Nghiên cứu tạo β-cyclodextrin từ dịch xử lý tinh bột với CGTase cố định

Trong nghiên cứu này nghiên cứu việc tạo β-CD từ dịch tinh bột xử lý với enzym cố định trên alginat và khảo sát các điều kiện tạo β-CD từ enzym cố định bao gồm: nồng độ dịch tinh bột xử lý, lượng CGTase, thời gian phản ứng. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết.

Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Nghiên cứu Y học NGHIÊN CỨU TẠO Β-CYCLODEXTRIN TỪ DỊCH XỬ LÝ TINH BỘT VỚI CGTASE CỐ ĐỊNH Vương Văn Sơn*, Vũ Thanh Thảo*, Trần Hồng Ngân*, Trần Thành Đạo*, Trần Cát Đông* Mở đầu: Cyclodextrin (CD) oligosaccharide dạng vòng chứa 6, 7, đơn vị glucose liên kết với liên kết α-1-4 glycosid, β-cyclodextrin (β-CD) sử dụng nhiều CD sản xuất nhờ xúc tác enzym cyclodextrin glucanotransferase Enzym có tác dụng vòng hóa tạo CD từ chất có liên kết α-1,4-glycosid tinh bột, amylose, amylopectin, dextrin, maltodextrin, glycogen Mục tiêu: Trong nghiên cứu nghiên cứu việc tạo β-CD từ dịch tinh bột xử lý với enzym cố định alginat Phương pháp: Khảo sát điều kiện tạo β-CD từ enzym cố định bao gồm: nồng độ dịch tinh bột xử lý, lượng CGTase, thời gian phản ứng Sản xuất β-CD theo qui trình sử dụng dung môi cyclohexan Số lần tái sử dụng enzym sau cố định xác định số lần sử dụng enzym hoạt tính hay hiệu suất chuyển đổi tinh bột thành β-CD khoảng 50% so với ban đầu Kết quả: Xác định điều kiện tối ưu phản ứng tạo β-CD từ dịch xử lý tinh bột với enzym cố định là: nồng độ dịch tinh bột xử lý 26%, thời gian phản ứng 61 h, lượng enzym CGTase 2,91 KU/L Hiệu suất chuyển đổi từ tinh bột thành β-CD 51% Và enzym CGTase có khả tái sử dụng lần quy trình tạo β-CD Kết luận: Xác định điều kiện tối ưu phản ứng vòng hóa từ dịch xử lý tinh bột enzym cố định alginat với lượng β-CD tạo thành 181,7 g/L Từ khóa: β-CD; CGTase; enzym cố định; alginat, dịch tinh bột xử lý ABTRACT INVESTIGATION ON Β-CYCLODEXTRIN PRODUCTION FROM HYDROLYZED STARCH BY IMMOBILIZED CGTASE Vuong Van Son, Vu Thanh Thao, Tran Hong Ngan,Tran Thanh Dao, Tran Cat Dong * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 18 - Supplement of No - 2014: 289 - 294 Background: Cyclodextrins are cyclic oligosaccharides composed of 6, 7, or α-1,4-linked glucose units, respectively classified as α, β and γ in which β-cyclodextrin (β-CD) is used most They are produced by the catalytic action of cyclodextrin glucanotransferase The enzyme displays its cyclic action on substrates with α-1,4glycosyl chain, such as starch, amylose, amylopectin, dextrins, matodextrins, or glycogen Objectives: In this study, we investigated the producing of β-CD from hydrolyzed starch with immobilized CGTase on alginate Methods: Surveying of conditions to product β-CD with immobilizated GTase including hydrolyzed starch concentration, concentration of CGTase and reaction time β-CD was produced by solvent process with cyclohexan Recycling of immobilized enzyme