Luận án được nghiên cứu với mục tiêu nhằm thu nhận được chủng vi khuẩn Bt bản địa có khả năng sinh chitinase cao và biểu hiện được chitinase tái tổ hợp trong E. coli phục vụ nghiên cứu sản xuất chế phẩm hỗ trợ khả năng diệt côn trùng của chế phẩm sinh học BT và ức chế nấm hại cây trồng.
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CƠNG NGHỆ SINH HỌC TRỊNH THỊ THU HÀ TÁCH DỊNG, BIỂU HIỆN VÀ NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA ENDOCHITINASE TỪ Bacillus thuringiensis PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM Chun ngành: Vi sinh vật học Mã số: 9 42 01 07 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Cơng trình được hồn thành tại Viện Cơng nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Ngơ Đình Bính Viện Cơng nghệ sinh học 2. PGS. TS. Đồng Văn Quyền Viện Cơng nghệ sinh học Phản biện 1: PGS. TS. Lê Mai Hương Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên Phản biện 2: PGS. TS. Dương Văn Hợp Viện Vi sinh vật và Cơng nghệ sinh học Phản biện 3: PGS. TS. Bùi Thị Việt Hà Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sỹ Phiên Chính thức tại: Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam, 18 Hồng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội Vào hồi:……giờ ngày… tháng… năm 2018 Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc gia Việt Nam Viện Cơng nghệ sinh học Trang web của Bộ GDĐT DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 1. Trinh Thi Thu Hà ̣ ̣ , Đơng Văn Qun, Đăng Văn Tiên, Ngơ ̀ ̀ ̣ ́ Đinh Binh (2014). Phân l ̀ ́ ập gen ma hoa endochitinase t ̃ ́ ừ vi khuẩn Bacillus thuringiensis serovar kurstaki tai Ha Nơi. ̣ ̀ ̣ Tạ p chí Cơng nghệ Sinh học, 12(4): 757763 Trinh Thi Thu Ha, ̣ ̣ ̀ Đông Văn Quyên, Ngô Đinh Binh (2017) ̀ ̀ ̀ ́ Biểu tinh protein chitinase Bacillus thuringiensis serovar kurstaki trong vi khuẩn Escherichia coli. Tạp chí Cơng nghệ sinh học 15(3): 571579 3. Trinh Thi Thu Hà ̣ ̣ , Đơng Văn Qun, Ngơ Đinh Binh (2018) ̀ ̀ ̀ ́ Tối ưu điều kiện biểu hiện nhằm nâng cao khả năng sinh tổng hợp chitinase chủng vi khuẩn tái tổ hợp phương pháp bề mặt đáp ứng. Tạp chí Sinh học 40(1): 115 123, DOI: 10.15625/08667160/v40n1.10495 MỞ ĐẦU Trong nhiều năm qua, thuốc trừ sâu sinh học Bacillus thuringiensis (Bt) đã được nghiên cứu và ứng dụng để diệt trừ các loại côn trùng hại cây trồng. Trong những năm gần đây, một số nhà khoa học trên thế giới đã nghiên cứu tác dụng hỗ trợ khả năng diệt côn trùng của enzyme ngoại bào (chitinase) đối với protein tinh thể của Bt. Chitinase được sử dụng như thuốc trừ sâu sinh học trong nông nghiệp nhờ khả năng phân hủy chitin cấu trúc trong thành tế bào của nấm, côn trùng gây bệnh , tăng hoạt tính diệt cơn trùng của chế phẩm Bt và xử lý các chất thải giàu chitin. Ngồi ra, chitinase còn được ứng dụng nhiều trong sản xuất chitooligosaccharide, nano chitin, Nacetyl Dglucosamine. Đây là những sản phẩm giá trị ứng dụng cao và được sử dụng trong thực phẩm, nơng nghiệp, y dược. Vì vậy, việc tìm ra chủng sinh chitinase cao và qui trình tạo ra chitinase có hoạt tính cao