Nghiên cứu ảnh hưởng của pH dung dịch đệm và nồng độ sudan B đối với phản ứng nhuộm lipid bạch cầu người

Bài viết tiến hành nghiên cứu tối ưu hóa quy trình nhuộm lipid tế bào bạch cầu người bằng phẩm màu sudan B dùng trong xét nghiệm để phân loại dòng tế bào ung thư máu. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết của tài liệu.

TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014 NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA pH DUNG DỊCH ĐỆM VÀ NỒNG ĐỘ SUDAN B ĐỐI VỚI PHẢN ỨNG NHUỘM LIPID BẠCH CẦU NGƢỜI Trần Văn Tính* TĨM TẮT Nghiên cứu tối ưu hóa q trình nhuộm màu lipid bạch cầu người sudan B Quy hoạch hóa thực nghiệm theo mơ hình mặt hai nhân tố: pH (X 1) nồng độ sudan B (X2); hàm mục tiêu điểm nhuộm lipid (Y) phần mềm Modde 5.0 Phương trình hồi quy thu được: Y = 362,7 2 + 5,2 x X1 -10.5 x X2 - 26,3 x X1 (R = 0,985 với p > 0,95) điều kiện nhuộm tối ưu: Nồng độ sudan B 0,20% pha dung dịch đệm với pH = 7,42 Hiệu suất nhuộm tốt điều kiện tối ưu tìm 95,10 ± 1,0% (p = 0,95) * Từ khóa: Nhuộm hóa học tế bào; Nhuộm sudan B; Nhuộm lipid EFFECT OF pH AND B SUDAN SOLUTION ON LIPID STRAINING OF HUMAN LEUKOCYTE SUMMARY 60 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014 A research was conducted on the optimal conditions for the lipid of human leukocyte with sudan B solution Experiments were designed by response surface modeling with two factors: pH (X 1) and sudan B concentrate (X2) to target lipid score function; Regression equation presents dependence of lipid score on two factors quoted above as: Y = 362.7 + 5.2 x X1 -10.5 x X2 - 26.3 x X12 (R = 0.985 with p > 0.95) and the optimal conditions of the lipid staining as: pH = 7.42, sudan B 0,20% The best efficiency of the lipid staining in the above optimal conditions is found to be 95.10 ± 1.0% (p = 0.95) * Key words: Cytochemistry; Sudan B staining; Lipid staining ĐẶT VẤN ĐỀ Lipid có tế bào bạch cầu người este axít béo với ancol Xác định lipid phản ứng màu với nhiều loại phẩm màu: dầu đỏ, scharlach R, rodamin B, nile blue, sudan Cơ chế phản ứng màu khác nhau, bao gồm khuếch tán vật lý đơn liên kết hóa học trực tiếp Trong loại thuốc nhuộm, sudan nhóm phẩm nhuộm ưa chuộng để nhuộm lipid từ vàng (sudan III) đến đen (sudan B) [3] * Bệnh viện 19-8 Người phản hồi (Corresponding): Trần Văn Tính (tranvantinh@yahoo.com) Ngày nhận bài: 17/06/2014; Ngày phản biện đánh giá báo: 28/07/2014 Ngày báo đăng: 11/08/2014 Đối với máu ngoại vi, phản ứng nhuộm sudan B cho kết bạch cầu hạt dương tính mạnh, monoxit dương tính yếu, lymphoxit hồng cầu âm tính Trong tủy xương bình thường, tế bào dòng tủy dương tính từ tiền tủy bào đến tế bào trưởng thành, dòng monoxit dương tính tế bào trưởng thành; mẫu tiểu cầu tiểu cầu dương tính giai đoạn Trong nhiều trường hợp mắc bệnh bạch cầu cấp, phân biệt