was determined until enzymatic activity or the conversion efficiency of starch into β-CD was about 50% from baseline Results: The result showed that the optimal conditions of β-CD production on hydrolyzed starch with immobilizated CGTase were hyrolyzed starch 26%, reaction time 61h, enzym CGTase concentration 2,91 KU/L Convertion yield to β-CD from starch was 51% And immobilized CGTase was re-used times in β-CD ∗ Khoa Dược, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS Vương Văn Sơn ĐT: 0908747086 Chuyên Đề Dược Học Email: vuongvanson@gmail.com 289 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 production Conclutions: Optimum conditions of cylic reaction from hydrolyzed starch with immobilized CGTase on alginate were indentified with the yield of β-CD was 181,7 g/L Keywords: β-CD; CGTase; immobilizated enzyme; alginate, hydrolyzed starch tinh bột với Termamyl để thu dextrin ngắn ĐẶT VẤN ĐỀ giúp cho trình thực vòng hóa thu sản Cyclodextrin (CD) oligosaccharide phẩm β-CD nhanh điều kiện phản dạng vòng, khơng khử, chúng có nhiều ứng ứng tạo β-CD với enzym cố định alginat từ dụng công nghiệp thực phẩm, dược phẩm dịch xử lý tinh bột hóa học Trên giới, CD ứng dụng VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP từ lâu nhiều lĩnh vực cấu trúc đặc biệt chúng Trong công nghiệp thực phẩm Vật liệu CD dùng để che giấu mùi, vị khó chịu, để Enzym Toruzyme ® 3.0L (Novozymes, Đan ổn định bảo vệ thành phần chức Mạch) với hàm lượng protein 5,03 mg/ml acid amin, vitamin thực phẩm, làm hoạt tính 45,25 U/mg protein; chất mang natri phụ gia độn, tạo độ nhớt,…Đối với ngành dược alginat (Xilong, Trung Quốc); enzym Termamyl CD tá dược quan trọng giúp tăng độ tan 120L (Novozymes, Đan Mạch), tinh bột sắn mì dược chất khơng tan nước, giúp (Thiêm Ký, Việt Nam); dung môi cyclohexan tăng độ hấp thu sinh khả dụng kiểm (Xilong, Trung Quốc) sốt tốc độ phóng thích thuốc, ngồi Xác định hàm lượng protein hoạt tính giúp che dấu mùi, vị khó chịu nhiều hoạt enzym chất (3,10) Tuy nhiên, tá dược phải Hàm lượng protein xác định nhập ngoại hoàn toàn Việc sản xuất βphương pháp Bradford cyclodextrin nước giúp tự chủ nguồn nguyên liệu làm thuốc tạo điều kiện để Hoạt tính enzym CGTase xác định cơng nghiệp dược phẩm nước ứng dụng phương pháp Kaneko đơn vị hoạt bào chế chế phẩm có chất lượng cao, cạnh tính enzym định nghĩa số μmol βtranh với sản phẩm ngoại nhập Mặt CD tạo phút điều kiện thí khác nguyên liệu để sản xuất β-cyclodextrin từ nghiệm(2) tinh bột giúp tạo giá trị gia tăng cho tinh Cố định enzym alginat bột, qua thúc đẩy phát triển ngành cơng Enzym CGTase cố định lên alginat theo nghiệp chế biến nông sản phương pháp bắt giữ Quy trình cố định Sản xuất CD có đường sau: chuẩn bị dung dịch alginat 4% đệm công nghệ enzym sử dụng Tris-HCl 50 mM pH 7, thêm CGTase với lượng cyclomaltodextrin glucanotransferase (CGTase) 300 U/10ml alginat; dùng bơm nhu động nhỏ với nguyên liệu