bằng cơng nghệ gen nhằm góp phần tăng hiệu quả của chế phẩm sinh học và khai thác ứng dụng trong các lĩnh vực khác là rất cần thiết Xuất phát từ những lý do trên, chúng tơi tiến hành lựa chọn đề tài luận án: “Tách dòng, biểu nghiên cứu tính chất endochitinase từ Bacillus thuringiensis phân lập ở Việt Nam” Mục tiêu của đề tài: Thu nhận được chủng vi khuẩn Bt bản địa có khả năng sinh chitinase cao và biểu hiện được chitinase tái tổ hợp trong E. coli phục vụ nghiên cứu sản xuất chế phẩm hỗ trợ khả năng diệt cơn trùng của chế phẩm sinh học BT và ức chế nấm hại cây trồng Những đóng góp mới của luận án 1. Tuyển chọn được 36 chủng vi khuẩn B. thuringiensis Việt Nam có khả năng sinh tổng hợp chitinase cao 2. Luận án là cơng trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu một cách có hệ thống về endochitinase (tự nhiên và tái tổ hợp) từ chủng B. thuringiensis serovar kurstaki MSS1.1 của Việt Nam có khả năng bảo vệ kép (Dual control) vừa kháng nấm F. oxysporum, R. solani gây bệnh thực vật vừa tăng hoạt tính diệt cơn trùng của chế phẩm BT nhằm phục vụ cho phát triển thuốc trừ sâu bệnh sinh học thế hệ mới 3. Bổ sung cơ sở dữ liệu nguồn gen chitinase của các chủng B. thuringiensis Việt Nam phục vụ cho nghiên cứu, đào tạo và ứng dụng sau này Cấu trúc của luận án Luận án gồm 159 trang được chia thành các phần: Mở đầu 4 trang; Chương 1: Tổng quan tài liệu 34 trang; Chương 2: Vật liệu và phương pháp 19 trang; Chương 3: Kết quả 41 trang; Chương 4: Thảo luận 23 trang; Kết luận và kiến nghị 1 trang; Các cơng trình cơng bố của tác giả 1 trang; Tóm tắt kết quả luận án bằng tiếng anh 6 trang; Tài liệu tham khảo 17 trang; Phụ lục 13 trang. Luận án có 15 bảng số liệu, 44 hình và 152 tài liệu tham khảo bằng tiếng Việt và tiếng Anh NỘI DUNG LUẬN ÁN CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Vi khuẩn Bacillus thuringiensis Bacillus thuringiensis (Bt) là vi khuẩn đất thuộc chi Bacillus, mơi trường sống chính của Bt gồm đất, cơn trùng, hạt ngũ cốc, bề mặt thực vật. Bt có dạng hình que, gram dương, hơ hấp hiếu khí hoặc kị khí khơng bắt buộc, sinh bào tử, bào tử hình oval, trong q trình hình thành bào tử hầu hết các chủng Bt đều tổng hợp protein tinh thể độc đối với cơn trùng. Tùy theo thành phần protein cấu tạo khác nhau mà các tinh thể có hình dạng khác nhau: hình cầu, hình lưỡng tháp, hình khối lập phương… Bt được phân loại theo nhiều phương pháp khác nhau. Trong đó, phương pháp phân loại theo de Barjac và Bonnefoi dựa trên ngun lý của phản ứng kháng ngun kháng thể được sử dụng rộng rãi (khi kháng ngun tiêm mao kết hợp với kháng thể xảy ra phản ứng ngưng kết tạo cặn lắng màu trắng xuống đáy ống nghiệm có thể quan sát bằng mắt thường. Dưới kính hiển vi quang học hoặc đối pha có thể quan sát thấy các tế bào bị cố định lại khơng chuyển động Trong qua trinh sinh tr ́ ̀ ưởng, phat triên vi khuân ́ ̉ ̉ Bt con san sinh chât chuyên hoa ̀ ̉ ́ ̉ ́ co tiêm năng ́ ̀ ứng dung rông rai trong nhiêu linh v ̣ ̣ ̃ ̀ ̃ ực như: môi trường, thực phâm, y ̉ tê, nông nghiêp, công nghiêp, công nghê sinh hoc… đo