tương đối rõ dòng tủy dòng tế bào khác kết nhuộm sudan B Kết dương tính sudan B mẫu bệnh phẩm thường cho kết dương tính với kỹ thuật nhuộm peroxydase Chính vậy, kết nhuộm sudan B tiêu chuẩn ứng dụng để phân loại thể bệnh 61 bệnh bạch cầu cấp theo tiêu chuẩn FAB [2] Chayen (1968) cho rằng, mức độ bắt màu chọn lọc thuốc nhuộm lipid phụ thuộc nhiều vào chất lipid đặc tính thuốc nhuộm, thuốc điều trị, hormon điều kiện tiến hành nhuộm [3] Phản ứng nhuộm sudan B nói riêng nhuộm lipid nói chung cho kết tương đối khác điều kiện cụ thể Vì vậy, việc nghiên cứu tìm điều kiện tối ưu để tiến hành phản ứng, nhằm đảm bảo tính ổn định mặt kỹ thuật, nâng cao chất lượng nhuộm giảm chi phí vấn đề có ý nghĩa khoa học thực tiễn cần thiết Mục tiêu cơng trình này: Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình nhuộm lipid tế bào bạch cầu người TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014 phẩm màu sudan B dùng xét nghiệm để phân loại dòng tế bào ung thư máu ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng, dụng cụ hóa chất nghiên cứu * Đối tượng nghiên cứu: bạch cầu lấy từ máu người khoẻ mạnh có chứa lipid Máu sau lấy từ tĩnh mạch, tiến hành dàn 14 tiêu không qua chống đông, để khô điều kiện tự nhiên cố định * Dụng cụ: máy ủ nhiệt CW-20G - 500C, độ xác ± 0,10C, máy đo pH inoLab 730 với độ xác đến 10-3, cân phân tích Sartorius TE214S có độ xác 10-4, kính hiển vi Nikon với độ phóng đại 1.000 lần, pipet tự động Hãng Thermo kèm đầu côn 0,2, 1,0 10 ml Hãng Gilson * Hóa chất: sudan B (Hãng SigmaAldrich); phenol (Hãng Sigma-Aldrich); axít citric 99,5% (Hãng Sigma-Aldrich); formaldehyd 37% ACS 99,5% (Hãng Sigma-Aldrich); ethanol 96% (Hãng Sigma-Aldrich); aceton ACS 99,5% (Hãng Sigma-Aldrich); Na2HPO4 (Hãng SigmaAldrich); Giemsa (Hãng Sigma-Aldrich) - Pha chế thuốc thử: + Dung dịch cố định tiêu bản: ++ Dung dịch citrat: 25 ml (lấy từ dung dịch 18 mmol axÝt citric + mmol natri citrat 12 mmol NaCl lít) Na2HPO4 0,3% điều chỉnh pH HCl 0,1 M + Dung dịch nhuộm sudan pha theo bảng ethanol 96% đệm phenolphosphat theo tỷ lệ 6:4 + Dung dịch nhuộm nhân: Giemsa Phƣơng pháp nghiên cứu * Thiết kế thực nghiệm: Thí nghiệm thiết kế theo mơ hình khảo sát mặt mục tiêu (Response Surface Modeling - RSM) cụ thể: tổ hợp mặt tâm (The Central Composite Face - CCF) nhân tố phần mềm MOD5 Mỗi nhân tố gồm mức: tâm (d = 0), đỉnh (1) mặt (d) Mô hình gồm 11 thí nghiệm: thí nghiệm đỉnh, thí nghiệm điểm nằm mặt khơng gian nhân tố thí nghiệm lặp tâm Thiết kế quy hoạch hóa thực nghiệm gồm biến pH dung dịch đệm (X1) nồng độ sudan B theo g/100 ml (X2) Ảnh hưởng hai nhân tố lên hàm mục tiêu (Y) điểm nhuộm tuân theo phương trình: 2 Y = b0 + b1X1 + b2X2 + b1(X1) + b2(X2) + b12X1X2 Các điều kiện mã hóa để nhập liệu vào chương trình phần mềm (bảng 1): Bảng 1: Ký hiệu mức mã hóa thực nghiệm -1 pH