Đang tải... (xem toàn văn)
Luận án nhằm xác định các kháng sinh còn nhạy cảm với Vibrio cholerae nhằm giúp cơ sở y tế chọn những loại kháng sinh điều trị bệnh tả có hiệu quả trên người. Luận án là cơ sở khoa học cho việc lựa chọn chủng vi khuẩn có đột biến để sản xuất vaccine phòng bệnh tả trên người; cung cấp thông tin giúp cảnh báo về khả năng gây bệnh trên người của các chủng Vibrio spp; trong các nguồn nước, nguồn thực phẩm có nguồn gốc thủy hải sản tại tỉnh Trà Vinh.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ NGUYỄN THỊ ĐẤU MSHV: 62031005 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN VÀ TÍNH KHÁNG THUỐC CỦA VIBRIO CHOLERAE PHÂN LẬP TẠI TỈNH TRÀ VINH TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC MÃ NGÀNH: 62 42 01 07 CẦN THƠ, 2015 Cơng trình hồn thành tại: Trường Đại học Cần Thơ Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Hồ Thị Việt Thu Luận án bảo vệ Hội đồng chấm luận án cấp Trường Đại học Cần Thơ Vào……giờ…… , ngày……tháng…… năm……… Có thể tìm luận án tại: Thư viện Quốc gia Trung tâm học liệu trường Đại học Cần Thơ Chương 1: GIỚI THIỆU 1.1 Tính cấp thiết đề tài Vibrio cholerae vi khuẩn Gram âm, tác nhân bệnh dịch tả người, gây tiêu chảy cấp tính nước, dịch bệnh xảy với hình thức dịch địa phương đại dịch Thế giới trải qua đại dịch dịch tả, từ năm 1816 đến năm 1923 có vụ đại dịch xảy ra, đại dịch Ấn Ðộ V cholerae O1 type sinh học cổ điển gây Đại dịch thứ khác với đại dịch trước, đại dịch V cholerae type sinh học El Tor gây có nguồn gốc từ đảo Celebes Indonesia năm 1961 Đại dịch kéo dài có phạm vi rộng đại dịch trước đó, đến nhiều nước thơng báo đợt bùng phát dịch tả nguyên nhân gây (Hayes, 2005) Đồng sông Cửu Long, tính đến 19/8/2010 có địa phương gồm: Bến Tre, Tiền Giang, thành phố Cần Thơ An Giang xuất bệnh nhân mắc bệnh tiêu chảy vi khuẩn V cholerae (Nguyễn Hoàng Vũ, 2011) Tỉnh Trà Vinh có vị trí địa lý với nhiều nguy tiềm ẩn bệnh dịch tả có bờ biển kéo dài khoảng 65 km địa bàn Trà Vinh có hệ thống sơng với tổng chiều dài 578 km, có sơng lớn sơng Hậu, sơng Cổ Chiên sơng Măng Thít, dễ cho việc lưu hành vi khuẩn tả từ sông Cổ Chiên giáp với tỉnh Bến Tre, nơi xảy dịch bệnh vào năm 2010 Có nhiều loại kháng sinh sử dụng điều trị bệnh tả đề kháng với vi khuẩn này, có V cholerae, vấn đề phức tạp điều trị bệnh mối quan tâm sức khỏe cộng đồng Nhiễm sắc thể chứng minh yếu tố di truyền gene kháng kháng sinh vi khuẩn Việc thu nhận lây truyền gene kháng kháng sinh yếu tố di truyền plasmid, integrons transposons (Ghosh et al., 2011) Một yếu tố di truyền tích hợp chép nhiễm sắc thể truyền gene kháng kháng sinh vi khuẩn lồi mơi trường (Burrus et al., 2004) Xuất phát từ vấn đề trên, nghiên cứu thực với nội dung: “Nghiên cứu đặc điểm di truyền tính kháng thuốc V cholerae phân lập tỉnh Trà Vinh”, từ giúp sở y tế có chiến lược sử dụng kháng sinh nhằm làm giảm tỉ lệ tử vong, giảm chi phí điều trị bệnh, phù hợp với điều kiện kinh tế khu vực 1.2 Mục tiêu: Xác định tỉ lệ nhiễm type huyết học chủng V cholerae mẫu phân lập được; xác định đặc tính kháng kháng sinh chủng V cholerae kiểu đột biến gene gây kháng thuốc; đánh giá quan hệ di truyền chủng phân lập với chủng công bố tính đáp ứng miễn dịch với V cholerae thỏ chủng vaccine lưu hành thị trường 1.3 Ý nghĩa luận án: Xác định kháng sinh nhạy cảm với Vibrio cholerae nhằm giúp sở y tế chọn loại kháng sinh điều trị bệnh tả có hiệu người Kết luận án sở khoa học cho việc lựa chọn chủng vi khuẩn có đột biến để sản xuất vaccine phòng bệnh tả người; cung cấp thơng tin giúp cảnh báo khả gây bệnh người chủng Vibrio spp nguồn nước, nguồn thực phẩm có nguồn gốc thủy hải sản tỉnh Trà Vinh 1.4 Những điểm luận án Là cơng trình nghiên cứu Đồng sông Cửu Long phân lập chủng V cholerae loại mẫu thức ăn từ hải sản mẫu từ môi trường nước sông nước ao nuôi tôm; xác định type huyết học V cholerae Ogawa Inaba; xác định tương đồng trình tự nucleotide chủng V cholerae phân lập với trình tự nucleotide chủng V cholerae nước thuộc vùng Đông Nam Á; xác định gene kháng tetracycline V cholerae phân lập Bố cục luận án Luận án gồm 108 trang (không kể phần phụ lục), chia thành phần sau: Chương 1: Giới thiệu (4 trang); Chương 2: Tổng quan