Đánh giá tác dụng giảm đau, giảm phù nề và cải thiện vận động của nọc ong trên chuột được gây mô hình viêm khớp

Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm đánh giá tác dụng chống viêm giảm đau của nọc ong châm vào các huyệt trên động vật thực nghiệm. Bài viết tiến hành trên 60 chuột, chia thành 5 nhóm: nhóm chứng, nhóm gây viêm khớp (bằng dung dịch adjuvant complete) điều trị nước muối, nhóm gây viêm điều trị bằng nọc ong và nhóm gây viêm điều trị bằng mobic (liều 1 mg/kg).

Tạp chí y - dợc học quân số 3-2017 ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG GIẢM ĐAU, GIẢM PHÙ NỀ VÀ CẢI THIỆN VẬN ĐỘNG CỦA NỌC ONG TRÊN CHUỘT ĐƯỢC GÂY MƠ HÌNH VIÊM KHỚP Nguyễn Thị Thanh Mai*; Cấn Văn Mão** TÓM TẮT Mục tiêu: đánh giá tác dụng chống viêm giảm đau nọc ong châm vào huyệt động vật thực nghiệm Đối tượng phương pháp: tiến hành 60 chuột, chia thành nhóm: nhóm chứng, nhóm gây viêm khớp (bằng dung dịch adjuvant complete) điều trị nước muối, nhóm gây viêm điều trị nọc ong (3 liều khác nhau: 0,5 mg/kg, mg/kg 1,5 mg/kg tiêm vào huyệt Túc tam lý) nhóm gây viêm điều trị mobic (liều mg/kg) Kết quả: dung dịch adjuvant complete (liều 50 µl tiêm bàn chân chuột lần) gây tình trạng viêm khớp, tăng thể tích chân, giảm ngưỡng đau chỗ, gây đau khó vận động khớp Nọc ong (liều mg/kg 1,5 mg/kg) có tác dụng giảm đau, giảm thể tích chân, tăng ngưỡng đau cải thiện khả vận động chuột Tác dụng nọc ong liều 1,5 mg/kg tương tự mobic liều mg/kg chuột Kết luận: nọc ong (liều mg/kg 1,5 mg/kg) có tác dụng giảm đau, chống phù nề, cải thiện vận động chuột gây mơ hình viêm khớp * Từ khóa: Viêm khớp; Nọc ong; Giảm nề; Giảm đau; Vận động The Effects of Bee Venom on Anti-Inflammatory, Pain Reduction and Improvement Motion in Experimental Arthritis Rat Summary Objectives: To study anti-inflammatory, pain reduction effects of bee venom by administration in point accupunture in arthritis model animal Subjects and methods: 60 rats were divided into groups: control group (saline injection), arthritis group (adjuvant injection) with saline treatment, three arthritis groups with bee venom treatments (doses: 0.5 mg/kg, mg/kg and 1.5 mg/kg, respectively) and arthritis group with mobic treatment (1 mg/kg), bee venom and mobic were administered in zusalin acupuncture point in rat’s hind limb Results: Complete adjuvant solution (50 µl) injected in rat’s hind limb (one time) induced joint inflammation, foot volume increase, pain thresold discrease Bee venom (1 mg/kg and 1.5 mg/kg) had analgesic effect, reduced volume, increased pain threshold in rat’s hind limb and improved motion of rat The anti-inflamatory effects of bee venom (1.5 mg/kg) are similar to mobic (1 mg/kg) on rat Conclusion: Bee venom (dose mg/kg and 1.5 mg/kg) has