Nghiên cứu thực hiện mục tiêu tổng hợp hợp chất đối quang L-nateglinid để làm chất đối chiếu, phục vụ cho công tác kiểm tra độ tinh khiết quang học của D-nateglinid, một dược chất được sử dụng trong điều trị bệnh đái tháo đường týp 2.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG L-NATEGLINID Phan Thanh Dũng*, Kyeong Ho Kim** TÓM TẮT Mục tiêu: Tổng hợp hợp chất đối quang L-nateglinid để làm chất đối chiếu, phục vụ cho công tác kiểm tra độ tinh khiết quang học D-nateglinid, dược chất sử dụng điều trị bệnh đái tháo đường týp Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Xây dựng qui trình tổng hợp L-nateglinid từ L-phenylalanin acid trans-4-isopropyl cyclohexylcarbonyl clorid Sản phẩm tổng hợp sau tinh chế cách hòa tan methanol, loại tạp môi trường acid kiềm, kết tinh n-heptan Độ tinh khiết Lnateglinid kiểm tra cách đo điểm chảy, phổ IR, phổ 13C-NMR, suất quay cực, HPLC sử dụng cột sắc ký pha đảo cột pha tĩnh bất đối Kết quả: Đã tổng hợp L-nateglinid với hiệu suất 26,2%, độ tinh khiết quang học 99,8% Kết luận: Sản phẩm tổng hợp L-nateglinid có độ tinh khiết quang học cao, sử dụng làm chất đối chiếu để kiểm tra tạp đồng phân D-nateglinid Từ khóa: Natelinde, L-nateglinid, tiểu đường týp ABSTRACT STUDY ON THE PREPARATION OF L-NATEGLINIDE Phan Thanh Dung, Kyeong Ho Kim * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 15 - Supplement of No - 2011: 159 - 163 Objectives: The L-enantiomer can be introduced during the synthetic process, the bulk drug substance of nateglinide often contains minor amounts of the L-enantiomer as an impurity This work presents a synthesis method of L-enantiomer for using as reference in monitoring the purity of the bulk drug substance in order to keep content of the L-enantiomer below approved limit Method: The L-nateglinide was synthesized and determined by the chiral HPLC, achiral HPLC, optical rotation, NMR spectroscopy, infrared spectroscopy, and melting point measurement Results: L-nateglinide was synthesized from reaction of trans-4-isopropyl cyclohexylcarbonyl chloride acid with L-phenylalanine Purification of L-nateglinide by dissolving in methanol and then adjusting acid-base conditions to remove impurity The product was finally crystallized from n-heptan Conclusion: L-nateglinide was successfully synthesized with enantiopurity of 99.8%, yield of 26.2% Keywords: nateglinide, L-nateglinde, type diabetes mellitus dược lý độc tính(2,6) ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện khoảng 73% thuốc sử dụng giới dạng đồng phân quang học, khoảng 65% thuốc thuộc dạng đối quang(7) Trong công nghiệp Dược, việc sử dụng nguyên liệu đồng phân quang học ngày quan tâm phát triển mạnh đối quang thường khác rõ rệt tác dụng Nateglinid dẫn xuất acid amin có tác dụng hạ đường huyết cách kích thích tiết insulin từ tuyến tụy Nateglinid sử dụng cho bệnh nhân đái tháo đường týp Nateglinid có đồng phân quang học, đồng phân D-nateglinid sử dụng điều trị lâm sàng có hiệu lực