dung dịch đệm X1 7,2 7,4 7,6 Sudan B (%) X2 0,2 0,3 0,4 ++ Acetone 99,5%: 65 ml ++ Focmaldehyd 37%: ml + Dung dịch đệm phenol-phosphat với pH pha theo bảng 1: phenol 16% 62 * Kỹ thuật tiến hành nhuộm: TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014 - Cố định tiêu dung dịch cố định tiêu với thời gian 30 giây Sau đó, gói đưa tiêu vào hộp chống ẩm bảo quản nhiệt độ - 80C (thời gian bảo quản kéo dài tháng [8]) - Nhúng tiêu vào dung dịch nhuộm sudan với nồng độ pH khác theo quy hoạch thực nghiệm bảng 30 phút Sau đó, rửa tiêu vòi nước phút, để khơ - Nhuộm dung dịch Giemsa 10% 15 phút để khô - Đọc tiêu vật kính dầu với độ phóng đại 1.000 lần Đánh giá bạch cầu trung tính dương tính thành mức độ: Độ 0: khơng có hạt bắt màu đen Độ 1: hạt nguyên sinh chất, hạt mịn nhỏ, khơng có hạt nhân tế bào Độ 2: nhiều hạt to nguyên sinh chất, khơng có hạt nhân tế bào Độ 3: nhiều hạt to toàn tế bào, xấu Độ 4: nhiều hạt to toàn tế bào, đẹp Cơng thức tính điểm nhuộm: ∑Y (điểm) = Y0 x + Y1 x + Y2 x + Y3 x + Y4 x Như vậy, phản ứng nhuộm đạt tối ưu toàn tế bào bạch cầu trung tính dương tính độ 4, tổng điểm tối đa 400 hiệu suất đạt 100% Các vùng có chứa lipid nguyên sinh chất bạch cầu xuất hạt bắt màu đen Đối với dòng tủy tế bào trưởng thành, mức độ dương tính mạnh Đối với dòng lympho bình thường âm tính KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Bảng 2: Kết thực nghiệm nhuộm sudan theo theo mơ hình khảo sát mặt mục tiêu 63 X1 X2 X1 X2 -1 -1 7.2 0.2 342 1 -1 7.6 0.2 355 -1 7.2 0.4 322 1 7.6 0.4 335 -1 7.2 0.3 335 11 7.6 0.3 340 10 -1 7.4 0.2 378 7.4 0.4 355 0 7.4 0.3 360 0 7.4 0.3 362 0 7.4 0.3 364 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014 Nhập kết vào phần mềm Modde 5.0 qua xử lý, phương trình hồi quy: Y = 362,7 + 5,2 x X1 -10.5 x X2 - 26,3 x X12 + 2,7 x X22 -5.53x10-6 x X1 x X2 * Độ tin cậy thống kê biến số: Bảng 3: Hệ số độ tin cậy thống kê hệ số ± p Constant 362,737 1,45222 1,95E-11 3,73306 X1 5,16673 1,15571 0,006576 2,97085 X2 -10,5 1,15571 0,00027 2,97085 X1*X1 -26,3421 1,7786 2,54E-05 4,57205 X2*X2 2,65793 1,7786 0,195304 4,57205 X1*X2 -3,15E-05 1,41545 3,63854 N = 11 Q = 0,878 Cond no = 3,0822 DF = 0,985 Y-miss = R Adj = 0,97 RSD = 2,8309 Conf lev = 0,95 R = Như vậy, loại bỏ hệ số X22 X1 x X2 phương trình hồi quy là: Y = 362,7 + 5,2 x X 10,5 x X2 - 26,3 x X12 Phân tích Anova cho thấy phương trình mơ tả tương đối tốt kết thực nghiệm (hệ số tương quan R2 = 0,985 (p > 0,95)) Chạy chương trình tối ưu thu điều kiện tối ưu với pH = 7,419 nồng độ sudan 0,20 g%, dự đốn điểm nhuộm đạt 376,1 Kết tối ưu hóa trình bày bảng hình 1, hình 64 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014 Bảng 4: Tối ưu hóa theo phương trình hồi quy 7,4431 0,2 375,782 127 -0,564 7,4203 0,2 376,142 24 -0,687 7,4431 0,2 375,782 127 -0,564 7,4192 0,2 376,142 24 -0,687 7,4445 0,2 375,736 114 -0,55 7,4189 0,2 376,14 24 -0,686 7,4445 0,2 375,736 114 -0,55 7,4445 0,2 375,736 114 -0,55 Hình 1: Sơ đồ đường đồng mức mặt tối ưu Hình 3: Hình ảnh nhuộm lipid bạch cầu điều kiện tối ưu với sudan B Hình 2: Mặt tối ưu thực nghiệm Để khẳng định điều kiện tối ưu thu cho hiệu suất nhuộm cao nhất, tiến hành nhuộm thí nghiệm Bảng 5: Kết thí nghiệm lặp lại điều kiện tối ưu S è ® iĨ m n g h iƯ m H iƯ u ( 382 95.5% 380 95.0% 379 94.8% Trung bình 380,3 95,10% Sau xử lý liệu chương trình thống kê SPSS 18, thu khoảng giới hạn hiệu suất nhuộm trung bình cao: 95,10% ± 1,0 (p = 0,95) 65 BÀN LUẬN - Về pH dung dịch đệm: pH dung dịch nhuộm có vai trò quan trọng phản ứng nhuộm, định tốc độ khuếch tán giữ nguyên hình thái tế bào lipid trạng thái tự nhiên Để phản ứng xảy tốt nhất, dung dịch sudan B pha chế mơi trường có độ pH trung tính kiềm nhẹ, phenol có dung dịch đóng vai trò chất cố định màu [4] Kết thu nghiên cứu (pH = 7,42) tương đương với công bố Hayhoe, Sheehan Storey (pH = 7,4) [1, 3, 4] - Nồng độ sudan B: Nồng độ sudan B định khả khuếch tán từ dung môi vào tổ chức mỡ Sudan B nhuộm màu lipid theo chế: khuếch tán vật lý đơn liên kết hóa học nhóm amino sudan B phản TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014 ứng với nhóm axít lipid Nồng độ sudan B (0,20 g%) tối ưu thu nhỏ 18,9 lần so với kết Hayhoe [1, 3, 4] KẾT LUẬN Qua nghiên cứu thực nghiệm theo mơ hình khảo sát mặt mục tiêu biến số, tìm điều kiện tối ưu phản ứng nhuộm sudan B: pH dung dịch đệm nhuộm 7,419 nồng độ sudan B 0,2% Quy trình tìm đạt hiệu suất nhuộm 95,10% ± 1,0 (p = 0,95), tạo điều kiện để triển khai rộng kỹ thuật phòng xét nghiệm huyết học Việt Nam với giá thành thấp 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO Viện Huyết học-Truyền máu Kỹ thuật xét nghiệm Huyết học-Truyền máu NXB Y học Hà Nội 1984 Bennett JM, Catovsky D, Daniel MT, et al Proposals for the classification of the acute leukaemias, French-American-British (FAB) co-operative group J Haematol 1976, 33 (4), pp.451-458 F.G.J Hayhoe & D Quaglino Haematological cytochemistry, Churchill Livingstone, London 1994 Sir John V Dacie; S.M Lewis Practical Haematology Longman Group Ltd, Hong Kong 1994  ... Lipid có tế b o b ch cầu người este axít b o với ancol Xác định lipid ph n ứng màu với nhiều loại ph m màu: dầu đỏ, scharlach R, rodamin B, nile blue, sudan Cơ chế ph n ứng màu khác nhau, bao gồm... gồm biến pH dung dịch đệm (X1) nồng độ sudan B theo g/100 ml (X2) Ảnh hưởng hai nhân tố lên hàm mục tiêu (Y) điểm nhuộm tuân theo ph ơng trình: 2 Y = b0 + b1 X1 + b2 X2 + b1 (X1) + b2 (X2) + b1 2X1X2... trọng ph n ứng nhuộm, định tốc độ khuếch tán giữ nguyên hình thái tế b o lipid trạng thái tự nhiên Để ph n ứng xảy tốt nhất, dung dịch sudan B pha chế mơi trường có độ pH trung tính kiềm nhẹ, phenol