tinh bột dextrin (1,6) hỗn hợp vào dung dịch CaCl2 0,2 M để Nhưng enzym CGTase có hoạt tính cắt mạch hạt alginat; để hạt ổn định khoảng tinh bột yếu so với hoạt tính chuyển nhóm cho việc trao đổi ion Ca2+ xảy hồn tồn Lọc glucan phản ứng tạo vòng, sử dụng nồng hạt qua phễu Büchner, rửa cho hết protein với độ tinh bột cao, độ nhớt dung dịch tăng làm nước cất Bảo quản CGTase cố định giảm hoạt tính enzym CGTase, alginat 4oC Hoạt tính enzym cố định xác khả tăng nồng độ tinh bột ban đầu nhằm định theo phương pháp Kaneko 33,16 U/g thu dược lượng β-CD nhiều hơn(1) Do chất mang(2) nghiên cứu khảo sát việc cắt mạch 290 Chuyên Đề Dược Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Khảo sát việc tiền xử lý tinh bột với Termamyl 120L thu dịch xử lý có DE 14-15 Khảo sát tiền xử lý với Termamyl tinh bột có nồng độ: 30, 40, 50, 60% với lượng enzym 2,4KU/L nhiệt độ 90oC, pH7 theo nghiên cứu nồng độ tinh bột thường sử dụng để thu nhận maltodextrin thường từ 30% trở lên Sau chọn nồng độ tinh bột thích hợp chúng tơi tiến hành khảo sát ảnh hưởng lượng enzym Termamyl 120L sử dụng, thời gian dịch hóa pH 7, nhiệt độ 90oC; Với thời gian phản ứng khảo sát khoảng từ 30, 60, 90 120 phút; lượng enzym sử dụng 14,4 KU/L, 19,2 KU/L 24 KU/L tương ứng với lượng Termamyl khoảng 0,03% đến 0,05% so với lượng tinh bột sử dụng Enzym Termamyl sau xử lý tinh bột bất hoạt pH 3,5 HCl 1N, 30 phút Sau 30 phút, thêm NaOH để điều chỉnh pH dịch tinh bột pH Tinh bột sau xử lý lọc để thu dịch(7,8) Trong đó, DE dịch xử lý tinh bột xác định phương pháp Miller hiệu suất chuyển đổi tinh bột thành maltodextrin xác định thông qua độ Brix dung dịch Tối ưu hóa quy trình tạo β-CD thơ từ dịch xử lý tinh bột Sau thu dịch xử lý tinh bột, tiến hành tối ưu hóa thơng số phản ứng tạo β-CD theo phương pháp bề mặt đáp ứng với phần mềm Design Expert V 7.1 (DX 7.1) Các yếu tố khảo sát gồm nồng độ dịch xử lý tinh bột, lượng enzym sử dụng thời gian phản ứng với thể tích phản ứng 100 ml, thơng số phản ứng lựa chọn dựa tỉ lệ enzym chất quy trình sản xuất từ tinh bột theo nghiên cứu Karube trình sản xuất β-CD từ maltodextrin(4,6) Hình 1: Phản ứng tạo β-CD từ tinh bột với quy trình sử dụng dung mơi Chun Đề Dược Học Nghiên cứu Y học Khảo sát khả tái sử dụng enzym cố định alginat để sản xuất β-CD từ dịch xử lý tinh bột Tiến hành sản xuất β-CD enzym cố định alginat với 100 ml dịch xử lý tinh bột DE 14-15 với điều kiện tối ưu khảo sát Sau phản ứng lấy lượng enzym cố định để xác định hoạt tính enzym theo phương pháp Kaneko Enzym cố định lọc rửa nhiều lần với dung dịch đệm, tiếp tục sử dụng cho phản ứng hoạt tính riêng 50% so với ban đầu KẾT QUẢ Tiền xử lý tinh bột với Termamyl 120L Khảo sát nồng độ tinh bột để tiền xử lý với Termamyl với lượng enzym 24 KU/L, thời gian phản ứng 120 phút Bảng 3: Khảo sát nồng độ tinh bột trình tiền xử lý Nồng độ Đương lượng Độ Brix Đăc điểm dịch tinh bột (%) Dextrose (DE) dung dịch tinh bột