Bài viết có mục tiêu nhằm xây dựng quy trình đánh giá hoạt tính enzym 5α-reductase từ mô tuyến tiền liệt người để sàng lọc các thuốc có tác động điều trị phì đại tuyến tiền liệt lành tính. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 XÂY DỰNG QUI TRÌNH Đ[NH GI[ HOẠT TÍNH ENZYM 5α-REDUCTASE TỪ MÔ TUYẾN TIỀN LIỆT NGƢỜI Trần Thủy Tiên*, Nguyễn Đức Tồn*, Trần Mạnh Hùng* TĨM TẮT Mục tiêu: Xây dựng qui trình đ{nh gi{ hoạt tính 5α-reductase in vitro từ mô tuyến tiền liệt người để sàng lọc thuốc có t{c động điều trị PĐTTLLT Đối tượng v| phương pháp nghiên cứu Mẫu thử nghiệm: Mẫu mô tuyến tiền liệt bệnh nh}n PĐTTLLT định phẩu thuật bệnh viện Bình Dân, Tp HCM với đầy đủ hồ sơ bệnh án đồng ý bệnh nhân Quy trình tạo dịch đồng thể chứa enzym 5α-reductase: Mơ tuyến tiền liệt đồng hóa, ly tâm thu cắn Hòa cắn với dịch bảo quản tiếp tục nghiền đồng thể thu dịch đồng Định lượng protein dịch đồng thể enzym phương ph{p Bradford Định lượng testosteron phương ph{p ELISA: Thực theo hướng dẫn từ Kit công ty sản xuất DRG, Đức Khảo s{t điều kiện thực phản ứng khử testosteron thành dihydrotestosteron Các yếu tố nồng độ testosteron, nồng độ NADPH, lượng protein enzym, pH thời gian phản ứng khảo s{t để chọn điều kiện phản ứng xảy với hoạt tính enzym cao Kết quả: Qui trình tạo dịch đồng thể chứa 5α-reductase từ mô tuyến tiền liệt người xúc tác cho phản ứng chuyển testosteron thành dihydrotestosteron diễn tiến tốt pH = 5,5, lượng protein enzym tối thiểu 1,4 mg, nồng độ testosteron khoảng 16 ng/ml (55 nM), nồng độ NADPH: 0,15 mM, nhiệt độ ủ: 37 ºC thời gian ủ: 60 phút Finasterid ức chế mạnh 5α-reductase chiết từ tuyến tiền liệt người với IC50 10,87 nM Kết luận: Qui trình tạo dịch đồng thể enzym 5α-reductase v| điều kiện phản ứng khử testosteron thành dihydrotestosteron ứng dụng để sàng lọc thuốc có t{c động ức chế 5α-reductase Từ khóa: Dịch đồng thể enzym, 5α-reductase, in vitro, finasterid ABSTRACT DEVELOPING AN IN VITRO PROCEDURE FOR EVALUATION OF 5α-REDUCTASE ACTIVITY FROM HUMAN PROSTATE TISSUE Tran Thuy Tien, Nguyen Duc Toan, Tran Manh Hung * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement Vol 22 - No 1- 2018: 332 - 339 Aim of study: This study aimed to develop an in vitro procedure for evaluation of 5α-reductase activity from human prostate tissue that was applicable in drug screening Material and methods BHP tissue: tissue was collected from patients undergoing endoscopic surgery for BHP at Binh Dan hospital with complete medical records and agreement of acceptance Procedure to prepare homogenate containing 5α-reductase: BHP tissue was sliced and homogenized Centrifuge the homogenate and remove supernatant Continue to homogenize to form and a homogenous suspension * Khoa Dƣợc, Đại học Y Dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: PGS TS Trần Mạnh Hùng ĐT: 0937746596 332 Email: manhhung1969@yahoo.com Chuyên Đề Dƣợc Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học Protein in the homogenate was assayed by Bradford method Testosterone was assayed by ELISA: using the Kit provided by DRG, Germany Optimizing reactive conditions to covert testosterone into dihydrotestosterone: factors such as