antiflamation, pain relieve and improve motion in arthritis animal model * Key words: Arthritis; Bee venom; Pain reduction; Anti-inflamation; Motion * Trường Đại học Khoa học Tự nhiên ** Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Cấn Văn Mão (canvanmao2001@yahoo.com) Ngày nhận bài: 21/11/2016; Ngày phản biện đánh giá báo: 14/02/2017 Ngày bỏo c ng: 27/02/2017 33 Tạp chí y - dợc häc qu©n sù sè 3-2017 ĐẶT VẤN ĐỀ Nọc ong (Bee Venom) từ lâu sử dụng phương pháp truyền thống, thay thuốc có tác dụng giảm đau điều trị bệnh viêm viêm khớp dạng thấp Trong thí nghiệm động vật cho thấy viêm khớp bị ức chế điều trị nọc ong lâu dài [3, 6] Nọc ong thành phần báo cáo có hiệu điều trị viêm khớp người [4] Thành phần nọc ong đốt có chứa chất enzym A2 (phosphlipases, hyaluronidase), protein peptid (melittin, secapin…) số chất có phân tử nhỏ (histamine, dopamine, norepinephrine…) [4] Nghiên cứu đánh giá tác dụng chống viêm giảm đau nọc ong nhiều nhà khoa học giới thực Có nhiều cách thức sử dụng nọc ong điều trị thực nghiệm như: tiêm da, tiêm bắp… Tuy nhiên, sử dụng nọc ong thủy châm vào huyệt đạo cho có kết mạnh phương pháp khác [9] Có nhiều mơ hình gây viêm khớp động vật thực nghiệm như: gây viêm khớp tá dược freud, carrageenan lipopolysaccharide (LPS), mơ hình gây viêm khớp sử dụng tá dược freud nhiều tác giả áp dụng, coi mơ hình gây viêm khớp điển hình [1] Đặc biệt, đánh giá tác dụng chống viêm giảm đau nọc ong, mơ hình sử dụng rộng rãi [7, 8] Hiện nước chưa có nhiều cơng trình nghiên cứu tác dụng chống viêm giảm đau nọc ong thực 34 nghiệm lâm sàng Mục tiêu nghiên cứu: Đánh giá tác dụng giảm đau, giảm phù nề cải thiện vận động nọc ong chuột gây mơ hình viêm khớp ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng phương tiện nghiên cứu * Đối tượng nghiên cứu: Chuột cống trắng trưởng thành (cân nặng 150 g): chia thành nhóm, nhóm 10 - Nhóm 1: nhóm chứng, không gây viêm khớp, tiêm nước muối sinh lý - Nhóm 2: nhóm bệnh, gây viêm khớp, điều trị nước muối sinh lý - Nhóm 3: gây viêm khớp, điều trị nọc ong liều 0,5 mg/kg - Nhóm 4: gây viêm khớp, điều trị nọc ong liều mg/kg - Nhóm 5: gây viêm khớp, điều trị nọc ong 1,5 mg/kg - Nhóm 6: gây viêm khớp, điều trị thuốc mobic mg/kg * Phương tiện nghiên cứu: - Thiết bị nghiên cứu: + Dụng cụ đo thể tích chân chuột plethysmometer (UGO BASIL), xác định ngưỡng đau Analgesy-Meter (UGO BASIL) + Môi trường mở (openfield) hộp kính (đường kính 90 cm x 90 cm x 50 cm) để đánh giá chức vận động + Hệ thống ghi phân tích hình ảnh Any maze (Stoeling, M) Tạp chí y - dợc học qu©n sù sè 3-2017 Hình 1: Dụng cụ đo ngưỡng đau chân chuột AnalgesyMeter (UGO BASIL) (UGO BASIL) Hình 2: Dụng cụ đo thể tích chân chuột plethysmometer (UGO BASIL) Hình 3: Mơi trường mở (openfield) để đánh giá chức vận động