TÓM tắt tách dòng, biểu hiện và nghiên cứu tính chất của endochitinase từ bacillus thuringiensis phân lập ở việt nam

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRỊNH THỊ THU HÀ TÁCH DỊNG, BIỂU HIỆN VÀ NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA ENDOCHITINASE TỪ Bacillus thuringiensis PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 42 01 07 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội, 2018 Cơng trình hồn thành Viện Cơng nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Ngơ Đình Bính Viện Cơng nghệ sinh học PGS TS Đồng Văn Quyền Viện Công nghệ sinh học Phản biện 1: PGS TS Lê Mai Hương Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên Phản biện 2: PGS TS Dương Văn Hợp Viện Vi sinh vật Công nghệ sinh học Phản biện 3: PGS TS Bùi Thị Việt Hà Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sỹ Phiên Chính thức tại: Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội Vào hồi:……giờ ngày… tháng… năm 2018 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Viện Công nghệ sinh học - Trang web Bộ GDĐT DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Trịnh Thị Thu Hà, Đồng Văn Quyền, Đặng Văn Tiến, Ngơ Đình Bính (2014) Phân lập gen mã hóa endochitinase từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis serovar kurstaki Hà Nội Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 12(4): 757-763 Trịnh Thị Thu Hà, Đồng Văn Quyền, Ngô Đình Bính (2017) Biểu tinh protein chitinase Bacillus thuringiensis serovar kurstaki vi khuẩn Escherichia coli Tạp chí Cơng nghệ sinh học 15(3): 571-579 Trịnh Thị Thu Hà, Đồng Văn Qùn, Ngơ Đình Bính (2018) Tối ưu điều kiện biểu nhằm nâng cao khả sinh tổng hợp chitinase chủng vi khuẩn tái tổ hợp phương pháp bề mặt đáp ứng Tạp chí Sinh học 40(1): 115-123, DOI: 10.15625/0866-7160/v40n1.10495 MỞ ĐẦU Trong nhiều năm qua, thuốc trừ sâu sinh học Bacillus thuringiensis (Bt) đã nghiên cứu ứng dụng để diệt trừ loại côn trùng hại trồng Trong năm gần đây, số nhà khoa học giới đã nghiên cứu tác dụng hỗ trợ khả diệt côn trùng enzyme ngoại bào (chitinase) protein tinh thể Bt Chitinase sử dụng thuốc trừ sâu sinh học nông nghiệp nhờ khả phân hủy chitin cấu trúc thành tế bào nấm, côn trùng gây bệnh, tăng hoạt tính diệt trùng chế phẩm Bt xử lý chất thải giàu chitin Ngồi ra, chitinase ứng dụng nhiều sản xuất chitooligosaccharide, nano - chitin, N-acetyl D-glucosamine Đây sản phẩm giá trị ứng dụng cao sử dụng thực phẩm, nơng nghiệp, y dược Vì vậy, việc tìm chủng sinh chitinase cao qui trình tạo chitinase có hoạt tính cao cơng nghệ gen nhằm góp phần tăng hiệu chế phẩm sinh học khai thác ứng dụng lĩnh vực khác cần thiết Xuất phát từ lý trên, tiến hành lựa chọn đề tài luận án: “Tách dòng, biểu nghiên cứu tính chất endochitinase từ Bacillus thuringiensis phân lập Việt Nam” Mục tiêu đề tài: Thu nhận chủng vi khuẩn Bt địa có khả sinh chitinase cao biểu chitinase tái tổ hợp E coli phục vụ nghiên cứu sản xuất chế phẩm hỗ trợ khả diệt côn trùng chế phẩm sinh học BT ức chế nấm hại trồng Những đóng góp luận án Tuyển chọn 36 chủng vi khuẩn B thuringiensis Việt Nam có khả sinh tổng hợp chitinase cao Luận án cơng trình Việt Nam nghiên cứu cách có hệ thống về endochitinase (tự nhiên tái tổ hợp) từ chủng B thuringiensis serovar kurstaki MSS1.1 Việt Nam có khả bảo vệ kép (Dual control) - vừa kháng nấm F oxysporum, R solani gây bệnh thực vật vừa tăng hoạt tính diệt trùng chế phẩm BT nhằm phục vụ cho phát triển thuốc trừ sâu bệnh sinh học hệ Bổ sung sở liệu nguồn gen chitinase chủng B thuringiensis Việt Nam phục vụ cho nghiên cứu, đào tạo ứng dụng sau Cấu trúc luận án Luận án gồm 159 trang chia thành