testosterone concentration, NADPH concentration, amount of enzymatic protein, pH and reaction time were investigated to establish high enzyme activity in the reaction Results: Procedure to prepare homogenate from BHP tissue containing 5α-reductase catalyzed the conversion of testosterone to dihydrotestosterone under following conditions: pH 5.5, amount of enzymatic protein at least 1.4 mg, testosterone concentration approximate 16 ng/ml, NADPH: 0.15 mM, reaction temperature: 37ºC and reaction time: 60 minutes Finasteride strongly inhibited 5α-reductase in the homogenate with IC50 of 10.87 nM Conclusion: Procedure for preparation of enzyme homogenate containing 5α-reductase and reaction conditions can be applied as a screening tool for 5α-reductase inhibitors Key words: enzym homogenate, 5α-reductase, in vitro, finasteride ĐẶT VẤN ĐỀ Phì đại tuyến tiền liệt l|nh tính (PĐTTLLT) bệnh lý thƣờng gặp nam giới sau tuổi 40 v| thƣờng gây triệu chứng đƣờng tiểu dƣới Với tiến điều trị, đặc biệt kỹ thuật điều trị ngoại khoa, bệnh đƣợc kiểm soát phần n|o v| thƣờng không dẫn đến tử vong Tuy nhiên, triệu chứng bệnh nhƣ đau buốt, tiểu đêm, khó tiểu gây phiền tối, khó chịu, làm ảnh hƣởng đến chất lƣợng sống bệnh nh}n, l|m tăng g{nh nặng bệnh tật v| chi phí điều trị ngƣời cao tuổi Hiện việc điều trị PĐTTLLT bao gồm điều trị nội khoa v| điều trị ngoại khoa, sử dụng loại thảo dƣợc liệu pháp điều trị bổ sung, hỗ trợ Hai nhóm thuốc đƣợc sử dụng phổ biến điều trị PĐTTLLT thuốc chẹn α-adrenergic receptor (terazosin, alfuzosin) thuốc ức chế 5α-reductase (finasterid, dutasterid) 5α-reductase, enzym gắn kết với màng nhân tế bào tuyến tiền liệt có hoạt tính xúc tác khử testosteron thành dihydrotestosteron l| androgen thúc đẩy tăng sinh tế bào tuyến tiền liệt phụ thuộc androgen Do đó, ức chế 5α-reductase chế quan trọng việc nghiên cứu tìm thuốc có tác dụng ngăn tiến triển bệnh nhƣ cải thiện triệu chứng lâm sàng bệnh nhân Chuyên Đề Dƣợc Trên giới có nhiều nghiên cứu enzym 5α-reductase Hoạt tính in vitro 5αreductase màng nhân microsom tế bào mào tinh hoàn chuột nhắt đƣợc nghiên cứu Monsalve cộng sự(6) Sau Normington cộng nghiên cứu khác số động học phân bố mô loại isozym 5α-reductase từ chuột nhắt(7) Pratis cộng nghiên cứu hoạt tính in vitro loại isozym chiết từ tinh hoàn chuột(9) Nghiên cứu so sánh hoạt tính enzyme 5α-reductase từ tuyến tiền liệt mào tinh hoàn chuột nhắt pH trung tính đƣợc thực Span cộng sự(11) Tại Việt Nam, Trần Thủy Tiên cộng sơ tìm đƣợc điều kiện tối ƣu cho hoạt tính in vitro 5α-reductase từ mào tinh hồn chuột(15), nghiên cứu Tạ Quang Vƣợng cộng sau x}y dựng đƣợc quy trình định lƣợng thơng số tối ƣu hóa cho hoạt tính in vitro enzym chiết từ mào tinh hoàn chuột nhắt(12) Tuy chƣa có nghiên cứu cho thấy hoạt tính in vitro 5α-reductase có nguồn gốc từ ngƣời, qua có đƣợc thơng số v| điều kiện để nghiên cứu khả ức chế enzym từ loại thuốc v| dƣợc liệu Xuất phát từ đặc điểm trên, nghiên cứu n|y đƣợc tiến hành với mục tiêu sau: - Xây dựng quy trình tạo dịch đồng thể chứa enzym 5α-reductase từ tuyến tiền liệt ngƣời 333 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 - Khảo sát yếu tố ảnh hƣởng tới hoạt tính in