chuột - Hóa chất nghiên cứu: + Dung dịch complete Freund's adjuvant (Sigma Aldrich) + Nọc ong dạng bột + Thuốc mobic (Boehinger Ingelheim), dung dịch NaCl 0,9% Thuốc mobic Dung dịch complete Freund's adjuvant Hình 3: Hóa chất sử dụng nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu * Phương pháp gây viêm khớp sử dụng thuốc, nọc ong điều trị: - Dung dịch complete Freund's adjuvant (có chứa vi khuẩn Mycobacterium butyricium, Hãng Sigma Aldrich) tiêm liều da (50 µl) vào bàn chân sau bên phải (chuột gây mê thiopentan) để gây viêm khớp cổ chân chuột Nhóm chứng tiêm nước muối sinh lý, liều tương đương vào vị trí - Nọc ong Giồng Trơm (Bến Tre) tách chiết dạng bột (sản phẩm nhóm tác giả Nguyễn Thị Thanh Mai CS, Khoa Hóa, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh) với liều lượng khác (0,5 mg: mg; 1,5 mg), hòa tan nước muối tiêm da vào huyệt Zusanli (Túc tam lý, phía gò chày ngồi gần khớp gối) tuần liên tục - Nước muối sinh lý mobic sử dụng tương ứng với thể tích nọc ong tiêm da vào huyệt Zusanli (Túc tam lý), ngày lần tun liờn tc 35 Tạp chí y - dợc học qu©n sù sè 3-2017 Huyệt Túc tam lý (Zusanli) người chuột cống trắng Trên người: Zusanli Trên chuột cống: ST36 Hình 5: Vị trí huyệt Túc tam lý người chuột cống * Phương pháp đánh giá thể tích chân chuột: Chuột bị viêm khớp, chân sưng to (thể tích chân tăng lên) mức độ sưng tương ứng với mức độ viêm khớp Do đó, đánh giá thể tích chân chuột giúp xác định mức độ viêm khớp Cách xác định: đo thể tích chân sau chuột hai bên (cùng bên đối bên gây viêm khớp) phương pháp đo thay đổi thể tích nước sử dụng plethysmometer (UGO BASIL) theo Jae Yeong Lee (2005) [5], ngày/lần đến ngày thứ 21 Đo thể tích chân chuột trước tiêm thuốc gây viêm coi số đối chứng (ngày 0) Số liệu đợt đo sau tính so với đối chứng Hình 6: Đo thể tích chân chuột sử dụng plethysmometer (UGO BASIL) 36 Tạp chí y - dợc học quân sè 3-2017 * Phương pháp xác định ngưỡng đau khớp cổ chân chuột: * Phương pháp đánh giá khả vận động: Khi khớp bị viêm, ngưỡng đau chỗ giảm Vì vậy, xác định ngưỡng đau chỗ thấy mức độ viêm đau Khi chuột bị viêm khớp dẫn đến đau khó vận động khớp Do đó, khả vận động chuột giảm: giảm quãng đường vận động, giảm tốc độ vận động, thời gian vận động… Cách xác định: xác định ngưỡng đau chỗ sử dụng Analgesy-Meter (UGO BASIL) theo phương pháp Seo CS (2003) [9] Chuột giữ thoải mái tay, chân sau bên kích thích vật hình nón, đầu tròn (để khơng gây hại cho động vật), tăng dần lực kích thích đến chuột cảm thấy đau rút chân khỏi vị trí kích thích Thông số ghi lực tác động lên chân chuột chuột rút chân khỏi vị trí kích thích Thông số đo từ trước tiêm thuốc gây viêm khớp sau ngày/lần suốt trình điều trị Cách xác định: cho chuột vào mơi trường mở (open field) hộp có kích thước