sau xử lý 30 41 25,6 Dịch tinh bột 40 32 34,5 Dịch tinh bột 50 18 30,4 60 17 29,7 Dịch đục, tinh bột Dịch đục, tinh bột Dựa vết khảo sát nồng độ tinh bột ban đầu từ 50 đến 60%, thấy dịch tinh bột sau xử lý đục, chứng tỏ mẫu cón tinh bột chưa xử lý Mặt khác nồng độ tinh bột cao làm tăng độ nhớt dung dịch enzym khó tác động lên chất làm giảm hoạt tính enzym So sánh nồng độ tinh bột 30% 40%, có hiệu suất xử lý tinh bột nhau, chúng tơi chọn nồng độ tinh bột 40% để tiền xử lý tinh bột (tạo 34,5g tinh bột xử lý so với 25,6 g nồng độ tinh bột 30%) Sau tiếp tục khảo sát lượng enzym thời gian phản ứng để thu dịch tinh bột sau xử lý có DE từ 14-15) thời gian phản ứng (30 đến 120 phút) đến việc tiền xử lý tinh bột, với nồng độ tinh bột 40%, pH 7, nhiệt độ 90 oC 291 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Nghiên cứu Y học Bảng 4: Đương lượng Dextrose dịch tinh bột sau xử lý Lượng enzym Termamyl 120L (KU/L) 14,4 Thời gian phản ứng (phút) 30 60 90 120 11 15 23 19,2 12 14 20 25 24 17 21 26 32 Bảng 5: Độ Brix dịch tinh bột sau xử lý Lượng enzym Thời gian phản ứng (phút) Termamyl 120L (KU/L) 30 60 90 120 14,4 17,45 21,42 28,95 31,25 19,2 20,33 28,96 31,36 33,64 24 25,14 29,96 32,63 34,47 Khi tăng nồng độ Termamyl thời gian phản ứng DE dịch phản ứng tăng lên Với nồng độ enzym Termamyl 14,4 KU/L, thời gian phản ứng 90 phút enzyme 19,2 KU/L, thời gian phản ứng 60 phút cho DE dịch phản ứng 15; với lượng enzym 24 KU/L sau thời gian 30 phút, DE dịch phản ứng 17, cần giảm thời gian phản ứng để đạt DE 15 Bên cạnh so sánh hiệu trình chuyển đổi thời gian phản ứng kéo dài gia tăng khả chuyển tinh bột thành maltodextrin Vì nghiên cứu chọn điều kiện tiền xử lý tinh bột nồng độ enzym sử dụng 19,2 KU/L với thời gian phản ứng 60 phút cho hiệu suất chuyển đổi tinh bột 72,4% Tối ưu hóa quy trình sản xuất β-CD từ tinh bột tiền xử lý Sau trình xử lý tinh bột với Termamyl thu dịch xử lý tinh bột DE 14 có nồng độ 29%, bên cạnh theo nghiên cứu Isao Karube(4), lượng β-CD tạo tối đa với nồng độ maltodextrin 40% (kl/tt), nhiên nồng độ 40% hiệu suất phản ứng giảm gần 1,5 so với nồng độ maltodextrin từ 20 đến 30% Do khảo sát ảnh hưởng nồng độ dịch tinh bột xử lý với nồng độ 23%, 26% 29% Đối với lượng enzym CGTase tự phản ứng sử dụng tỉ lệ enzym tương tự kết khảo sát chất tinh bột, với lượng enzym khảo sát là: 1400, 2800 4200 U/L với thời gian phản ứng 292 48, 60 72 Các thông số phản ứng tối ưu theo phương pháp bề mặt đáp ứng (RSMResponse surface methodology) phần mềm qui hoạch thực nghiệm Design Expert V7.1 (DX V7.1) để tìm mơ hình thực nghiệm thích hợp Phản ứng thực 25oC, tốc độ lắc 150 vòng/phút, lượng cyclohexan 30% (tt/tt) với thể tích phản ứng 100 ml, gồm 15 thí nghiệm với thí nghiệm trung tâm(5) Bảng 6: Thiết kế thí nghiệm đáp ứng bề mặt (RSM) dịch xử lý tinh bột Nồng độ Thời gian Nồng độ Số TN dịch tinh bột enzym phản ứng (giờ) xử lý (%) (KU/l) Lượng βCD (g) 23 1,400 60 