vitro enzym 5α-reductase Định lƣợng protein dịch đồng thể enzym phƣơng ph{p Bradford ĐỐI TƢỢNG-PHƢƠNGPH[P NGHIÊNCỨU Dựa vào phản ứng màu protein với xanh Coomassie, đo độ hấp thu 595 nm Dựa vào đƣờng tuyến tính chuẩn từ albumin bò (BSA), xác định nồng độ protein mẫu Mẫu thử nghiệm Mẫu mô tuyến tiền liệt lấy từ bệnh nhân nam đƣợc định điều trị phì đại tuyến tiền liệt lành tính phƣơng ph{p cắt đốt nội soi bệnh viện Bình Dân, Tp HCM với đầy đủ hồ sơ bệnh án cho phép bệnh nhân Hóa chất thuốc thử nghiệm D,L-Dithiothreitol, độ tinh khiết ≥ 98% (TLC) Sigma Aldrich (số lô SLBK4951V), testosteron độ tinh khiết ≥ 99% (HPLC) Sigma Aldrich (số lô BCBL3419V), β-nicotinamid adenin dinucleotid phosphat tetrasodium dạng khử (NADPH), độ tinh khiết ≥ 95% Santa Cruz (số lô C0315), finasterid Santa Cruz (số lô SC-203954) Các hóa chất phụ trợ kh{c đạt tiêu chuẩn thí nghiệm phân tích Định lƣợng testosteron phƣơng ph{p ELISA Phƣơng ph{p định lƣợng testosteron đƣợc thực theo hƣớng dẫn từ Kit công ty sản xuất DRG, Đức Xây dựng đƣờng tuyến tính định lƣợng testosteron nồng độ testosteron chuẩn: 0,25 - 0,5 - - - -16 (ng/ml) Đo độ hấp thu sau phản ứng bƣớc sóng 450 nm Xây dựng đƣờng tuyến tính theo cơng thức(11,12): Bộ kit định lƣợng testosteron phƣơng ph{p ELISA đƣợc sản xuất DRG, Đức Với Trang thiết bị thử nghiệm B: Mật độ quang mẫu chuẩn C}n ph}n tích Satorious, m{y đo pH, máy nghiền đồng thể tế bào kiểu stato/roto ULTRA TURRAXR T25, máy ly tâm lạnh Sigma, Đức, máy quang phổ UV-Vis HITACHI U-1900, máy đo quang microplate reader BIORAD 16591 v| dụng cụ thí nghiệm khác C: Mật độ quang mẫu trắng Quy trình chiết enzym từ mơ tuyến tiền liệt ngƣời Mô tuyến tiền liệt đƣợc cắt nhỏ, cho vào ống falcon 15 ml có chứa dung dịch bảo quản enzym (sucrose 0,32 M, dithiothreitol (DTT) mM đệm phosphat 20 mM, pH 6,5) Đồng hóa mẫu mơ với tốc độ 16.000 vòng/phút nhiệt độ ºC (nghiền 20 gi}y, ngƣng 10 gi}y, lặp lại lần) Ly tâm dịch đồng thể nhiệt độ -4ºC, lực ly tâm 13.000 g 10 phút, bỏ dịch thu cắn Hòa cắn với lƣợng thể tích dịch bảo quản gấp lần thể tích cắn, sau đem hỗn dịch tiếp tục nghiền đồng thể với thời gian, tốc độ số lần tƣơng tự nhƣ giai đoạn nghiền thứ 334 C: Nồng độ testosteron chuẩn Chọn lựa điều kiện thực phản ứng khử testosteron thành dihydrotestosteron Tiến hành phản ứng khử testosteron thành dihydrotestosteron nhờ vào hoạt tính xúc tác 5α-reductase Hoạt tính enzym đƣợc đ{nh giá giảm lƣợng chất testosteron sau phản ứng xảy Nồng độ testosteron sau phản ứng đƣợc định lƣợng phƣơng ph{p ELISA Nồng độ chất testosteron mẫu phải nằm giới hạn định lƣợng kit 0-16 ng/ml Dung dịch bảo quản DTT đóng vai trò l| t{c nh}n chống oxy hóa, đƣợc sử dụng phản ứng với nồng độ khoảng 0,9-1 Mm(12) Thực phản ứng thăm dò hoạt tính enzym phụ thuộc tác nhân: - pH: thăm dò hoạt tính enzym giá trị pH - 5,5 - - 6,5 - - 8,5 12 Chuyên Đề Dƣợc Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 - Cofactor NADPH: thăm dò nồng độ mM; 0,15 mM 0,3 mM - Dịch đồng thể enzym: tiến hành khảo sát lƣợng protein enzym: 0,28 - 0,56 - 0,84 - 1,12 - 1,4 1,68 mg/ml - Nhiệt độ phản ứng: thực ủ phản ứng nhiệt độ 37ºC Nghiên cứu Y học - Các phản ứng đƣợc thực eppendolf dung tích