tài liệu (42 trang); Chương 3: Nội dung, phương tiện phương pháp nghiên cứu (18 trang); Chương 4: Kết thảo luận (43 trang); Chương 5: Kết luận đề nghị (1 trang); Tài liệu tham khảo (16 trang) Luận án có 35 bảng, 40 hình Tổng tài liệu tham khảo 180, gồm 09 tài liệu tiếng Việt, 171 tài liệu tiếng Anh 11 tài liệu tham khảo từ trang Web Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Lịch sử bệnh vi khuẩn tả Năm 1816 bệnh xuất Châu Âu Mỹ, đến đầu kỷ 20 có đại dịch tả lan khắp giới Tiếp đó, đến năm 60 phạm vi gây bệnh vi khuẩn tả khoanh vùng năm gần bệnh chủ yếu xuất Đông Nam Á Năm 1961 type sinh học El Tor gây dịch Philippines tạo sóng thứ bảy Từ trở type vi khuẩn tiếp tục gây vụ dịch châu Á, vùng Trung Đông, châu Phi phần Châu Âu (Colwell, 2004) Từ năm 1991, tỉ lệ mắc bệnh tả vi khuẩn V cholerae O1 xảy Châu Mỹ La tinh (Levine, 1991; Ries et al., 1992), đến năm 1992 bệnh lại xuất lây lan nhanh chóng V cholerae O139 khu vực Đông Nam Châu Á (Shimada et al., 1993) gần bệnh lại bùng phát châu Phi, type huyết non-O1, non-O139, nguyên nhân quan trọng gây tiêu chảy (Sharma et al., 1998) Các nghiên cứu tiến hóa phân tử chủng V cholerae O1 Peru từ năm 1991-1995, Ấn Độ, Thái Lan cho thấy V cholerae O1 trải qua thay đổi di truyền mức tương đối cao Những thay đổi quan trọng việc tìm hiểu dịch tễ học tiến hóa V cholerae (Dalsgaard et al., 1999) Tháng 12 năm 1992 vụ dịch lớn lại xảy nước, vi khuẩn gây bệnh xác định V cholerae O139 Bengal Về mặt di truyền, O139 Bengal hình thành từ type sinh học El Tor cấu trúc kháng nguyên chúng biến đổi Tất lứa tuổi người (kể vùng có dịch) bị nhiễm, vi khuẩn V cholerae O139 gây bệnh 11 nước Đơng Nam Á đến năm 2005 (Garg et al., 2003) Ở Việt Nam bệnh tả nguyên nhân quan trọng gây tiêu chảy từ năm 1850 Năm 1885, đợt bùng phát dịch tả lại xảy đến năm 1910-1930 bệnh tả báo cáo hàng năm (Nguyen, 1962) Đến năm 1964 V cholerae O1 type sinh học El Tor lại gây bệnh miền Nam Việt Nam Trong lịch sử, phần lớn đợt dịch bệnh tả xuất khu vực ven biển miền Trung Nam Việt Nam V cholerae O1 type sinh học El Tor xuất Bắc Việt Nam Đến năm 1976, bệnh có xảy thành phố Hải Phòng tỉnh Quảng Ninh (Dalsgaard et al., 1999) Từ năm 2007 đến năm 2008 năm 2010, chủng vi khuẩn V cholerae O139 phân lập từ mẫu nước đặt tên V cholerae O139 Tuy có lây lan nhanh chóng O139 khu vực Đông Nam Á Việt Nam, có thơng tin bệnh tả O139 gây (Dong Tu Nguyen, 2012) 2.2 Phân loại – Đặc điểm vi khuẩn Vibrio cholerae 2.2.1 Phân loại vi khuẩn V cholerae V cholerae vi khuẩn Gram âm gây bệnh tả người, thuộc chi Vibrio lớp Gammaproteobacteria V cholerae có hai type sinh học chính, type sinh học cổ điển type sinh học El Tor, số nhóm type huyết khác V cholerae phân loại kháng nguyên O phần thân nhóm huyết thanh, đến người ta biết có 200 nhóm huyết (Kaper et al., 1995) Trước năm 1992, nhóm O1 nhóm huyết gây dịch, từ năm 1992 sau nhóm huyết khác O139 gây đại dịch bùng phát Ấn Độ Bangladesh Hiện nay, nhóm huyết nguyên nhân gây bệnh tả lưu hành phát thành dịch; nhóm huyết V cholerae khác không gây thành dịch gom chung lại thành nhóm V cholerae non-O1 non-O139 V cholerae O1 phân type huyết thanh, Ogawa, Inaba Hikojima; type thứ gặp, type huyết chia thành loại kháng nguyên (KN): A, B C 2.2.2 Đặc điểm hình dạng Vibrio cholerae Vi khuẩn V cholerae gọi vi khuẩn tả hay phẩy khuẩn tả, có chiều dài từ 1μm đến μm chiều ngang từ 0,5 μm đến 0,8 μm (1mm = 1.000 μm) Chúng có sợi chiên mao (flagellum) đầu giúp chúng di chuyển nhanh theo hình xoắn ốc loạng choạng Vi khuẩn tả có loại kháng ngun chính: kháng nguyên H (flagellar) kháng nguyên O từ thân vi khuẩn (somatic O antigen) Hình 2.1: Cấu tạo vi khuẩn V cholerae (Korinfo, 2000) 2.2.3 Đặc tính di truyền độc lực Vibrio cholerae Sự xuất TCP độc tố vi khuẩn tả điều khiển yếu tố di truyền bao gồm toxR, tcpH, tcpP, toxT Tất yếu tố di truyền hợp lại thành đặc tính có độc lực V cholerae, đặc tính có liên quan đến tính di động, khả định vị ruột, sản xuất độc tố Khi V cholerae tìm thấy phân bệnh nhân, điều cho thấy có chép di truyền V cholerae độc dễ lây lan Q trình tiến hóa V cholerae gây bệnh lý có giai đoạn quan trọng: trước hết, chủng V cholerae tiếp nhận phage TCP biến thành V cholerae