phần: Mở đầu trang; Chương 1: Tổng quan tài liệu 34 trang; Chương 2: Vật liệu phương pháp 19 trang; Chương 3: Kết 41 trang; Chương 4: Thảo luận 23 trang; Kết luận kiến nghị trang; Các cơng trình cơng bố tác giả trang; Tóm tắt kết luận án tiếng anh trang; Tài liệu tham khảo 17 trang; Phụ lục 13 trang Luận án có 15 bảng số liệu, 44 hình 152 tài liệu tham khảo tiếng Việt tiếng Anh NỘI DUNG LUẬN ÁN CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vi khuẩn Bacillus thuringiensis Bacillus thuringiensis (Bt) vi khuẩn đất thuộc chi Bacillus, môi trường sống Bt gồm đất, trùng, hạt ngũ cốc, bề mặt thực vật Bt có dạng hình que, gram dương, hơ hấp hiếu khí hoặc kị khí khơng bắt buộc, sinh bào tử, bào tử hình oval, trình hình thành bào tử hầu hết chủng Bt đều tổng hợp protein tinh thể độc côn trùng Tùy theo thành phần protein cấu tạo khác mà tinh thể có hình dạng khác nhau: hình cầu, hình lưỡng tháp, hình khối lập phương… Bt phân loại theo nhiều phương pháp khác Trong đó, phương pháp phân loại theo de Barjac Bonnefoi dựa nguyên lý phản ứng kháng nguyên kháng thể sử dụng rộng rãi (khi kháng nguyên tiêm mao kết hợp với kháng thể xảy phản ứng ngưng kết tạo cặn lắng màu trắng xuống đáy ống nghiệm quan sát mắt thường Dưới kính hiển vi quang học hoặc đối pha quan sát thấy tế bào bị cố định lại khơng chuyển động Trong q trình sinh trưởng, phát triển vi khuẩn Bt sản sinh chất chuyển hóa có tiềm ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực như: môi trường, thực phẩm, y tế, nông nghiệp, cơng nghiệp, cơng nghệ sinh học… enzyme thủy phân chitin (chitinase) Chitinase từ Bt biết đến tác dụng tương hỗ chitinase thuốc trừ sâu sinh học Chitinase sản sinh từ Bt pakistani có khả làm tăng hoạt tính diệt ấu trùng Spodoptera exigua chủng Bt DL5789 lên 2,35 lần (Liu et al., 2002) Năm 2011, Usharani phân lập gen exochitinase có kích thước 1129 bp, mã hóa 360 acid amin kháng loại nấm gây bệnh thực vật Vào năm 2015, nhà khoa học Trung Quốc đã phân lập gen chi9602 mã hóa chitinase họ 18 từ chủng B thuringiensis YBT-9602, tiến hành gây đột biến gen biểu E coli Hoạt tính thủy phân chitin đột biến ChiW50A tăng 60% với yêu cầu về pH, nhiệt độ, ion kim loại tương tự chủng dại Hơn nữa, đột biến ChiW50A thể khả kiểm soát sâu bệnh hoạt động kháng nấm Tác động cộng hưởng đáng kể đột biến với chế phẩm bào tử - tinh thể B thuringiensis chống lại ấu trùng Helicoverpa armigera Caenorhabditis elegans khả ức chế phát triển số nấm gây bệnh thực vật (Ni et al., 2015) Qua thời gian dài phát triển đến năm 2016, gen chiA mã hóa endochitinase chủng B thuringiensis subsp tenebrionis DSM- 2803 đã tạo dòng biểu E coli Protein tái tổ hợp có gắn thêm đoạn 6-Histidine tinh sắc ký lực Emzym tái tổ hợp tinh có tác dụng làm giảm tăng trưởng nấm Colletotrichium gloeosporioides – tác nhân gây bệnh thán thư thực vật (Fuente-Salcido et al., 2016) Từ ứng dụng chitinase từ Bt nêu cho thấy, trình nghiên cứu đầy đủ về chitinase từ khâu phân lập chủng Bt có khả sinh chitinase đến việc lựa chọn điều kiện môi trường thích hợp cho việc nâng cao khả tổng hợp chitinase, xác định điều kiện ảnh hưởng tới hoạt tính enzym; việc nhân dòng biểu gen mã hóa chitinase từ vi khuẩn Bt E coli để nâng cao hoạt tính thủy phân chitin nhằm hỗ trợ hoạt tính diệt sâu chế phẩm BT khả kháng nấm gây bệnh thực vật hướng nghiên cứu cần thiết để tăng hiệu chế phẩm sinh học 1.2 Chitinase Chitinase (EC 3.2.1.14) thuộc nhóm enzyme thủy phân, enzyme xúc tác trình phân hủy chất chitin khơng tan nước thành sản phẩm chitinoligosaccharide hòa tan nước thơng qua trình thủy phân liên kết β-(1,4)glucoside C1 C4 hai phân tử N-acetyl Glucosamine