ml có nắp đậy Kết thúc phản ứng cách đƣa pH > 10 NaOH 0,1M nhằm bất hoạt enzym, ủ nhiệt độ phòng vòng 10 phút v| sau trung hòa HCl 0,1M Hoạt tính enzym đƣợc tính theo cơng thức: - Thời gian phản ứng: khảo sát phản ứng khoảng thời gian 15 - 30 - 60 - 120 phút Khảo sát tác dụng ức chế 5α-reductase in vitro finasterid 1mM; nhiệt độ ủ 37ºC thời gian phản ứng 60 phút nhƣ bảng 1: Thực quy trình tạo dịch đồng thể enzym nhƣ mô tả khảo sát hoạt tính ức chế 5α-reductase dịch đồng thể finasterid với nồng độ (ng/ml) là: 0; 0,1; 1; 5; 10; 15; 20; 30; 100; 1000 X{c định IC50 finasterid Kết cho thấy lƣợng testosteron giảm thực phản ứng, enzym dịch đồng thể có hoạt tính xúc tác cho chuyển hóa testosteron Khi tăng lƣợng protein enzym hoạt tính enzym tăng theo Phản ứng với lƣợng protein 1,68 mg cho hoạt tính enzym khơng tăng so với lƣợng protein 1,4 mg 1,4 mg protein enzym đƣợc chọn cho phản ứng KẾT QUẢ Xây dựng đƣờng tuyến tính định lƣợng protein từ albumin huyết bò (BSA) v| đƣờng tuyến tính định lƣợng testosteron Đƣờng tuyến tính dung dịch BSA chuẩn đƣợc xây dựng khoảng nồng độ 1-6 mg/dL đƣờng tuyến tính testosteron đƣợc xây dựng khoảng nồng độ 0,25-16 ng/ml Khảo sát thay đổi hoạt tính enzym theo hàm lƣợng protein enzym Thực quy trình tạo dịch đồng thể enzym từ tuyến tiền liệt ngƣời v| định lƣợng h|m lƣợng protein, thu đƣợc dịch đồng thể enzym có nồng độ protein 2,81 mg/ml Kết khảo sát ảnh hƣởng lƣợng protein enzym lên hoạt tính 5α-reductase điều kiện: lƣợng chất testosteron ban đầu: 20,17 ng; pH = 6,5; nồng độ NADPH: 0,3 mM; nồng độ DTT: Chuyên Đề Dƣợc Khảo sát thay đổi hoạt tính enzym theo nồng độ NADPH NADPH đƣợc khảo sát nồng độ 0,15 mM 0,3 mM với điều kiện phản ứng nhƣ sau: lƣợng testosteron ban đầu: 15,09 ng; pH = 6,5; lƣợng protein enzym: 1,4 mg; nồng độ DTT: 1mM; nhiệt độ ủ 37ºC thời gian phản ứng 60 phút Kết trình bày bảng Kết cho thấy phản ứng xúc tác enzym gần nhƣ không xảy không sử dụng NADPH phản ứng Điều hồn tồn phù hợp 5α-reductase enzym phụ thuộc NADPH Hoạt tính enzym giảm khơng đ{ng kể nồng độ NADPH giảm từ 0,3 mM xuống 0,15 mM, NADPH đƣợc sử dụng nồng độ 0,15 mM phản ứng 335 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học Biểu đồ 1: Đường tuyến tính dung dịch BSA (A) testosteron (B) Bảng 1: Kết khảo sát thay đổi hoạt tính 5α-reductase theo lượng protein enzym Mẫu Lượng protein enzym (mg) 0,28 0,56 0,84 1,12 1,4 1,68 Lượng testosteron ban đầu (ng) 20,17 Lượng testosteron sau phản ứng (ng) 20,04 19,79 15,95 15,47 9,67 9,48 Hoạt độ enzym (pmol/phút) 0,45 1,32 14,65 16,32 36,46 37,12 Bảng 2: Kết khảo sát thay đổi hoạt tính enzym theo nồng độ NADPH Mẫu Nồng độ NADPH (mM) Lượng testosteron ban đầu (ng) 0,15 15,09 0,30 Khảo sát thay đổi hoạt tính enzym theo pH Phản ứng đƣợc thực khoảng pH = 2-12, với c{c điều kiện: lƣợng testosteron ban đầu: 15,21 ng; lƣợng protein enzym: 1,4 mg; nồng độ NADPH: 0,15 mM, nồng độ DTT: 1mM; nhiệt độ ủ 37 oC thời gian phản ứng 60 phút, nhằm x{c định pH thể hoạt tính enzym cao Kết đƣợc trình bày bảng Lượng testosteron sau phản ứng (ng) 15,00 0,49 0,38 Hoạt độ enzym (pmol/phút) 0,31 50,69 51,07 v| thay đổi không nhiều pH thay đổi khoảng 5,5-8,5 Do dự đo{n đƣợc mô tuyến