chinh la enzyme thuy phân ́ ̣ ̣ ̣ ̣ ́ ́ ̀ ̉ chitin (chitinase). Chitinase tư Bt đ ̀ ược biêt đên do tac dung t ́ ́ ́ ̣ ương hô gi ̃ ữa chitinase va thuôc tr ̀ ́ ừ sâu sinh hoc̣ Chitinase san sinh t ̉ ừ Bt. pakistani co kha năng lam tăng ́ ̉ ̀ hoat tinh diêt âu trung ̣ ́ ̣ ́ ̀ Spodoptera exigua cua chung Bt DL5789 lên 2,35 lân (Liu et ̉ ̉ ̀ al., 2002). Năm 2011, Usharani phân lâp đ ̣ ược gen exochitinase co kich th ́ ́ ươc 1129 ́ bp, ma hoa 360 acid amin va khang 4 loai nâm gây bênh th ̃ ́ ̀ ́ ̣ ́ ̣ ực vât. Vào năm 2015, ̣ các nhà khoa học Trung Quốc đã phân lập gen chi9602 mã hóa chitinase họ 18 từ chủng B. thuringiensis YBT9602, rồi tiến hành gây đột biến gen và biểu hiện trong E. coli. Hoạt tính thủy phân chitin của đột biến ChiW50A tăng 60% với yêu cầu về pH, nhiệt độ, ion kim loại tương tự như chủng dại. Hơn nữa, đột biến ChiW50A thể hiện khả năng kiểm soát sâu bệnh và hoạt động kháng nấm. Tác động cộng hưởng đáng kể của đột biến này với các chế phẩm bào tử tinh thể B. thuringiensis chống lại ấu trùng Helicoverpa armigera Caenorhabditis elegans và khả năng ức chế sự phát triển một số nấm gây bệnh thực vật (Ni et al., 2015) Qua thời gian dài phát triển đến năm 2016, gen chiA mã hóa endochitinase của chủng B. thuringiensis subsp tenebrionis DSM 2803 đã được tạo dòng và biểu hiện trong E. coli. Protein tái tổ hợp có gắn thêm đoạn 6Histidine được tinh sạch bằng sắc ký ái lực. Emzym tái tổ hợp tinh sạch có tác dụng làm giảm sự tăng trưởng của nấm Colletotrichium gloeosporioides – tác nhân gây bệnh thán thư ở thực vật (FuenteSalcido et al., 2016) Từ những ứng dụng của chitinase từ Bt nêu trên cho thấy, qua trinh nghiên c ́ ̀ ưú đây đu vê chitinase t ̀ ̉ ̀ ừ khâu phân lâp chung Bt co kha năng sinh chitinase đên viêc ̣ ̉ ́ ̉ ́ ̣ lựa chon điêu kiên môi tr ̣ ̀ ̣ ương thich h ̀ ́ ợp cho viêc nâng cao kha năng tông h ̣ ̉ ̉ ợp chitinase, xac đinh cac điêu kiên anh h ́ ̣ ́ ̀ ̣ ̉ ưởng tơi hoat tinh enzym; cung nh ́ ̣ ́ ̃ ư viêc nhân ̣ dong va biêu hiên gen ma hoa chitinase t ̀ ̀ ̉ ̣ ̃ ́ ừ vi khuân Bt trong ̉ E. coli đê nâng cao hoat ̉ ̣ tinh thuy phân chitin nhăm hô tr ́ ̉ ̀ ̃ ợ hoat tinh diêt sâu cua chê phâm BT va kha năng ̣ ́ ̣ ̉ ́ ̉ ̀ ̉ khang nâm gây bênh th ́ ́ ̣ ực vât la h ̣ ̀ ương nghiên c ́ ứu cân thiêt đê tăng hiêu qua cua ̀ ́ ̉ ̣ ̉ ̉ chê phâm sinh hoc ́ ̉ ̣ 1.2. Chitinase Chitinase (EC 3.2.1.14) thuộc nhóm enzyme thủy phân, là enzyme xúc tác quá trình phân hủy cơ chất chitin khơng tan trong nươc thành các s ́ ản phẩm chitin oligosaccharide hòa tan trong nước thơng qua q trình thủy phân liên kết β(1,4) glucoside giữa C1 và C4 của hai phân tử Nacetyl Glucosamine liên tiếp nhau trong chitin. Dựa vào trình tự amino acid đầu ni tơ, sự định vị của enzyme, điểm đẳng điện, peptide nhận biết và vùng cảm ứng, người ta phân loại chitinase thành 5 nhóm: Nhóm I, nhóm II, nhóm III, nhóm IV và nhóm V. Dựa vao phan ̀ ̉ ưng phân căt ́ ́ chitin, chitinase được phân thành 2 dang: d ̣ ạng 1 là endochitinase (EC.3.2.1.14), dạng exochitinase gồm loại chitobiosidase (EC.3.2.1.29) Nacetyl glucosaminidase (EC.3.2.1.30). Dựa vao câu truc phân t ̀ ́ ́ ử, chitinase được chia thanh ̀ 3 ho: glycohydrolase 18, 19 va 20 ̣ ̀ Cac chitinase co nguôn gôc khac nhau co thanh phân câu tao va câu truc khac ́ ́ ̀ ́ ́ ́ ̀ ̀ ́ ̣ ̀ ́ ́ ́ nhau. Sự khác nhau về cấu trúc của các enzyme còn thể hiện ở sự sắp xếp trong khơng gian của các chuỗi polypeptide, các trung tâm xúc tác và các vùng liên kết cơ chất. Sự khác nhau về cấu trúc khơng gian của các enzyme dẫn tới sự khác nhau các tính chất hóa lý của chúng. Cấu trúc điển hình của chitinase gồm 3 vùng: vùng xúc tác (catalytic domain), vùng fibronectin (fibronectinlike domain: FLD) và vùng liên kết cơ chất (chitinbinding domain: CBD). Tùy thuộc vào cấu trúc và nguồn gốc của chitinase ma ho ̀ ạt tính enzyme mạnh nhất nhiệt độ và pH khac nhau. Anh h ́ ̉ ưởng cua các ion kim lo ̉ ại, chất tẩy rửa, dung mơi hữu cơ đơi v ́ ơi chitinase t ́ ừ cac ngn thu nhân khac nhau cung có s ́ ̀ ̣ ́ ̃ ự khác nhau Dựa vaò phan̉ ưng ́ phân căt́ chitin, chitinase phân thành dang: ̣ endochitinase và exochitinase. Endochitinase là nhóm enzyme phân cắt nội mạch chitin một cách ngẫu nhiên tạo các đoạn oligosaccharide với mức trùng hợp khác nhau, exochitinase là enzyme phân cắt chitin từ một đầu cho sản phẩm chính là các đơn phân NacetylDglucosamine. Do kiểu phân cắt đặc biệt mà endochitinase thích hợp với chất chitin vách tế bào nấm chứa chitin so với exochitinase. Vì vậy, endochitinase có khả năng ức chế sự phát triển của một số nấm gây bệnh thực vật và làm tăng hoạt tính diệt cơn trùng của protein tinh thể Bt. Đê tăng hiêu qua diêt côn trung cua đôc tô Bt va khăc phuc tinh khang thuôc cua côn ̉ ̣ ̉ ̣ ̀ ̉ ̣ ́ ̀ ́ ̣ ́ ́ ́ ̉ trung gây hai, cac nha khoa h ̀ ̣ ́ ̀ ọc trên thế giới đã nghiên cứu sử dung hôn h ̣ ̃ ợp giưã protein đôc t ̣ ố Bt vơi chitinase (đ ́ ặc biệt là với endochitinase) Chitinase được tạo ra từ nhiều lồi vi sinh vật trong tự nhiên, trong đó vi khuẩn được xem là đối tượng sản sinh chitinase phong phú nhất. Trong các lồi vi khuẩn thì Bt ln sản sinh chitinase với hoạt tính cao và chitinase của vi khuẩn Bt thích hợp nhất với cơ chất là bột chitin từ vỏ tơm. Tuy nhiên, chitinase từ các chủng tự nhiên thường tạo ra với hàm lượng rất thấp. Các nhà khoa học đã nghiên cứu sử dụng cơng nghệ protein tái tổ hợp để sản xuất chitinase qui mô công nghiệp Hướng đi này giúp nâng cao năng suất sinh tổng hợp enzyme đồng thời lượng enzyme thu được dễ dàng tinh sạch hơn khi sử dụng chủng tự nhiên. Hệ biểu hiện E. coli thường được lựa chọn để biểu hiện gen ngoại lai do E. coli dễ nuôi cấy trên môi trường rẻ tiền, tốc độ sinh trưởng nhanh nên co kha năng tông h ́ ̉ ̉ ợp lượng lơn protein tai tô h ́ ́ ̉ ợp. Hàm lượng protein tái tổ hợp thu được phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện lên men chủng tái tổ hợp: nhiệt độ và thời gian cảm ứng, loại chất cảm ứng và nồng độ chất cảm ứng, mật độ tế bào tại thời điểm cám ứng. Khi biểu hiện ở điều kiện tối ưu nhất thì hàm lượng protein tái tổ hợp sẽ thu được ở mức tối đa, đồng nghĩa với việc hạ giá thành sản phẩm tái tổ hợp. Một