mạnh đồng phân L-nateglinid Trong trình tổng hợp **Khoa Dược Đại học Y Dược TP HCM ** Tác giả liên lạc: TS Phan Thanh Dũng ĐT: (84)-983-957-158; Chuyên Đề Dược Khoa Đại học Quốc Gia Kangwon, South Korea Email: dungpharm@yahoo.com 159 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học nguyên liệu D-nateglinid, tạp đồng phân Lnateglinid cần phải kiểm soát chặt chẽ(4,10) Hiện nay, chất đối chiếu L-nateglinid chưa thương mại hóa Vì đề tài “Nghiên cứu tổng hợp đồng phân đối quang L-nateglinid” thực để làm chất đối chiếu L-nateglinid, phục vụ cho công tác kiểm tra độ tinh khiết quang học D-nateglinid ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Hóa chất dung mơi Tất dung mơi hóa chất đạt tiêu chuẩn phân tích: Nateglinid (99.8%): (Korea), cloroform-d 99.8 % D chứa 0.05% TMS (USA), Lphenylalanin, trans-4-isopropylcyclohexylcarbonyl clorid, acid trifluoroacetic (TFA., 99%), n-hexan, methanol, ethanol, acetonitril, KH2PO4, triethanolamin, NaOH, KOH, HCl, H3PO4, n-heptan (Japan) A Trang thiết bị Hệ thống HPLC LC-10 ADvp Shimadzu, Cột sc ký: Chiralcel AD-H (5 àm, 250 ì 4.6 mm I.D) (Japan) Hệ thống HPLC Jasco PU-980, Cột sắc ký: RS tech ODS C18 (5 àm, 250 ì 4.6 mm), Optimapak Brucker DPX-400 (400.13 MHZ, Brucker, Germany), FTS 3000 MX Excalibur, USA, Fisher Scientific, Malaysia B Hình Cấu trúc hóa học (A) D-nateglinid (B) L-nateglinid Phương pháp nghiên cứu Điều chế tinh khiết hóa L-nateglinide(9) O OH + Cl NH2 l-phenylalanin KOH 10% 0 pH: 13,7-14.8, t = 15 C trans-4-isopropylcyclohexylcarbonylchlorid O H3C CH HCl 35% Khuấy 66 C qua đêm C HO2C * NH H H3C L-nateglinid Đo phổ IR - L-nateglinid sau tổng hợp hòa tan methanol kết tinh môi trường acid kiềm, sau kết tinh n-heptan nhiệt độ sơi sau làm lạnh lọc thu L-nateglinid tinh khiết Trộn mẫu với KBr dập viên đo máy FTS 3000 MX Excalibur, USA bước sóng từ 4000-400 cm−1, độ phân giải cm−1 Phổ xử lý phần mềm Merlin, Version 1.3 Kiểm tra độ tinh khiết L- nateglinid Đo phổ 13 C-NMR Đo điểm nóng chảy Đo máy Fisher Scientific, Malaysia Microscope Cover Glass, Fisher brand Pha dung dịch có nồng độ 10 mg/mL dung môi hỗn hợp cloroform-d 99.8% chứa 0.05% TMS Đo máy Bruker DPX-400 (400.13 MHZ, Bruker, Germany) 160 Chuyên Đề Dược Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học HPLC phân tích L-nateglinide cột pha đảo(5) HPLC phân tích L-nateglinid cột bất đối(8,11): Cột sắc ký: RS tech ODS C18 (5 àm, 250 ì 4.6 mm), Optimapak Pha ng: acetonitril -10 mM đệm KH2PO4 (pH 3.0) (70: 30, v/ v) Nhiệt độ cột phân tích: 20oC Tốc độ dòng: mL/phút, thể tích bơm mẫu: 20 µL, Bước sóng phát hiện: UV 210 nm Cột sắc ký: Chiralcel AD-H (5 àm, 250 ì 4.6 mm I.D.), (Japan) Pha ng: n- hexane-ethanolTFA (75: 25: 0.1, v/ v/ v) Nhiệt độ cột phân tích: 20 oC Tốc độ dòng: mL/phút, thể tích bơm mẫu: 20 µL Bước sóng phát hiện: UV 210 nm Kiểm tra độ tinh khiết quang hoạt Lnateglinid KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Đo máy HORIBA-SEPA 300, Japan Đo suất quay cực Kết điều chế