TCP + Sau trở thành TCP+, tức vi khuẩn có tua, tua đóng vai trò thụ thể cho phage CTXΦ phage chui vào vi khuẩn, gắn DNA vào nhiễm sắc thể V cholerae theo chế phage tiềm tan (lysogenic) Bản chất gene CTX TCP bacteriophage từ bên gắn vào nhiễm sắc thể V cholerae V cholerae vốn vi khuẩn “hiền” bị bacteriophage gây nhiễm chúng trở thành chủng sinh độc tố gây bệnh lý V cholerae trở thành chủng sinh độc tố (toxicogenic V cholerae) gây bệnh chúng có tiêm mao giúp vi khuẩn bám vào niêm mạc ruột non Hình 2.2: Sự hình thành chủng V.cholerae có độc tố (Blake, 1994) 2.2.4 Các yếu tố độc lực V cholerae sử dụng hai yếu tố độc lực, độc lực từ tiêm mao/roi (TCP) độc tố tả CTX TCP, mã hóa cho yếu tố gây bệnh, loại protein từ tiêm mao (Kirn et al, 2000), TCP cần thiết cho hình thành khuẩn lạc V cholerae định vị ruột non chuột sơ sinh (Taylor et al., 1987) người (Herrington et al., 1988) Khi hình thành khuẩn lạc ruột non thành công, V cholerae tiết độc tố gây bệnh tả Các độc tố kích thích tế bào biểu mơ ruột non tiết dịch lỏng lòng ruột non, từ có tượng tiêu chảy nước Do đó, đột biến roi số chủng V cholerae ảnh hưởng đến yếu tố độc lực TCP, Hình sau biểu biến đổi roi a Roi dài b Khơng có roi c Roi ngắn a Chủng vi khuẩn hoang dại; b Vi khuẩn đột biến gene; c Vi khuẩn đột biến gene Hình 2.3: Vi khuẩn đột biến roi (Ewen, 2008) Nếu vi khuẩn mang gene đột biến dẫn đến khiếm khuyết việc lắp ráp roi (flagellum) Qua Hình trên, lồi hoang dại (Hình 2.3a) khơng mang gene đột biến nên chiều dài roi dễ dàng nhìn thấy qua hiển vi điện tử; Hình (2.3b) vi khuẩn mang gene flgT đột biến nên khơng hình thành roi; Hình (2.3c) vi khuẩn có roi ngắn diện gene đột biến roi fliA Chương 3: NỘI DUNG, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Nội dung nghiên cứu Phân lập, định danh, tỉ lệ nhiễm vi khuẩn Vibrio spp loại mẫu tỉnh Trà Vinh; định type huyết học vi khuẩn V cholerae phân lập được; giải trình tự nucleotide vi khuẩn V cholerae dựa gene 16S rDNA; xác định gene kháng kháng sinh vi khuẩn V cholerae tuyển chọn; thử nghiệm chủng V cholerae phân lập thỏ nhằm đánh đột biến V cholerae khả đáp ứng miễn dịch vaccine hành Thời gian nghiên cứu từ tháng 10/2012 – 4/2014 Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng Đại học Cần Thơ; Bệnh viện đa khoa Trung ương Cần Thơ; Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học Đại học Cần Thơ; Khoa Nông nghiệp – Thuỷ sản trường Đại học Trà Vinh; mẫu gửi giải trình tự cơng ty Macgrogen Hàn Quốc 3.2 Phương tiện phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Phương tiện nghiên cứu 3.2.1.1 Hố chất, mơi trường nuôi cấy vi khuẩn Nước cất, nước muối sinh lý (NaCl 0,9%), thuốc thử Kowacs, cồn 96o, cồn 70o, muối tinh khiết, alkaline saline peptone water (ASPW) với nồng độ từ 0-10% Môi trường chuyên chở mẫu bệnh phẩm: Cary- Blair (India); môi trường nuôi cấy: TCBS: Thạch Thiosunfat-Citrat-Bile-muốiSacaroza (Merck); SNA: Saline Nutrient Agar (Merck); môi trường làm kháng sinh đồ: MHA (Muller Hinton Agar), đĩa giấy tẩm kháng sinh (Nam Khoa, Tp HCM) Mơi trường hóa chất dùng phân lập vi khuẩn: đĩa giấy oxidase, đĩa giấy ONPG, TSI agar (Saline triple sugar iron agar), ADH (Arginine Dihydrolase), Tryptophan saline (Bộ định danh vi khuẩn Gram âm: IDS 14GNR, Nam Khoa, Tp.HCM) loại đĩa kháng sinh sử dụng: streptomycin (10μg), norfloxacin (10μg), ampicillin (10μg), tetracycline (30μg), azithromycin (30μg), amoxicillin-clavulanic axit (30μg), trimethoprim-sulfamethoxazole (25μg) vancomycin (30μg); thuốc nhuộm Gram: dung dịch crystal violet; lugol; cồn - aceton; safranin (Germany); kháng huyết định type V cholerae: Inaba, Ogawa O139; (Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh) 3.2.1.2 Hoá chất, sinh phẩm dùng cho phản ứng PCR Xác định vi khuẩn dựa đoạn gene 16S rDNA Bảng 3.1: Trình tự nucleotide cặp mồi phản ứng PCR dựa gene 16S rDNA Mồi Trình tự nucleotide mồi (5'3') 27F AGAGTTTGATCCTGGCTC’ 1492R TACGGTTACCTTGTTACGACT ctxA-F ctxA-R Độ dài (bp) Mồi xuôi // Mồi ngược CTCAGACGGGATTTGTTAGGCACG TCTATCTCTGTAGCCCCTATTACG O139rfb-F AGCCTCTTTATTACGGGTGG O139rfb-R GTCAAACCCGATCGTAAAGG 1500 302 449 (1) Weisburg et al., (1991); (2)-(3): Alam et al., (2006) Xác định