số chitinase từ vi khuẩn Bt và những lồi khác đã được biểu hiện thành cơng E coli Vào năm 2013, hai gen chitinase LbCHI31 LbCHI32 từ Limonium bicolor đã được biểu hiện trong E. coli BL21, enzyme tái tổ hợp tạo ra dưới 2 hình thức là nội bào và ngoại bào. Protein tái tổ hợp ngoại bào được tiết vào mơi trường ni cấy giúp thuận lợi trong việc thu hồi sản phẩm và đặc biệt protein ngoại bào có hoạt tính enzyme cao hơn so với protein tái tổ hợp nội bào (Liu et al., 2013). Cũng trong thời gian này, tác giả CastanedaRamirez đã biểu hiện gen mã hóa chitinase từ vi khuẩn Bt, chiA74 vào chủng E. coli K12. Kết quả thu được protein tái tổ hợp có hoạt tính enzyme tăng gấp khoảng 500 lần so với E. coli DH5α (CastanedaRamirez et al., 2013). Gần đây, FuenteSalcido và cộng sự đã tạo dòng và biểu hiện gen chiA mã hóa endochitinase từ chủng vi khuẩn Bt tenebrionis DSM2803 trong E. coli. Protein tái tổ hợp có kích thước khoảng 74 kDa được tinh sạch qua cột sắc ký ái lực có khả năng ức chế sự phát triển của nấm Colletotrichium gloeosporioides gây bệnh thán thư ở thực vật (FuenteSalcido et al., 2016) Như vậy, chitinase co y nghia quan trong trong đ ́ ́ ̃ ̣ ời sông, đăc biêt v ́ ̣ ̣ ới xu hương ́ phat triên môt nên nông nghiêp sach, bên v ́ ̉ ̣ ̀ ̣ ̣ ̀ ưng thi cac loai phân bon, thuôc bao vê ̃ ̀ ́ ̣ ́ ́ ̉ ̣ thực vât h ̣ ưu c ̃ ơ hoăc co nguôn gôc sinh hoc đang đ ̣ ́ ̀ ́ ̣ ược đê cao nghiên c ̀ ứu va phat ̀ ́ triên. ̉ Ở Việt Nam, các nghiên cứu về chitinase chủ yếu tập trung vào quá trình tối ưu sinh tổng hợp chitinase ở một số lồi vi sinh vật nhằm thu nhận lượng enzym cao nhất, nghiên cứu tính chất của chitinase và biểu hiện gen chitinase trong thực vật giúp cây trồng có khả năng chống lại một số nấm gây bệnh. Do đó q trình biểu hiện gen mã hóa chitinase từ Bt nhằm thu enzym có hoạt tính cao, có tác dụng ức chế sự phát triển của một số nấm gây bệnh cây trồng, đồng thời hỗ trợ hoạt tính diệt sâu của protein tinh thể Bt là một hướng nghiên cứu mới và rất cần thiết Việt Nam. Hướng nghiên cứu này góp phần nâng cao hiệu quả của chế phẩm sinh học bảo vệ cây trồng CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu Các mẫu đất và lá (320 mẫu), kit huyết thanh, nấm F. oxysporum và R. solani, sâu tơ (Plutella xylostella), sâu khoang (Spodoptera litura), cặp mồi chi F và chi R để khuếch đại gen chiA mã hóa chitinase. Plasmid pGEM®Teasy (Promega) được sử dung trong thi nghiêm tach dong gen. Vector pET28b(+) (Novagen) đ ̣ ́ ̣ ́ ̀ ược sử dung đê thiêt kê vector biêu hiên gen ̣ ̉ ́ ́ ̉ ̣ chiA trong E. coli 2.2. Phương pháp Phân lập vi khuẩn Bt theo phương pháp của Thiery và Frachon (1997) Phân loại vi khuẩn Bt theo phương pháp của de Barjac va Bonnefoi (1990) ̀ Hoạt tính chitinase được định tính theo phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch Định lượng chitinase theo phương pháp Miller (1959) Hàm lượng protein được xác định theo phương pháp Bradford (1986) Tách chiết DNA vi khuẩn tiến hành theo phương pháp Sambrook và Russell (2001) Tối ưu điều kiện biểu hiện theo phương pháp bề mặt đáp ứng, sử