8,02 29 1,400 60 8,68 23 4,200 60 7,24 29 4,200 60 9,32 23 2,800 48 15,71 29 2,800 48 9,52 23 2,800 72 12,04 29 2,800 72 11,44 26 1,400 48 8,38 10 26 4,200 48 10,72 11 26 1,400 72 8,86 12 26 4,200 72 14,02 13 26 2,800 60 18,10 14 26 2,800 60 18,46 15 26 2,800 60 18,16 Dựa vào phần mềm cho thấy liệu hiệu suất phản ứng tạo β-CD phù hợp với mơ hình bậc hai (Quadratic model) với hệ số R2 mơ hình 0,90 Ý nghĩa mơ hình phần mềm phân tích thống kê ANOVA với giá trị P (p-value) mơ hình 0,0468 < 0,05 Như vậy, mơ hình có ý nghĩa thống kê Hình 2: Tương tác thời gian nồng độ dịch xử lý tinh bột phản ứng tạo β-CD Chuyên Đề Dược Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Nghiên cứu Y học Phương trình hồi qui đáp ứng sau: quy trình tạo CD phụ thuộc nhiều vào loại Lượng CD (g) = - 288,26 + 21,09X1 + 12,52X2 + 0,51X3 - 0,458X12 – 2,96X22 -0,013X32 dung môi sử dụng chất ban đầu Với X1, X2, X3 biến số đại diện cho yếu tố nồng độ dịch tinh bột xử lý, lượng enzym, thời gian phản ứng Với hàm mục tiêu thử nghiệm lượng β-CD tạo cao Điều kiện xác định phần dự đoán điểm phần mềm sau: Nồng độ dịch tinh bột xử lý 25,86%, thời gian phản ứng 60,76 h, lượng enzym 2,91 KU/l Với giá trị tối ưu này, lượng β-CD dự đoán 18,29 g Cơng thức dự đốn tối ưu đánh giá cách lặp lại lần thu kết lượng β-CD 18,17 g Như mô hình đáp ứng có tính tương thích với thực nghiệm cao (99,34%) Khả tái sử dụng enzym cố định alginat để sản xuất β-CD từ dịch xử lý tinh bột Bảng 7: Sản xuất β-CD từ dịch tinh bột xử lý với enzym cố định alginat Số lần tái sử dụng Lượng β-CD (g) 103,5 100,3 97,68 96,38 81,52 63,44 40,22 Hiệu suất chuyển 51,77 50,15 48,84 48,19 46,76 31,72 20,11 đổi (%) chất nghiên cứu Zhehova tinh bột Do tinh bột cắt mạch tạo dịch tinh bột xử lý với Termamyl nên hiệu tác động enzym cố định cao so với chất tinh bột Mặt khác thời gian thực phản ứng rút ngắn lần so với sản xuất từ tinh bột nên thời gian sử dụng enzym cố định giảm, enzym cố định alginat có số lần tái sử dụng cao so với sử dụng chất tinh bột Sau lần sử dụng, hiệu suất chuyển đổi giảm 10% so với lần sử dụng đầu tiên, sau lần tái sử dụng hoạt tính 61,27% so với lần đầu Sau hoạt tính enzym cố định giảm nhanh, 39% so với ban đầu Vậy enzym cố định alginat có khả tái sử dụng lần So sánh hiệu việc sử dụng CGTase cố định CGTase tự để tạo β-CD cho thấy sử dụng enzym cố định tiết kiệm 50% chi phí enzym so với việc sử dụng enzym tự dễ dàng tách khỏi sản phẩm kết thúc phản ứng Bên cạnh đó, sản phẩm β-CD (C6H10O5)7 tạo thành từ phản ứng sau tinh chế đạt độ tinh khiết 98% đạt tiêu chuẩn dược dụng bắp 5%, thấp nghiên cứu (tinh KẾT LUẬN bột sắn 40%); kết nghiên cứu Xác định điều kiện tối ưu phản ứng vòng hóa từ dịch xử lý tinh bột enzym cố định alginat với lượng β-CD tạo thành 181,7 g/L Như vậy, việc ứng dụng enzym cố định alginat cho sản xuất β-CD từ dịch xử lý tinh bột khả thi Phương pháp sản xuất β-CD với từ tinh bột xử lý với Termamyl rút