khoảng 60 cm x 60 cm x 100 cm (rộng x dài x cao) cho làm quen vòng phút Sau đó, ghi lại tồn q trình vận động chuột thời gian phút thành video clip CCD camera nối với máy tính Các thông số vận động chuột phân tích tự động phần mềm thương mại Anymaze (Stoeling, Mỹ) Thí nghiệm đánh giá thời điểm trước sau ngày tiêm thuốc gây viêm khớp ngày lại ghi lại lần Hình 7: Phần mềm ghi phân tích vận động chuột Any maze (Stoeling, Mỹ) * Phương pháp thống kê phân tích số liệu: Số liệu nghiên cứu xử lý thống kê phần mềm Microsoft Excel 2007 phần mềm SPSS version 20 Kết nghiên cứu thể tích bàn chân, ngưỡng đau chân, quãng đường vận động nhóm gây viêm khớp điều trị nọc ong mobic so sánh với nhóm chứng nhóm chứng dương gây viêm khơng điều trị ngày phân tích phương sai chiu (one way ANOVA) 37 Tạp chí y - dợc häc qu©n sù sè 3-2017 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Kết đánh giá mức độ thay đổi thể tích chân chuột (ml) Hình 8: Chân phải chuột sưng viêm sau tiêm dung dịch adjuvant ngày Bảng 1: Thể tích bàn chân chuột theo thời gian (ml) Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày 12 Ngày 15 Ngày 18 Ngày 21 Lô 0,91 ± 0,06 1,00 ± 0,09 1,00 ± 0,09 1,01 ± 0,10 1,01 ± 0,11 0,99 ± 0,08 0,97 ± 0,06 0,96 ± 0,05 Lô 0,99 ± 0,37 1,58 ± 0,59 1,56 ± 0,57 1,54 ± 0,54 1,53 ± 0,53 1,48 ± 0,49 1,49 ± 0,50 1,45 ± 0,46 Lô 1,02 ± 0,28 1,53 ± 0,50 1,51 ± 0,49 1,48 ± 0,45 1,50 ± 0,47 1,44 ± 0,42 1,39 ± 0,37 1,34 ± 0,32 Lô 0,99 ± 0,18 1,49 ± 0,50 1,48 ± 0,49 1,42 ± 0,43 1,38 ± 0,39 1,38 ± 0,39 1,33 ± 0,34 1,27 ± 0,28 Lô 1,00 ± 0,13 1,13 ± 0,07 1,33 ± 0,09 1,27 ± 0,13 1,29 ± 0,07 1,25 ± 0,12 1,21 ± 0,11 1,15 ± 0,11 Lô 1,00 ± 0,11 1,34 ± 0,14 1,26 ± 0,06 1,25 ± 0,08 1,26 ± 0,05 1,18 ± 0,11 1,19 ± 0,10 1,12 ± 0,10 Lô Lô Lô Lô Lô Lô 0.60 0.40 0.20 0.00 Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày 12 15 18 21 Sơ đồ 1: Thay đổi thể tích bàn chân chuột (ml) so với trước tiêm 38 T¹p chÝ y - dợc học quân số 3-2017 Kt qu bảng sơ đồ cho thấy thể tích bàn chân chuột tiêm dung dịch NaCl 0,9% có biến đổi ít, ngày thứ 3, 6, sau tiêm, thể tích bàn chân chuột tăng nhẹ giảm dần ngày thứ 12 sau tiêm Nguyên nhân ngày đầu, trình tiêm vào chân chuột gây kích thích nên thể tích chân chuột có tăng nhẹ, nhiên khơng gây viêm, nên chân chuột khơng bị sưng to chuột nhóm gây viêm dung dịch adjuvant Sau 12 ngày tiêm, thể chuột có thích nghi, nên chân chuột có xu hướng nhỏ lại, tiêm ngày Chuột gây viêm dung dịch Freud’s adjuvant complete tích bàn chân tăng mạnh sau ngày tiêm, kết không thay đổi sau 12 ngày giảm dần từ ngày thứ 12 sau tiêm Các nghiên cứu trước mô hình gây viêm khớp chuột cống cho thấy chân chuột viêm có phù nề, tăng thể tích bàn chân [1] Nghiên cứu Yan-li LIU CS cho thấy: tiêm dung dịch adjuvant vào khớp gối chuột gây