gene kháng kháng sinh Hố chất ly trích DNA: Tris-HCl, EDTA, H20; hoá chất PCR: Buffer, MgCl2, dNTPS, DMSO, Taq polymerase cặp mồi xác định gene kháng kháng sinh Bảng 3.2: Trình tự nucleotide cặp mồi phản ứng PCR xác định gene kháng kháng sinh Nhóm kháng sinh β-Lactam Aminoglycosid Gene kiểm tra blaSHV aac(3)IV Tetracycline tetA Trimethoprim dhfrI Trình tự nucleotide mồi (5'3') Mồi xuôi // Mồi ngược TCGCCTGTGTATTATCTCCC CGCAGATAAATCACCACAATG GTGTGCTGCTGGTCCACAGC AGTTGACCCAGGGCTGTCGC GTGAAACCC AACATACCCC GAAGGCAAGCAGGATGTAG AAGAATGGAGTTATCGGGAATG GGGTAAAAACTGGCCTAAAATTG Độ dài (bp) 768 286 888 931 (Maynard et al., 2005) 3.2.1.3 Vật liệu nghiên cứu - 160 mẫu nghêu thu từ huyện Duyên Hải, huyện Cầu Ngang; 100 mẫu huyết heo thu từ sở giết mổ heo Thành phố Trà Vinh, huyện Châu Thành, huyện Duyên Hải, huyện Cầu Ngang huyện Càng Long; 40 mẫu phân lấy từ bệnh nhân tiêu chảy bệnh viện Đa khoa tỉnh Trà Vinh; 150 mẫu nước thu từ sông, nước biển địa điểm nuôi tôm; 50 mẫu tôm thu từ huyện Duyên Hải Tất mẫu bảo quản thùng trữ lạnh chuyển phòng thí nghiệm để nuôi cấy, phân lập - Vaccine tả uống (mORCVAX) điều chế từ chủng vi khuẩn tả gồm type sinh học Cổ điển type sinh học El Tor chủng vi khuẩn tả O139 (Công ty TNHH MTV Vaccine Sinh phẩm số 1, Hà Nội); 24 thỏ trắng giống New Zealand, trọng lượng 2-2,5kg/con 3.2.1.4 Thiết bị - Dụng cụ Tủ sấy, tủ ấm, tủ lạnh, autoclave, máy lắc, buồng cấy vơ trùng kính hiển vi, cân điện tử, ống nghiệm, đĩa petri, chai, ống đong, ống hút, lam, kẹp, kéo, tăm vô trùng, găng tay, đèn cồn, túi nilon 3.2.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.2.1 Phương pháp phân lập, định danh vi khuẩn * Phương pháp lấy mẫu * Nhuộm Gram: Vi khuẩn Vibrio spp thuộc nhóm Gram âm nên sau nhuộm Gram vi khuẩn bắt màu hồng nhạt có hình que ngắn, sau xem kính hiển vi điện tử b Xác định chủng V cholerae máy định danh tự động (Vitex compact- Biomerieux - BVĐK Trung ương Cần Thơ) Nguyên lý định danh vi sinh vật dùng phương pháp đo màu để nhận biết tính chất sinh hố vi sinh vật thơng qua thay đổi màu giếng mơi trường có sẵn thẻ (card) Các thẻ định danh phủ hoá chất tối đa 64 giếng, giếng có hố chất đặc biệt phù hợp với tính chất sinh hố vi sinh vật khác c Phương pháp định type huyết học Việc định type huyết V cholerae thực phản ứng ngưng kết với loại kháng huyết Inaba, Ogawa, O139 kháng huyết đa giá Inaba + Ogawa + O139 (Trần Linh Thước, 2009) d Xác định vi khuẩn Vibrio spp kỹ thuật PCR Các gốc vi khuẩn kiểm tra kỹ thuật PCR, dựa gene 16S rRNA Sản phẩm PCR phân tích gel agarose 1,5% dung dịch đệm TBE 1X điện 100V 90 phút chụp máy chụp hình gel Biorad UV 2000, thang chuẩn 100 bp (công ty Fermentas) 3.2.2.2 Phân tích trình tự gene 16S RNAvà thiết lập di truyền Sản phẩm PCR (DNA) ký hiệu trình tự chủng thuộc Vibrios: V cholerae-Ng3, V cholerae-O3.2, V cholerae-O1.2, V cholerae-81V1, V cholerae-N8 V cholerae-85V1, giải trình tự cơng ty Macrogen Inc (Hàn Quốc) Các trình tự phân tích đọc phần mềm Bio.Edit, sau so sánh với trình tự nucleotide tương đồng Genbank thiết lập di truyền 3.2.2.3 Xác định kháng kháng sinh vi khuẩn V cholerae a Xác định kháng kháng sinh PP Kirby Bauer * Chọn 08 loại kháng sinh thường sử dụng để điều trị bệnh đường ruột, đặc biệt bệnh tả Sau ủ 18 đến 24 giờ, đo đường kính vùng ức chế, kể đường kính khoanh giấy kháng sinh đọc kết dựa vào bảng tiêu chuẩn đánh giá nhạy cảm kháng sinh vi khuẩn đường ruột (CLSI, 2010) b Xác định kháng kháng sinh V cholerae kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) 10 Sau ly trích DNA, tiếp tục xác định gene kháng kháng sinh kỹ thuật PCR với trình tự cặp mồi tương ứng với gene kháng kháng sinh gồm blaSHV, aac(3)-IV, tetA dhfrI Sản phẩm PCR phân tích gel agarose 1.5% dung dịch đệm TBE 1X 100V 90 phút chụp máy chụp hình gel Biorad UV 2000, thang chuẩn 100 bp (cơng ty Fermentas) 3.2.2.4 Phân tích trình tự gene kháng kháng sinh thiết lập di truyền Sản phẩm PCR (DNA) xác định gene kháng kháng sinh sau giải trình tự cơng ty Macrogen Inc (Hàn Quốc) Các trình tự phân tích, đọc phần mềm Bio.Edit, so sánh với trình tự nucleotide tương đồng Genbank thiết lập di truyền 3.2.2.5 Thử nghiệm chủng V cholerae phân lập đáp ứng miễn dịch