ngắn thời gian sản xuất hai lần hiệu suất chuyển đổi chất cao 51%, nồng độ chất sử dụng nhiều 40% so phương pháp sản xuất β-CD từ tinh bột 120 h 39,95%, 8% theo thứ tự(2) Vậy sản xuất β-CD từ tinh bột tiền xử lý với Termamyl rút ngắn thời gian sản xuất hơn, tiết kiệm chi phí sản xuất đem lại hiệu kinh tế cao So sánh với nghiên cứu khác với quy trình có sử dụng dung môi cho thấy hiệu suất tạo thành CD nghiên cứu thấp nghiên cứu Zhekova (2009)(11) với hiệu suất 65% với dung môi toluen 1%, nhiên nồng độ cao kết tạo CD nghiên cứu Shieh (1994)(9) 15,5% với nồng độ chất tinh bột tan 30%, dung môi sử dụng cyclohexan 5% Như hiệu suất chuyển đổi Chuyên Đề Dược Học 293 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 TÀI LIỆU THAM KHẢO 294 Biwer A, Antranikian G et al (2002) Enzymatic production of cyclodextrins Applied Microbiology and Biotechnology, 59(6):609-617 Brewster ME, Loftsson T (2007) Cyclodextrins as pharmaceutical solubilizers Adv Drug Deliv Rev, 59:645–666 Cao X, Jin Z et al (2005) A novel cyclodextrin glycosyltransferase from an alkalophilic Bacillus species: purification and characterization Food Res Int, 38:309-314 Charoenlap N, Dharmsthiti S et al (2004) Optimization of cyclodextrin production from sago starch Bioresour Technol., 92(1):49-54 Karube I, Yoshida N Method of producing β-cyclodextrin 1996, Akebono Brake Industry Co.: USA Moore GRP, Rodrigues L (2005) Cassava and corn starch in maltodextrin production Quim Nova, 28:596-600 Rendleman JA (1997) Enhancement of cyclodextrin production through use of debranching enzymes Biotechnology and Applied Biochemistry, 26:51-61 10 11 Shieh W, Hedges A Process for producing a-cyclodextrin using cyclodextrin glucanotransferase in presence of cyclohexane 1994 Szejtli J (2004) Past, present, and future of cyclodextrin research Pure Appl Chem., 76:1825–1845 Vương Văn Sơn, Vũ Thanh Thảo cs (2012) Cố định cyclomaltodextrin glucanotransferase lên alginat để sản xuất beta- cyclodextrin Tạp Chí Y Học TP.HCM, 16:166-172 Zhekova B, Dobrev G et al (2009) Approaches for yield increase of b-cyclodextrin formed by cyclodextrin glucanotransferase from Bacillus megaterium World J Microbiol Biotechnol., 25:1043-1049 Ngày nhận báo: 12.12.2012 Ngày phản biện nhận xét báo: 24.12.2012 Ngày báo đăng: 10.03.2014 Chuyên Đề Dược Học ... (DE) dung dịch tinh bột sau xử lý 30 41 25,6 Dịch tinh bột 40 32 34,5 Dịch tinh bột 50 18 30,4 60 17 29,7 Dịch đục, tinh bột Dịch đục, tinh bột Dựa vết khảo sát nồng độ tinh bột ban đầu từ 50 đến... sánh nồng độ tinh bột 30% 40%, có hiệu suất xử lý tinh bột nhau, chúng tơi chọn nồng độ tinh bột 40% để tiền xử lý tinh bột (tạo 34,5g tinh bột xử lý so với 25,6 g nồng độ tinh bột 30%) Sau tiếp... tính tương thích với thực nghiệm cao (99,34%) Khả tái sử dụng enzym cố định alginat để sản xuất β-CD từ dịch xử lý tinh bột Bảng 7: Sản xuất β-CD từ dịch tinh bột xử lý với enzym cố định alginat