tinh khiết hóa L-nateglinid 1,06 g L- nateglinid 2.4 g L- phenylalanin + 15,5 g H2O, + 9,39 g KOH 10 % + 8,34 ml MeOH + 0,13 g NaOH, + 3,7 g H2O Dung dịch Dung dịch + 7,04 g acetone + 2,277 g trans-4-isopropylcyclohexylcarbonylchloride 1.5 h + giọt (HCl: H2O, 0,14 ml, 0,17 ml) o 10-15 C, khuấy 30 phút Kết tủa Lọc, Rửa với 4,2 ml MeOH :H2O (2:1) Hỗn hợp phản ứng + 7.18 g KOH 10 % Rửa với 8,3 ml H2O - Duy trì pH từ 13.7-14.3 Sản phẩm thơ Hòa tan với 21,7 ml MeOH - Làm lạnh trì 15 C + (HCl: H2O, 0,14 ml, 0,17 ml) Khuấy từ 10 phút Sản phẩm acetyl hóa + 2,73 g H2O + 2,38 g acetone, 2,6 g HCl 35 % + 13,03 g H2O để yên 1.5 h Trầm kết tinh - Khuấy 66oC qua đêm 1,1 g Tinh thể L- nateglinid Hổn dịch + 16,7 ml n-heptane,đun sôi 1.5 h o Làm lạnh, lọc, sấy 50 C 0,56 g L- nateglinid Sơ đồ 1: Điều chế L- nateglinid Sơ đồ 2: Tinh khiết hóa L- nateglinid Bảng Kết điều chế tinh khiết hóa L-nateglinid Kiểm tra độ tinh khiết L-enantiomer Khối lượng (g) Tinh khiết (%) (HPLC) Hiệu suất (%) 0.56 99.78 26,2 % tinh khiết tính theo HPLC: % HPLC = + 25 ml H2O Khuấy 20 phút - Lọc, rửa tủa Đo điểm nóng chảy: D-nateglinid: tnc: 139°C, L-nateglinid: tnc : 138.5°C Nhiệt độ nóng chảy L-nateglinid trùng với nhiệt độ nóng chảy nateglinid Sdinh (enantiomer ) × 100% Sdinh ( R − enantiomer ) + Sdinh ( S − enantiomer ) Chuyên Đề Dược Khoa 161 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học Đo phổ IR Kiểm tra độ tinh khiết (tạp chất liên quan) L-nateglinid HPLC cột pha đảo A L- nateglinid A Mẫu trắng B nateglinid B D-nateglinid -1 (cm ) C L-nateglinid Hình Phổ IR L-nateglinid nateglinid Phổ IR L-nateglinid tương tự phổ IR D-nateglinid Hình Sắc ký đồ : A Mẫu trắng, B 100 μg/mL nateglinid, C 100 μg/mL L-nateglinid Cột sắc ký: RS tech ODS C18 (5 μm, 250 × 4.6 mm), Optimapak Độ tinh khiết sắc ký cột pha đảo 99,78% Đo phổ 13C-NMR A L- nateglinid Kiểm tra độ tinh khiết quang học Lnateglinid phương pháp HPLC cột bất đối Bảng Độ tinh khiết quang hoạt L-nateglinid Khối lượng (g) 0,56 B D-nateglinid Tinh khiết (%) (HPLC) Hiệu suất (%) 99,8 26,2 Hình Phổ 13C-NMR D-nateglinid, Lnateglinid, 400 MHZ A Mẫu trắng Phổ 13C-NMR L-nateglinid Dnateglinid tương tự B D-nateglinid Bảng Các đỉnh đặc trưng D-nateglinid Lnateglinid phổ 13C-NMR TT L-nateglinid TT Nateglinid L-nateglinid Dnateglinid δ (ppm) δ (ppm) δ (ppm) δ (ppm) 19,653 19,657 12 76,685 76,679 28,807 28,808 13 77,003 76,996 28,903 28,903 14 77,204 77,197 29,342 29,348 15 77,320 77,313 29,676 29,675 16 125,970 126,993 32,690 32,691 17 128,398 128,419 37,263 37,249 18 129,423 129,415 43,133 43,134 19 135,979 135,953 45,402 45,394 20 173,515 173,570 10 50,588 50,627 21 176,417 176,458 11 52,804 52,834 C L-nateglinid D L-nataglinid/nateglinid Hình Sắc ký đồ : A Mẫu trắng, B 100 μg/mL Dnateglinid, C 100 μg/mL L-nateglinid D Lnateglinid /L-nateglinid Cột sắc ký:: AD-H column (5 μm, 250 × 4.6 mm) Độ tinh khiết sắc ký cột bất đối 99.8% Đo suất quay cực: [α ]20D = −9.40 (C= D L-nateglinid [α ]20 = +9.40 