dụng phần mềm Design expert 10.0.6 Quá trình điện di protein được thực hiện theo phương pháp Laemli (1970) Thí nghiệm Zymogram (điện di khơng biến tính) theo phương pháp của BarbozaCorona (2003) có cải tiến Thử sâu theo phương pháp của Park và cộng sự (1997) Thử khả năng kháng nấm và kiểm tra sự thủy phân thành tế bào nấm theo Harighi và cộng sự (2007) 2.3. Sơ đồ nghiên cứu Tồn bộ q trình nghiên cứu được tóm tắt bằng sơ đồ sau: Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus thuringiensis có khả năng sinh chitinase ở Việt Nam 3.1.1. Phân lâp vi khuân B. thuringiensis ̣ ̉ Từ 320 mẫu đất và lá thu thập từ 7 tỉnh thành khác nhau của Việt Nam đã phân lập được 1026 khuân lac v ̉ ̣ ơi cac đăc tinh cua nhom ́ ́ ̣ ́ ̉ ́ Bacillus cereus. Trong đó, đã xác định được 452 khuẩn lạc là vi khn Bt nh ̉ ờ khả năng hình thành tinh thể cùng với bào tử. Đã xác định được chỉ số Bt là 0,44; tần suất xuất hiện Bt là 60,94%; chủng sinh tinh thể hình lưỡng tháp chiếm số lượng nhiều nhất (38,93 %), hinh ̀ câu ( ̀ 38,49%) va hinh lâp ph ̀ ̀ ̣ ương (1,54%). Môt sô chung ( ̣ ́ ̉ 4,64%) tao tinh thê dang ̣ ̉ ̣ không xac đinh. Hâu hêt cac chung đêu sinh môt loai tinh thê đăc tr ́ ̣ ̀ ́ ́ ̉ ̀ ̣ ̣ ̉ ̣ ưng nhưng môṭ sô (1 ́ 6,37%) sinh cac tinh thê khac nhau ́ ̉ ́ (Bảng 3.1; Hình 3.1) Bang 3.1 ̉ Kết quả phân lập và xác định hinh dang tinh thê cua cac chung Bt phân lâp ̀ ̣ ̉ ̉ ́ ̉ ̣ Tỉnh thành/khu vực Số mẫu có Bt/số mẫu kiểm tra (%) Sơ chung ́ ̉ Bt/sớ khuẩn lạc kiêm tra ̉ (chi sơ ̉ ́Bt) Tinh thể hình lưỡng tháp Tinh thể hình cầu Tinh thể hình lập phương Tinh thể hình khác Tinh thể hình khơng xác 12 ứng (oC) 25 28 30 34 37 (OD600nm) 1,45 ± 0,11 2,13 ± 0,12 2,07 ± 0,15 2,99 ± 0,09 3,41 ± 0,17 (U/ml) 0,76 ± 0,03 1,22 ± 0,08 2,27 ± 0,02 2,16 ± 0,07 1,12 ± 0,19 A B Hình 3.6. Điện di protein rChiA biểu hiện ở các nhiệt độ khác nhau Hình A. Băng 15: protein tái tổ hợp biểu hiện ở 25, 28, 30, 34 và 37oC sau 6 giờ cảm ứng. Hình B. Protein tổng số, thể tan và thể vùi khi biểu hiện ở 30, 34 và 37oC; M: Maker protein 3.4.2.2. Nồng độ chất cảm cảm ứng Vector biểu hiện pET28b(+) có chứa promoter T7, q trình biểu hiện gen ngoại lai cần được cảm ứng bởi IPTG, tuy nhiên cần phải xác định nồng độ chất cảm ứng phù hợp, vừa đủ để trung hòa chất ức chế và khơng ảnh hưởng đến giá thành sản phẩm Chủng tái tổ hợp E. coli BL21(DE3)pET28b/chiA được biểu hiện các nồng độ chất cảm ứng IPTG khác nhau. Sau đó mẫu được thu hồi và đánh giá bằng kiểm tra hoạt tính cùng với điện di SDSPAGE (Hình 3.7A, B). Kết quả cho thấy, ở n ồng đ ộ ITPG 0,05 mM thì hoạt tính enzyme đ ạt được cao nhất (đạt 3,17 U/ml) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M kDa A B Hình 3.7. Kết quả di protein ChiA tái tổ hợp biểu hiện ở các nồng độ IPTG khác nhau (A) và ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng đến hoạt tính protein tái tổ hợp (B) Giếng 1: Mẫu khơng cảm ứng (nồng độ IPTG là 0); Giếng 29: Protein tái tổ hợp biểu hiện ở các nồng độ IPTG 0,05; 0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 1,0; 1,3 và 1,5 mM; 13 Giếng M: Thang protein chuẩn 3.4.2.3. Thời gian cảm ứng Chủng tái tổ hợp được biểu hiện theo mơ tả ở phần phương pháp, mẫu được thu sau các khoảng thời gian khác nhau để xác định hoạt tính enzyme. Kết quả cho thấy, sau khi cảm ứng 3 giờ hoạt tính enzyme của protein tái tổ hợp bắt đầu tăng đến 9 giờ sau cảm ứng thì đạt cực đại (4,83 U/ml), kéo dài thời gian sau cảm ứng đến 12 giờ thì hoạt tính bắt đầu giảm (chỉ còn 3,74 U/ml) 3.4.2.4. Mật độ tế bào tại thời điểm cảm ứng Mật độ tế bào trong mơi trường lên men ảnh hưởng lớn đến q trình sinh tổng hợp protein của chủng tái tổ hợp. Kết quả thể hiện hoạt tính enzyme đạt cao nhất (5,73 U/ml) khi mật độ tế bào OD600nm = 0,7 3.4.2.5. Chất cảm ứng lactose Lactose được nghiên cứu như chất cảm ứng thay thế IPTG. Ở nồng độ lactose 7 mM mật độ tế bào đạt 4,34 đơn vị và hoạt tính chitinase đạt cao nhất là 5,71 U/ml, hoạt tính này thấp hơn khơng đáng kể so với khi cảm ứng bằng IPTG nồng độ 0,05 mM (hoạt tính 5,73 U/ml) (Hình 3.8A). Mặt khác, điện di protein tái tổ hợp thu được từ mẫu cảm ứng bằng lactose và IPTG trên gel polyacrylamide cho thấy, 2 mẫu đều xuất hiện băng protein đậm trong khoảng 70 kDa, tương ứng với trọng lượng của protein ChiA (Hình 3.8B) A B Hình 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ lactose đến hoạt tính chitinase và sinh trưởng của chủng E. coli tái tổ hợp (A); Phổ điện di protein tái tổ hợp khi cảm ứng bằng lactose (B) Hình B. Băng 1: protein rChiA khi cảm ứng bằng ITPG 0,05mM; Băng 2: protein rChiA khi cảm ứng bằng lactose 7mM; M: Thang protein chuẩn 3.4.3. Tối ưu khả năng biểu hiện rChiA bằng phương pháp bề mặt đáp ứng Những kết quả trên mới chỉ đánh giá được tác động độc lập của các yếu tố mà chưa đánh giá được tác động cộng hưởng, tương tác giữa các yếu tố với nhau. Với mục tiêu thu được protein ChiA có hoạt tính cao nhất, chúng tơi tìm sự tương tác đồng thời của các yếu tố ảnh hưởng tới q trình sinh tổng hợp rChiA như: nồng độ chất cảm ứng, thời gian cảm ứng và mật độ tế bào tại thời điểm cảm ứng 14 Tiến hành tối ưu theo phương pháp bề mặt đáp ứng với các miền khảo sát của 3 yếu tố ảnh hưởng: Nồng độ chất cảm ứng lactose (A) 5 7 mM; Thời gian cảm ứng (B) 6 12 giờ và mật độ tế bào (C) (OD 600 nm) 0,6 1. Bằng phần mềm Design expert 10.0.6, thu được ma trận gồm 20 thí nghiệm cho 3 yếu tố ảnh hưởng. Các thí nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần Kết quả phân tích hồi quy (Bảng 3.4) cho thấy mơ hình hồn tồn có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 99,99%. Chuẩn F cho sự khơng tương thích của mơ hình là 5,01 chứng tỏ sự khơng tương thích của mơ hình là khơng có ý nghĩa, chỉ có 5,08% (P = 0,0508) cơ hội xuất hiện lỗi do độ nhiễu gây nên Bảng 3.4. Kết quả phân tích hồi quy hoạt độ chitinase Thơng số Mơ hình ALactose BThời gian cảm ứng CMật độ tế bào AB AC BC A2 B2 C2 Độ lệch thực nghiệm và mơ hình Sự khơng tương thích mơ hình Sai số Phương sai tổng Tổng phương sai Bậc tự Trung bình phương sai khác Chuẩn Fisher Giá trị P 1 1 8,91 24,16 1,05 2,11 0,18 3,11 136,95 371,27 16,12 32,46 2,72 47,83