tiền liệt ngƣời biểu lúc 5α-reductase loại (pH tối ƣu từ 6-8,5) loại (pH tối ƣu 5,5) Do 5α-reductase loại diện c{c quan sinh dục kết từ thí nghiệm này, chọn thơng số pH = 5,5 l|m điều kiện cho phản ứng Kết cho thấy pH = 12, enzym gần nhƣ khơng có hoạt tính Enzym có hoạt tính cao Bảng 3: Kết khảo sát thay đổi hoạt tính enzym theo pH Mẫu 336 pH 5,5 6,5 8,5 12 Lượng testosteron ban đầu (ng) 15,71 Lượng testosteron sau phản ứng (ng) 15,21 0,3 0,59 0,63 0,51 0,48 15,42 Hoạt độ enzym (pmol/phút) 1,74 53,51 52,5 52,36 52,78 52,88 Chuyên Đề Dƣợc Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Khảo sát thời gian phản ứng theo lƣợng testosteron bị chuyển hóa Nghiên cứu Y học nồng độ NADPH: 0,15 mM, nồng độ DTT: 1mM; pH = 5,5 nhiệt độ ủ 37ºC (biểu đồ 2) Kết cho thấy phản ứng xảy với tốc độ nhanh 15 phút đầu tiên, tốc độ phản ứng chậm lại từ 15-60 phút Phản ứng xảy với tốc độ chậm kể từ 60 phút trở v| lƣợng testosteron tham gia phản ứng kể từ 60 phút trở hầu nhƣ khơng thay đổi Do sử dụng thời gian ủ 60 phút cho thí nghiệm Khảo sát tác dụng ức chế 5α-reductase in vitro finasterid Biểu đồ 2: Ảnh hưởng thời gian ủ đến lượng testosteron phản ứng Thời gian phản ứng (thời gian ủ) đƣợc khảo sát thời điểm: 15 -30 - 60 -120 phút nhằm xác định lƣợng testosteron tham gia phản ứng cao c{c điều kiện sau: lƣợng testosteron ban đầu: 16,27 ng; lƣợng protein enzym: 1,4 mg; Finasterid đƣợc khảo sát nồng độ khác (0,1-1000 ng/ml) điều kiện phản ứng: lƣợng testosteron ban đầu: 19,11 ng, pH = 5,5, lƣợng protein enzym: 1,4 mg, nồng độ DTT: 0,9 mM, nồng độ NADPH 0,15 mM, nhiệt độ ủ 37 ºC thời gian ủ 60 phút Kết đƣợc trình bày bảng biểu đồ Bảng 4: Kết khảo sát tác dụng ức chế 5α- reductase in vitro finasterid Mẫu Nồng độ finasterid Logarit nồng (ng/ml) độ finasterid 1000 100 30 1,477 20 1,301 15 1,176 10 0,699 0,1 -1 10 -∞ Lượng testosteron Lượng testosteron sau ban đầu (ng) phản ứng (ng) 18,99 17,09 16,84 16,7 16,22 19,05 14,68 11,37 2,11 1,59 1,28 Hoạt độ enzym (pmol/phút) 0,21 6,81 7,67 8,16 9,83 15,17 26,67 58,82 60,63 61,7 % ức chế enzym 99,66 88,96 87,57 86,77 84,07 75,41 56,77 4,67 1,73 Biểu đồ 3: Tương quan hoạt tính-Log nồng độ (A) v| đường tuyến tính (B) finasterid Chuyên Đề Dƣợc 337 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Kết cho thấy nồng độ ng/ml, finasterid bắt đầu có tác dụng ức chế enzym; nồng độ 1000 ng/ml, finasterid ức chế gần nhƣ hồn tồn hoạt tính enzym, khoảng tuyến tính ƣớc lƣợng đƣợc khoảng nồng độ 1-30 ng/ml Phƣơng trình hồi quy: y = -36,416x + 55,363, với R2 = 0,9587 IC50 ƣớc lƣợng đƣợc finasterid 4,05 ng/ml, tƣơng ứng với 10,87 nM BÀN LUẬN C{c phƣơng ph{p đƣợc sử dụng để định lƣợng protein gồm có: Lowry, acid bicinchoninic, biuret, đỏ pyrogallol-molybdat Bradford Tuy nhiên c{c phƣơng ph{p Lowry, biuret, acid bicinchoninic bị ảnh hƣởng chất khử phản ứng màu xảy mơi trƣờng kiềm(4) Trong đó, theo quy trình chiết enzym, dung dịch bảo quản có pH acid nhẹ (pH= 6,5) v| phƣơng ph{p Lowry, biuret bị ảnh hƣởng có diện chất khử dithiothreitol, c{c phƣơng ph{p n|y khơng phù hợp để định lƣợng protein điều kiện n|y Phƣơng ph{p Bradford thực môi trƣờng acid, đồng thời làm giảm ảnh hƣởng muối đệm, chất khử