tăng chu vi khớp gối từ ngày sau tiêm [10] Jae Yeong Lee CS thấy thể tích chân sau chuột tăng sau tuần tiêm dung dịch adjuvant vào bàn chân chuột [5] Thể tích bàn chân chuột gây viêm điều trị mobic (meloxicam) nọc ong liều 0,5 mg, mg 1,5 mg nhỏ so với chuột gây viêm điều trị dung dịch NaCl 0,9% suốt trình điều trị Kết tương tự như: Jae Yeong Lee Hye Ji Park dùng nọc ong điều trị viêm tiêm dung dịch adjuvant thấy có tác dụng giảm thể tích phù chân chuột [4, 5] Ngoài ra, M Thirumal CS nghiên cứu tác dụng chống viêm dịch chiết Barringtonia acutangula mơ hình chuột gây viêm dung dịch adjuvant nhận thấy có tác dụng giảm thể tích phù chân chuột [7] Với chuột điều trị nọc ong (liều 1,5 mg/kg) mobic (liều mg/kg) tích bàn chân tương đương nhỏ so với nhóm lại Kết cho thấy tác dụng chống viêm giảm phù nề chỗ xung quanh vùng viêm nọc ong (liều 1,5 mg) gần tương đương với tác dụng mobic (liều mg/kg) mạnh dùng nọc ong (liều 0,5 mg/kg mg/kg) Kết xác định ngưỡng đau khớp cổ chân chuột Bảng 2: Ngưỡng đau (N) khớp cổ chân chuột Ngày Ngày Ngày Ngày 12 Ngày 15 Ngày 18 Ngày 21 Lô 4,85 ± 0,78 4,87 ± 0,73 4,75 ± 1,07 4,75 ± 0,77 4,91 ± 0,74 4,90 ± 0,70 4,96 ± 1,17 Lô 2,86 ± 0,84 3,36 ± 1,45 3,36 ± 0,84 3,32 ± 1,03 3,68 ± 0,46 3,45 ± 0,69 3,64 ± 0,71 Lô 3,36 ± 1,42 3,23 ± 0,88 3,18 ± 1,15 3,64 ± 1,40 3,55 ± 0,57 3,68 ± 0,75 3,45 ± 0,72 Lô 3,86 ± 1,19 3,86 ± 1,12 3,86 ± 0,67 4,05 ± 0,47 4,18 ± 0,51 4,05 ± 0,61 3,94 ± 0,90 Lô 4,32 ± 1,08 4,09 ± 0,54 4,32 ± 0,64 4,36 ± 0,74 4,64 ± 0,95 4,36 ± 0,39 4,55 ± 0,91 Lô 4,45 ± 0,76 4,36 ± 1,16 4,59 ± 1,04 4,50 ± 1,02 4,45 ± 0,61 4,32 ± 0,96 4,68 ± 0,96 p p1-2, p2-4, p2-5 < 0,05 p1-2, p2-5 < 0,05 p1-2, p2-5 < 0,05 p1-2, p2-4, p2-5 < 0,05 p1-2, p2-5 < 0,05 p1-2, p2-4, p2-5 p1-2, p2-4, p2-5 < 0,05 < 0,05 39 Tạp chí y - dợc häc qu©n sù sè 3-2017 Ngưỡng đau khớp cổ chân chuột gây viêm dung dịch adjuvant nước muối thấp so với chuột thuộc nhóm lại Kết có lẽ q trình viêm cổ chân chuột làm giảm ngưỡng nhận cảm với kích thích với kích thích đau Trong điều trị nọc ong mobic có tác dụng cải thiện số này, đặc biệt điều trị nọc ong liều 1,5 mg/kg mobic liều mg/kg giúp làm tăng ngưỡng nhận cảm với kích thích đau cổ chân chuột gần giống chuột thuộc nhóm chứng Điều chứng tỏ điều trị nọc ong có tác dụng giảm đau, chống viêm nọc ong liều 1,5 mg/kg có kết gần tương đương với mobic liều mg/kg Kết đánh giá khả vận động Bảng 3: Quãng đường vận động (m) chuột Ngày Ngày 12 Ngày 16 Ngày 20 Lô 6,62 ± 1,19 5,94 ± 2,35 5,74 ± 2,11 5,60 ± 3,18 Lô 3,57 ± 1,69 3,50 ± 1,45 3,39 ± 1,55 Lô 4,64 ± 3,32 4,39 ± 2,78 3,61 ± 3,07 4,16 ± 1,83 Lô 4,59 ± 3,27 4.30 ± 2,00 3,85 ± 3,31 3,45 ± 1,25 5,21 ± 1,76 4,37 ± 2,43 4,39 ± 3,37 5,17 ± 2,30 3,86 ± 1,65 a Lô 6,30 ± 2,19 b1 Lô 6,69 ± 3,04 b 3,51 ± 1,39 5,39 ± 2,11 a b (a: p