ dự kiến 404,0657); [M-H]tìm thấy 380,0557 ([M-H]- dự kiến 380,0681) Phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 7,87 (d, 2H, J = 8,5 Hz, H2, H6); 7,54 (d, 2H, J = 8,5 Hz, H3, H5); 7,50 (s, 2H, Hsulfonamid); 7,21 (s, 1H, H4’); 7,25 – 7,29 (m, 3H, H5”, H4”, H2”); 7,01 (d, 1H, J = 7,0 Hz, H6”); 2,29 (s, 3H, Hmethyl) Phổ 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 145,28 (C3’); 144,01 (C4’); 142,28 (CF3); 141,98 (CF3); 141,04 (C1); 138,21(C3”); 129,99; 129,45; 128,59; 128,13; 126,72 (C2, C6); 125,91 (C3, C5); 122,31 (C5’); 120,17 (C1”); 106,29 (C4’); 20,82 (Cmethyl) Từ kết kết luận sản phẩm thu tạp A celecoxib 4-Hydrazinobenzensulfonamid (M = 187,2196) (SP3) tinh thể trắng ngà, vàng Tan nước, tan ethanol Hiệu suất: 73,3% Rf = 0,55 (Cloroform-ethyl acetat-methanol (10:7:3)) Phổ IR (cm-1): 3251, 3194 (NH), 2846 (C-Hbenzen), 1506 cm-1 (C=Cbenzen) MS m/z: [M-H]- tìm thấy 186,0330 ([M-H]- dự kiến 186,0337); [M+Na]+ tìm thấy 80 Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Xác định độ tinh khiết HPLC Tính phù hợp hệ thống Tính phù hợp hệ thống xác định cách tiến hành tiêm lặp lại lần dung dịch tạp A 1000 µg/ml Kết trình bày bảng Bảng 1: Khảo sát tính phù hợp hệ thống sắc ký (n=6) tR (phút) Trung bình 15,203 RSD (%) 0,07 S (µV x giây) 20450149 0,69 As 0,95 0,09 Rs N 8,624 18183 0,48 0,28 Nghiên cứu Y học RSD thông số nhỏ 2%, số đĩa lý thuyết (N > 2000), hệ số phân giải Rs > 1,5 cho thấy hệ thống sắc ký chọn lựa tương thích cho việc phân tích tạp A Độ tinh khiết tạp Tiến hành sắc ký mẫu trắng dung dịch thử (tạp A 1000 µg/ml) cho thấy sắc ký đồ mẫu trắng không xuất pic trùng với thời gian lưu pic tạp A Độ tinh khiết tạp A tính theo phương pháp phần trăm diện tích pic 99,15% tính theo chế phẩm khan Hình 1: Sắc ký đồ dung dịch tạp A 1000 µg/mL BÀNLUẬN Cho đến chưa ghi nhận cơng trình giới cơng bố quy trình tổng kiện phản ứng tối ưu hiệu suất tổng cộng tồn quy trình 33,99% Ở giai đoạn tổng hợp tạp A, việc thêm hợp tạp A Qua bước tổng hợp tạp nhiều A celecoxib, nguyên liệu quy trình benzensulfonamid giúp tăng hiệu suất phản tổng hợp chất thơng dụng, dễ tìm Phản ứng, giảm lượng tạp hỗn hợp sau phản ứng tổng hợp quy trình tinh chế có hiệu ứng Tinh chế riêng lẻ phương pháp kết suất tương đối cao (từ 67,2%-83,2%) tinh lại sắc ký cột khơng loại hồn tồn thực điều kiện phòng thí nghiệm Quy tạp Khi kết hợp hai phương pháp, trình tổng hợp lựa chọn điều dùng phân đoạn chứa sản phẩm từ cột sắc ký, Chuyên Đề Dược lần nguyên liệu 4-hydrazino 81 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 loại dung mơi, sau kết tinh lại với n-hexan phương pháp IR, MS, 1H-NMR, thu sản phẩm với độ tinh khiết cao HMBC HSQC Hàm lượng tạp A 13 C-NMR, Tạp A celecoxib sau tổng hợp xác 99,15% xác định HPLC, với độ tinh định hàm lượng HPLC với độ tinh khiết nguyên liệu đủ điều khiết 99,15% phù hợp để nhân chuẩn có kiện để tiến hành làm chuẩn kiểm thể bổ sung nguồn tạp chuẩn cho nghiệm quan kiểm nghiệm nước, đến TÀI LIỆU THAM KHẢO tạp chưa có ngân hàng chất chuẩn quốc gia KẾT LUẬN Từ nguyên liệu ban đầu sulfanilamid, anhydrid trifluoroacetic 3methylacetophenon, qua bước tổng hợp thành công 4-[5-(3-methylphenyl)-3- Amiet Louis (1986), "Process for the preparation of methyl trifluoroacetate", US Patent 4730082 Anumula RR, Gilla G, Alla S, et al (2011), "Process for preparation of celecoxib", US Patent 7919633B2 British Pharmacopoeia (2016), CD-ROMs, monographs: celecoxib LGC standards (06/2013), “Safety Data Sheet according to OSHA HCS”, Celecoxib impurity A, pp 1-8 Sigma – Aldrich (01/2017), “Safety datasheet according to 1907/2006/EC”, Methyl trifluoacetate, pp 1-7 United States Pharmacopoeia 40 (2017), CD-ROMs, monographs: celecoxib (trifluoromethyl)-1H-pyrazol-1-yl]benzene sulfonamid - tạp A celecoxib với hiệu Ngày nhận báo: 18/10/2018 suất bước cao Sản phẩm cuối Ngày phản biện nhận xét báo: 01/11/2018 chứng minh công thức Ngày báo đăng: 15/03/2019 82 Chuyên Đề Dược ... t a gồm 4-hydrazinobenzensulfonamid hydroclorid muối natri, h a tan t a vào nước trung h a CH3COONa khan, xuất t a 4-hydrazinobenzensulfonamid(2) Tổng hợp tạp A Cho 4-hydrazinobenzensulfonamid... H a chất Sulfanilamid, natri acetat, natri hydroxid, natri sulfit, acid hydrocloric, acid nitric, acid sulfuric, methanol, 1,4-dioxan, n-hexan, petroleum ether (Trung Quốc); ethanol, ethyl acetat... 4-[5-(3-Methylphenyl)-3-(trifluoromethyl)1H-pyrazol-1 -yl]benzensulfonamid (M = 381,3722) (Tạp A) tinh thể trắng sáng Tan methanol, ethyl acetat; không tan n-hexan Hiệu suất: 83,2% MP: 139,5 oC (phù hợp với thông số LGC Standard(6)