D-nateglinid /MeOH), mol (C= mol/MeOH) 162 Chuyên Đề Dược Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 KẾT LUẬN Bằng phản ứng amid hóa Lphenylalanin acid trans-4-isopropylcyclohexylcarbonyl clorid điều kiện môi trường kiềm nhiệt độ 15 0C điều chế L-nateglinid, sau tinh chế loại tạp Lnateglinid kiểm tra độ tinh khiết kỹ thuật đại mẫu L-nateglinid đạt độ tinh khiết quang học cao 99,78%, hiệu suất tổng hợp 26,2% cho phép làm chất đối chiếu để kiểm tạp đồng phân nateglinid TÀI LIỆU THAM KHẢO Collins A.N., Sheldrake G.N., Crosby J.C., In Industry, John Wiley, New York, (1994) Drayer D.E., Pharmacodynamic and pharmacokinetic differences between drug enantiomers in humans: An overview Clin Pharmacol Theor (1986), 40, 125 ICH Harmonised Tripartite Guideline, International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use, “Validation of Analytical Procedure Text and Methodology Q2 (R1)”, November 2005 Chuyên Đề Dược Khoa 10 11 Nghiên cứu Y học Keilson L., Mather S., Walter Y.H., Subramanian S., Mcleod J.F., Synergistic Effects of Nateglinide and Meal Administration on Insulin Secretion in Patients with Type Diabetes Mellitus J Clin Endocrinol Metab (2000), 85, 1081 Maddi S., Keshetty S., Mohan Ega C., Yamasani M.R., Scriba G.K., Development and validation of a stereoselective HPLC method for the determination of the in vitro transport of nateglinide enantiomers in rat intestine J Sep Sci., 30 (12) (2007), 1875-1880 Maier N.M., Lindner W., Stereoselective Chromatographic Methods for Drug Analysis Chirality in drug research, 2006 Miller S., Office of New Drug Quality Assessment Center for Drug Evaluation and Research, FDA, 2006 Qi M., Wang P., Sun Y., Li Y., Determination of the LEnantiomer of Nateglinide in a Bulk Drug Substance by Chiral Reversed-Phase Liquid Chromatography J Liq Chromatogr Related Technol (2003), 26, 1839 Takahashi, United States Patent, Patent No: US 7,208,622 B2, Date of Patent: Apr 2007, 24 Whitelaw D.C., Clark P.M., Smith J.M., Nattrass M., Effects of the new oral hypoglycaemic agent nateglinide on insulin secretion in Type diabetes mellitus Diabetes Med., (2000).17, 225 Yang G., Yin J., Li Z., Liu H., Cai L., Wang D., Chen Y., Chiral Separation of Nateglinide and its L Enantiomer on a Molecularly Imprinted Polymer-Based Stationary Phase Chromatographia (2004), 59, 705-708 163 ... D -nateglinid, Lnateglinid, 400 MHZ A Mẫu trắng Phổ 13C-NMR L- nateglinid Dnateglinid tương tự B D -nateglinid Bảng Các đỉnh đặc trưng D -nateglinid Lnateglinid phổ 13C-NMR TT L- nateglinid TT Nateglinid. .. 52,804 52,834 C L- nateglinid D L- nataglinid /nateglinid Hình Sắc ký đồ : A Mẫu trắng, B 100 μg/mL Dnateglinid, C 100 μg/mL L- nateglinid D Lnateglinid /L- nateglinid Cột sắc ký:: AD-H column (5 μm,... D -nateglinid (B) L- nateglinid Phương pháp nghiên cứu Điều chế tinh khiết hóa L- nateglinide(9) O OH + Cl NH2 l- phenylalanin KOH 10% 0 pH: 13,7-14.8, t = 15 C trans-4-isopropylcyclohexylcarbonylchlorid