thỏ vaccine tả Phương pháp thí nghiệm * Thử nghiệm độc lực đáp ứng miễn dịch: 12 thỏ thí nghiệm cho uống vaccine tả với liều 1,5 ml/con, lặp lại lần vào ngày thứ 14 Sau 28 ngày uống vaccine, thực mổ khám; 12 thỏ không cho uống vaccine chế độ nuôi dưỡng Tiêm chủng vi khuẩn phân lập (N8, O3.2, O1.2, Ng3, 85V1 81V1) vào ruột thỏ không uống vaccine thỏ uống vaccine nhau, sau mổ khám xác định tính đáp ứng miễn dịch lơ thí nghiệm Thỏ gây mê để phẫu thuật, ruột non cột thành đoạn, đoạn 10 cm, cách cm Dùng kim tiêm ml vi khuẩn (có chứa x 105 - x 107 CFU) vào lòng đoạn ruột, đóng xoang phúc mạc, kiểm tra chất lỏng thời điểm 3, 6, 9, 16 sau tiêm Các tiêu theo dõi: (i) Xác định ti lệ dịch lỏng (FA: Fluid accumulation): Tỉ lệ dịch lỏng tích tụ đoạn ruột xác định số lượng dịch lỏng (ml)/chiều dài đoạn ruột thỏ (cm) (ii) Sự bám dính vi khuẩn vào bề mặt đường ruột: Cắt đoạn ruột, cạo niêm mạc ruột dịch lỏng lòng ruột, sau pha lỗng chất lỏng theo dãy thập phân (log 10) Kết tính theo công thức: Mi (CFU/ml) = Ai x D1/v (Mi: số lượng vi khuẩn dung dịch ban đầu; Ai: số khuẩn lạc trung bình/đĩa; D1: độ pha lỗng; v: dung tích huyền dịch /đĩa) Chuẩn bị chuỗi pha lỗng: 11 (iii) Tỉ lệ vi khuẩn bám dính vào niêm mạc ruột non thỏ Phần trăm (%) bám dính = 100 x số vi khuẩn bề mặt ruột/ số vi khuẩn bề mặt ruột + CFU dịch lỏng (Richardson, 1991) Xử lý số liệu: Phần mềm Excel: tính giá trị trung bình tỉ lệ nhiễm V.cholerae tỉ lệ kháng kháng sinh; phần mềm BioEdit: phân tích kết giải trình tự nucleotide; phần mềm MEGA (Treeview): vẽ giản đồ phả hệ; Minitab version 16.0: phân tích giá trị FA CFU Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết phân lập định danh Vibrio spp 4.1.1 Kết phân lập Vibrio spp Vi khuẩn Vibrio spp phát triển mơi trường thạch muối-sucrose thiosulfate citrate-mật (TCBS): khuẩn lạc màu vàng màu xanh tuỳ lồi Nhìn chung khuẩn lạc thuộc loài V.cholerae, V vulnificus; V fluvialis V alginolyticus có màu vàng, riêng khuẩn lạc V paraheamolyticus có màu xanh; kích thước khuẩn lạc lồi khác (Trần Linh Thước, 2009) 4.1.2 Kết định danh Vibrio spp phản ứng sinh hóa Quan sát đặc tính sinh hóa để phân biệt lồi thuộc Vibrio spp Hầu hết tạo sản phẩm oxidase catalase, lên men đường không sinh hơi; V cholerae, V paraheamolyticus, V fluvialis V alginolyticus không lên men đường lactose, riêng V cholerae V alginolyticus có khả oxy hóa tryptophan vi khuẩn thành sản phẩm biến dưỡng có gốc indole gồm indole, sketole tạo nên phức chất có màu đỏ (Trần Linh Thước, 2009) Tất loài V cholerae, V vulnificus, V fluvialis V alginolyticus âm tính với urê, riêng V parahaemolyticus có phản ứng dương tính với urê Vibrio spp phát triển nồng độ muối thích hợp: 0-2%, 2-6%, 2-8% từ 2-10% 12 Bảng 4.1: Kết thử sinh hố lồi thuộc Vibrio spp Test SH K lạc Oxidase V.cholerae Vàng (+) Vibrio spp V.paraheamolyticus V.vulnificus Xanh Vàng (+) (+) V.fluvialis Xanh (+) TSI V.alginolyticus Vàng (+) (+) Glucose (+) (+) (+) Lactose (-) (-) (+) (-) (-) Sucrose + (-) (-) (+) (+) LDC (+) (+) (+) (-) (+) Di động (+) (+) (+) (+) (+) ONPG (+) (+) (+) (+) Indole (+) (-) (-) (-) (+) Urease (-) (+) (-) (-) (-) PAD (-) (-) (-) (-) Citrate (-) (-) (-) (-) (+) Hình dạng vi khuẩn V cholerae kính hiển điện tử với độ phóng đại 5.000 10.000: Hình 4.1: Vi khuẩn kính hiển vi điện tử, độ phóng đại 5.000 10.000 lần Hình ảnh vi khuẩn V cholerae chủng O3.2 qua kính hiển vi điện tử có hình cong, có chiều dài từ µm – µm, có roi ngắn V cholerae sử dụng hai yếu tố độc lực từ tiêm mao/pili (TCP) độc tố dịch tả CTX 13 TCP cần thiết cho hình thành khuẩn lạc V cholerae định vị ruột non chuột sơ sinh (Taylor et al., 1987) người (Herrington et al., 1988) Vi khuẩn nghiên cứu có roi ngắn, điều khiếm khuyết việc lắp ráp roi có diện gene đột biến nên chiều dài roi khơng nhìn thấy qua kính hiển vi điện tử 4.1.3 Kết định danh Vibrio spp kỹ thuật PCR Hình 4.2: Sản phẩm khuếch đại đoạn gene 16S-27F 1492Rbp Kết điện di hình cho thấy sản phẩm PCR dài 1500 bp tương đương với đoạn gene 16S rRNA tất chủng thuộc Vibrio spp dài 1.500 bp (William et al., 1991) bao gồm khu vực bảo tồn cao có mặt hầu hết vi khuẩn có phân nhánh có mối quan hệ gần Đối chiếu kết kiểm tra đặc tính sinh hóa với sản phẩm từ PCR, nghiên cứu ghi nhận loài thuộc Vibrio lần lượt: V cholerae vạch từ 1-6; V fluvialis từ 7-11; V paraheamolyticus từ 12-19; V vulnificus từ 20-23; V alginolyticus từ 24-25 Cũng qua nghiên cứu này, chưa phát chủng thuộc Vibrios mang gene O139rfb chủng mang gene mã hoá độc tố CTXA mẫu từ môi trường nước thức ăn có nguồn gốc thủy sản Như vậy, qua kết PCR chưa phát chủng thuộc Vibrio mang gene O139rfb mang gene mã hoá độc tố tả CTX mẫu từ môi trường nước thức ăn có nguồn gốc thủy sản Điều chứng tỏ Vibrio O139 chưa xuất phổ biến tỉnh Trà Vinh 14 4.1.5 Tỉ lệ hát Vibrio spp loại mẫu phân lập Trên mẫu nghêu, có diện đa dạng loài thuộc Vibrio spp., lồi sinh vật sống vùng nước mặn, phù hợp cho vi khuẩn Vibrio spp ký sinh, lồi V cholerae 1,9 % Trong huyết heo có sử dụng nguồn nước từ sơng để sử dụng q trình giết mổ rửa thịt, pha vào huyết (lúc chọc tiết), tỉ lệ dương tính 2% với V cholerae tương ứng với tỉ lệ V cholerae phân lập từ nguồn nước sông (Bảng 4.2) Kết tương đương với kết phân lập thành phố Hồ Chí Minh với tỉ lệ 1,1% mẫu nước 2,2% mẫu thực phẩm; Bến Tre mẫu nước 5,7% (Nguyễn Hồng Vũ, 2013), Bến Tre tỉnh có bệnh dịch tả xảy vào năm 2010 Bảng 4.2: Tỉ lệ nhiễm Vibrio spp loại mẫu Loại mẫu Loài Vibrios (n = 500) Nghêu (n = 160) Huyết heo (n = 100) Số mẫu kiểm tra Dương tính Số mẫu Tỉ lệ (%) V cholerae 160 03 1,9 V paraheamolyticus 160 03 1,9 V vulniticus 160 04 2,5 V fluvialis 160 05 3,1 V alginolyticus 160 01 0,63 V cholerae 100 02 2,0 V paraheamolyticus 100 02 2,0 Nước (n = 150) + Nước sông V cholerae 50 01 2,0 + Nước biển V alginolyticus 50 01 2,0 + Nước ao nuôi tôm V paraheamolyticus 50 02 4,0 Tôm (n = 50) V paraheamolyticus 50 01 2,0 40 0,0 Phân (n = 40) Tổng cộng 25 Trong 25 chủng phân lập bao gồm chủng thuộc loài V cholerae (24%); chủng thuộc loài V paraheamolyticus (32%); chủng thuộc loài V vulnificus (16%); chủng thuộc loài V fluvialis (20%) chủng thuộc loài V alginolyticus (8%) Kết từ Bảng cho thấy tỉ lệ phân lập V paraheamolyticus cao (32%), chúng xuất nghêu, nước sông, đặc 15 biệt nước ao ni tơm có độ mặn từ - 8% tôm, phù hợp với môi trường sống chúng Nghêu ký chủ thường xuyên V vulniticus; V fluvialis V alginolyticus 4.2 Kết định type huyết Kết định type huyết học chủng Vibrio cholerae phân lập phản ứng ngưng kết cho thấy 100% (6/6) chủng dương tính với kháng huyết đa giá (Ogawa, Inaba, O139), 50% (3/6) chủng thuộc Ogawa 50% (3/6) chủng thuộc Inaba 4.3 Kết tính tương đồng lồi thuộc Vibrio Genbank cơng cụ BLAST Trong nghiên cứu này, chủng đại diện thuộc loài Vibrio spp phân lập gồm chủng Ng3, O3.2, O1.2, N8 O9.1 có tỉ lệ tương đồng trình tự nucleotide đoạn gene 16S-27F 1492R chủng phân tích với chủng khác thuộc lồi V cholerae cao Hình 4.3: Cây biễu diễn mối quan hệ di truyền dựa 16srDNA Vibrio spp phân lập số chủng tham khảo Hình cho thấy chủng vi khuẩn phân lập có đặc điểm tương tự chủng có nguồn gốc từ môi trường, chứng tỏ 16 chủng thuộc Vibrio spp ln có nguy tiềm ẩn dễ dàng gây thành dịch bệnh tiếp nhận gene từ chủng có độc lực CTX 4.4 Sự kháng kháng sinh V cholerae 4.4.1 Kết khảo sát kháng KS V cholerae phương pháp Kirby Bauer (CLSI, 2010) Bảng 4.3: Sự nhạy cảm đề kháng kháng sinh V cholerae Kháng sinh Streptomycin Norlfoxacin Ampicillin Tetracyclin Azithromycin Amoxicillinclavulanic acid Trimethoprimsulfamethoxazole Vancomycin Ký hiệu Sm Nr Am Te Az Ac SXT/Bt Van Nhạy cảm Số mẫu % Số mẫu kiểm tra Kháng Số mẫu % 6 6 6 4 50 10 83 67 67 83 2 50 17 33 33 17 67 33 33 67 Các kết cho thấy, chủng V cholerae nghiên cứu nhạy cảm cao với nhiều loại kháng sinh norfloxacin (100%), ampicillin (83%) amoxicillin-clavulanic acid (83%) Ngoài ra, V cholerae kháng với vancomycin (67%), streptomycin 50%, tetracycline 33% Kết phù hợp với kết nghiên cứu Nguyễn Thị Xuân Trang Nguyễn Ngọc Tuân (2012); Huu Dat Tran (2012) 4.4 Sự diện số gene kháng kháng sinh vi khuẩn phân lập kỹ thuật PCR M tetA (880bp) 900bp M: thang chuẩn 100bp, 1: V.cholerae (T1), 2: V.cholerae (T3) Hình 4.4: Sản phẩm khuếch đại đoạn gen tetAF testAR 17 Kết điện di hình trên, cho thấy sản phẩm PCR dài khoảng 880bp tương ứng với đoạn gene tetA phát chủng V cholerae Gene tetA có trình tự bảo tồn đặc trưng cho V cholerae nên sản phẩm PCR quan sát thuộc chủng V cholerae T1 T2 Qua nghiên cứu, chưa phát chủng V cholerae mang gene kháng kháng sinh blaSHV, aac(3)-IV dhfrI Chủng V cholerae (T1) chủng V cholerae (T3) phân lập từ môi trường nước chúng mang gene kháng tetracycline, thuộc nhóm Aminoglycosid Như số chủng nghiên cứu không chứa gene kháng tetracycline (tetA), chúng có khả kháng với tetracycline, diện gene khác mã hóa kháng với tetracycline blaSHV, aac(3)-IV dhfrI Kết tương tự kết Dang et al, (2006) 4.4.5 Kết so sánh trình tự nucleotide chủng V cholerae T1, T3 với chủng V cholerae hoang dại N16961 tìm dạng đột biến Các vị trí nucleotide chèn vào tương ứng với vị trí acid amin thay đổi chuỗi trình tự chủng V cholerae, từ suy luận kiểu đột biến chủng V cholerae phân lập Bảng 4.4: So sánh vị trí acid amin chủng V cholerae hoang dại N16961 với chủng V cholerae T1 Codon 14 51 52 69 71 74 105 106 121 142 160 161 164 165 166 Thay đổi Nucleotide AGT→CTG CCT→TGA TGG→TCA CGT→TAG GTT→TAA A-T→TCA CA - →CG - TG→-TG GCT→TAG GGT→TGA AAA→TGA GTA→TGA CTT→TGA GAA→TGA TCA→TGA Thay đổi acid amin Ser→Leu Pro →End Trp→Ser Arg→End Val→End → Ser → → Ala→End Gly →End Gly →End Val →End Leu →End Glu→End Ser→End 18 Số nucleotide T1 1 Thêm đoạn Kiểu đột biến Sai nghĩa Dịch khung Sai nghĩa Dịch khung Dịch khung Vô nghĩa Vô nghĩa Vô nghĩa Dịch khung Dịch khung Dịch khung Dịch khung Dịch khung Dịch khung Dịch khung Khi so sánh vị trí nucleotide chủng V cholerae hoang dại N16961 với vị trí nucleotide chủng V cholerae T1 phân lập được, nhận thấy chủng V cholerae T1 có tượng đột biến thêm từ 1- nucleotide nhiều codon, dẫn đến tượng thay đổi vị trí acid amin thay đổi cấu trúc protein Chủng V cholerae T1 có codon kết thúc 10 vị trí, tương ứng với 10 vị trí acid amin, đột biến dịch khung thêm vào bớt đến hai nucleotide, dẫn tới stop codon (end) điều làm ngừng tổng hợp chuỗi polypeptid enzyme bị ngừng hoạt tính (Nguyễn Hồng Lộc, 2007) Bảng 4.5: So sánh vị trí acid amin chủng V cholerae hoang dại N16961 với chủng V cholerae T3 Codon 14 17 19 23 24 32 48 52 53 54 55 63 71 74 95 100 106 124 161 Thay đổi Nucleotide TAA→TGA AGT→CTG TGA→ATC ACA→CCC GAT→CTC TCA→TAC AAC→ATC ACA→CGC TGG→CTA GAT→GCG CTA→GCG AAA→TAT GGA→GAA GTT→GAG A-T→G- AAA →TGA ATT→TGA GAA → TAA GCA→TAA GTA→TAA Thay đổi acid amin Số nucleotide T3 Kiểu đột biến End →End Ser→Leu End→Ile Thr→Pro Asp→Leu Ser→Tyr Asn→Met Thr→Ala Trp→Leu Asp→Gly Leu→Gly Lys→Tyr Gly→Glu Val→Glu → Lys →End Ile→End Glu→End Ala→End Val→End Thêm đoạn 1 3 1 3 2 Dịch khung Sai nghĩa Vô nghĩa Sai nghĩa Sai nghĩa Sai nghĩa Sai nghĩa Sai nghĩa Sai nghĩa Sai nghĩa Sai nghĩa Sai nghĩa Sai nghĩa Sai nghĩa Vô nghĩa Dịch khung Dịch khung Dịch khung Dịch khung Dịch khung Tương tự với T1, so sánh vị trí nucleotide chủng V cholerae hoang dại N16961 với vị trí nucleotide chủng V cholerae T3 phân lập được, nhận thấy chủng V cholerae T3 có tượng đột biến thêm 19 từ 1- nucleotide codon, dẫn đến tượng thay đổi vị trí acid amin thay đổi cấu trúc protein Chủng V cholerae T3 có codon kết thúc vị trí, tương ứng với vị trí acid amin, đột biến dịch khung thêm vào bớt đến hai nucleotide, dẫn tới stop codon (end) điều làm ngừng tổng hợp chuỗi polypeptid enzyme bị ngừng hoạt tính (Nguyễn Hồng Lộc, 2007) 4.4.6 Quan hệ di truyền chủng V cholerae dựa vào gene kháng kháng sinh tetA Trong nghiên cứu này, chủng V cholerae phân lập Trà Vinh có mang gene mã hoá gene kháng kháng sinh tetracycline phân lập mẫu nước mẫu nghêu có tỉ lệ tương đồng trình tự nucleotide với chủng khác Thái Lan, Nhật Bản, Trung quốc, Indonesia, Brazil Ấn Độ, tương đồng 97% với 10 chủng; tương đồng 96% với 01 chủng tương đồng 94% với 04 chủng khác Hình 4.5: Quan hệ di truyền chủng V cholerae dựa vào gene kháng kháng sinh tetA Kết phát sinh loài chủng V cholerae T1 T3 phân lập từ nước sông Trà Vinh mang gene kháng kháng sinh có mối liên hệ gần trình tự nucleotide (97%) với nhiều chủng V cholerae khác phân lập Indonesia năm 2008; Brazil năm 2012; Haiti năm 2010; Trung Quốc năm 2008; Bangladesh năm 2009; Thái Lan năm 2014 V cholerae non-O1 vcmD phân lập Nhật Bản năm 2005 20 Như vậy, cho thấy chủng nghiên cứu có chế kháng kháng sinh tương tự với chủng so sánh nguy di truyền gene kháng kháng sinh cao chùng thuộc loài V cholerae 4.5 Thử nghiệm độc lực chủng V cholerae đánh giá đáp ứng miễn dịch thỏ 4.5.1 Kết đánh giá chủng V cholerae thỏ khơng uống vaccine phòng bệnh tả 4.5.1.1 Lượng dịch lỏng FA (Fluid accumulation): Sau đưa huyền dịch vi khuẩn vào ruột non thỏ với liều 105 – 107, lượng dịch lỏng tiết thu hồi qua biểu đồ sau: Dịch lỏng (ml) Thời gian (giờ) Hình 4.6: Biểu đồ tỉ lệ dịch lỏng sau tiêm vi khuẩn vào ruột non thỏ Qua kết trên, nhận thấy chủng V cholerae hoang dại N16961 bắt đầu tích luỹ dịch lỏng thời gian 16 sau tiêm vi khuẩn 1.45 ml – 2.3 ml/cm cao so với chủng V cholerae T1 V cholerae T3 nghiên cứu có mang gene kháng tetracycline tiêm vào ruột non thỏ khơng kích thích niêm mạc ruột non thỏ tiết dịch lỏng, tiết từ 0.8 – 0.9 ml/cm thời điểm giờ, sau giảm dần 0.15 - 0.2 ml/cm thời điểm 16 Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p0,05) Như vậy, tất thỏ có uống vaccine phòng bệnh tả có kháng thể nên dịch lỏng không tiết ruột non 4.5.2.2 Số lượng V cholerae bám dính niêm mạc ruột non thỏ uống vaccine phòng bệnh tả Số lượng vi khuẩn thu được: giờ, giờ, 16 : CFU V.cholerae Hình 4.9: Biểu đồ V cholerae bám dính niêm mạc ruột non Qua Biểu đồ nhận thấy số đơn vị vi khuẩn bám dính niêm mạc ruột non cao thời điểm sau giảm dần thời điểm 16 tất chủng vi khuẩn, riêng chủng T1, T3 số lượng vi khuẩn bám dính tạm thời thời điểm từ 8,104 đến 105, sau giảm xuống đáng kể thời điểm 12,103 đến 20,103, đến thời điểm 16 tất chủng khơng bám dính vào niêm mạc ruột non, chứng tỏ V cholerae bị ức chế kháng thể tiết từ niêm mạc ruột non Vậy, tất thỏ có uống vaccine phòng bệnh tả có kháng thể nên hàm lượng vi khuẩn bám dính tạm thời thời điểm giờ, sau khơng bám dính vào niêm mạc ruột non thời điểm 16 giờ, đặc biệt chủng T1và T3 có hàm lượng vi khuẩn so với chủng khác 23 Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Phân lập 25 chủng từ loại mẫu thức ăn có nguồn gốc thuỷ hải sản, môi trường nước sông, nước ao nuôi tôm, nước biển huyết heo huyện Tỉnh Trà Vinh gồm: chủng thuộc V cholerae chiếm 24%, chủng thuộc V paraheamolyticus chiếm 32%, chủng thuộc V vultificus chiếm 16%, chủng thuộc V fluvialis chiếm 20% chủng thuộc V alginolyticus chiếm 8% Có chủng V cholerae dương tính với kháng huyết đơn giá Ogawa chủng dương tính với kháng huyết đơn giá Inaba Chưa phát kháng huyết O139 Kết khảo sát kháng sinh cho thấy 100% chủng V cholerae nhạy cảm với norfloxacin, 83% với ampicillin 83% với amoxicillinclavulanic acid Đề kháng với streptomycin 50%, tetracycline 33%, trimethoprim-sulfamethoxazole 33% vancomycin 67% Có chủng V cholerae tổng số chủng kiểm tra chứa gene kháng kháng sinh tetA, gene mã hóa cho tetracycline Thỏ có đáp ứng miễn dịch vaccine có thành phần kháng nguyên có nhóm huyết O1 5.2 Đề nghị Tiếp tục tìm hiểu chế sinh bệnh miễn dịch chéo loài Vibrio spp với nhau; chọn chủng đột biến làm vaccine thử nghiệm động vật thí nghiệm; ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để nghiên cứu biến đổi di truyền vi khuẩn V cholerae liên quan đến tính gây bệnh cho người DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Nguyễn Thị Đấu, Hà Thanh Toàn, Hồ Thị Việt Thu Nguyễn Thuỳ Linh, 2014 Tỉ lệ nhiễm kháng kháng sinh vi khuẩn Vibrio spp phân lập từ huyết heo, nghêu phân bệnh nhân tiêu chảy tỉnh Trà Vinh Tạp chí Khoa học trường Đại học Cần Thơ, 33b: 61 - 67 Nguyễn Thị Đấu Hồ Thị Việt Thu, 2014 Kết phân lập định danh vi khuẩn Vibrio spp tỉnh Trà Vinh Tạp chí Khoa học Nông lâm nghiệp, trường Đại học Nông Lâm, số 3/2014 24 ... truyền gene kháng kháng sinh vi khuẩn lồi mơi trường (Burrus et al., 2004) Xuất phát từ vấn đề trên, nghiên cứu thực với nội dung: Nghiên cứu đặc điểm di truyền tính kháng thuốc V cholerae phân. .. chủng V cholerae mẫu phân lập được; xác định đặc tính kháng kháng sinh chủng V cholerae kiểu đột biến gene gây kháng thuốc; đánh giá quan hệ di truyền chủng phân lập với chủng cơng bố tính đáp... hoạt tính (Nguyễn Hoàng Lộc, 2007) 4.4.6 Quan hệ di truyền chủng V cholerae dựa vào gene kháng kháng sinh tetA Trong nghiên cứu này, chủng V cholerae phân lập Trà Vinh có mang gene mã hố gene kháng