liên tiếp chitin Dựa vào trình tự amino acid đầu ni tơ, định vị enzyme, điểm đẳng điện, peptide nhận biết vùng cảm ứng, người ta phân loại chitinase thành nhóm: Nhóm I, nhóm II, nhóm III, nhóm IV nhóm V Dựa vào phản ứng phân cắt chitin, chitinase phân thành dạng: dạng endochitinase (EC.3.2.1.14), dạng exochitinase gồm loại chitobiosidase (EC.3.2.1.29) N-acetyl glucosaminidase (EC.3.2.1.30) Dựa vào cấu trúc phân tử, chitinase chia thành họ: glycohydrolase 18, 19 20 Các chitinase có nguồn gốc khác có thành phần cấu tạo cấu trúc khác Sự khác về cấu trúc enzyme thể xếp khơng gian chuỗi polypeptide, trung tâm xúc tác vùng liên kết chất Sự khác về cấu trúc không gian enzyme dẫn tới khác về tính chất hóa lý chúng Cấu trúc điển hình chitinase gồm vùng: vùng xúc tác (catalytic domain), vùng fibronectin (fibronectin-like domain: FLD) vùng liên kết chất (chitin-binding domain: CBD) Tùy thuộc vào cấu trúc nguồn gốc chitinase mà hoạt tính enzyme mạnh nhiệt độ pH khác Ảnh hưởng ion kim loại, chất tẩy rửa, dung môi hữu chitinase từ nguồn thu nhận khác có khác Dựa vào phản ứng phân cắt chitin, chitinase phân thành dạng: endochitinase exochitinase Endochitinase nhóm enzyme phân cắt nội mạch chitin cách ngẫu nhiên tạo đoạn oligosaccharide với mức trùng hợp khác nhau, exochitinase enzyme phân cắt chitin từ đầu cho sản phẩm đơn phân N-acetyl-D-glucosamine Do kiểu phân cắt đặc biệt mà endochitinase thích hợp với chất chitin vách tế bào nấm chứa chitin so với exochitinase Vì vậy, endochitinase có khả ức chế phát triển số nấm gây bệnh thực vật làm tăng hoạt tính diệt trùng protein tinh thể Bt Để tăng hiệu diệt côn trùng độc tố Bt khắc phục tính kháng thuốc trùng gây hại, nhà khoa học giới đã nghiên cứu sử dụng hỗn hợp protein độc tố Bt với chitinase (đặc biệt với endochitinase) Chitinase tạo từ nhiều lồi vi sinh vật tự nhiên, vi khuẩn xem đối tượng sản sinh chitinase phong phú Trong lồi vi khuẩn Bt ln sản sinh chitinase với hoạt tính cao chitinase vi khuẩn Bt thích hợp với chất bột chitin từ vỏ tôm Tuy nhiên, chitinase từ chủng tự nhiên thường tạo với hàm lượng thấp Các nhà khoa học đã nghiên cứu sử dụng công nghệ protein tái tổ hợp để sản xuất chitinase qui mô công nghiệp Hướng giúp nâng cao suất sinh tổng hợp enzyme đồng thời lượng enzyme thu dễ dàng tinh sử dụng chủng tự nhiên Hệ biểu E coli thường lựa chọn để biểu gen ngoại lai E coli dễ nuôi cấy môi trường rẻ tiền, tốc độ sinh trưởng nhanh nên có khả tổng hợp lượng lớn protein tái tổ hợp Hàm lượng protein tái tổ hợp thu phụ thuộc nhiều vào điều kiện lên men chủng tái tổ hợp: nhiệt độ thời gian cảm ứng, loại chất cảm ứng nồng độ chất cảm ứng, mật độ tế bào thời điểm cám ứng Khi biểu điều kiện tối ưu hàm lượng protein tái tổ hợp thu mức tối đa, đồng nghĩa với việc hạ giá thành sản phẩm tái tổ hợp Một số chitinase từ vi khuẩn Bt loài khác đã biểu thành công E coli Vào năm 2013, hai gen chitinase LbCHI31 LbCHI32 từ Limonium bicolor đã biểu E coli BL21, enzyme tái tổ hợp tạo hình thức nội bào ngoại bào Protein tái tổ hợp ngoại bào tiết vào môi trường nuôi cấy giúp thuận lợi việc thu hồi sản phẩm đặc biệt protein ngoại bào có hoạt tính enzyme cao so với protein tái tổ hợp nội bào (Liu et al., 2013) Cũng thời gian này, tác giả Castaneda-Ramirez đã biểu gen mã hóa chitinase từ vi khuẩn Bt, chiA74 vào chủng E coli K12 Kết thu protein tái tổ hợp có hoạt tính enzyme tăng gấp khoảng 500 lần so với E coli DH5α (Castaneda-Ramirez et al., 2013) Gần đây, Fuente-Salcido cộng đã tạo dòng biểu gen chiA mã hóa endochitinase từ chủng vi khuẩn Bt tenebrionis DSM-2803 E coli Protein tái tổ hợp có kích thước khoảng 74 kDa tinh qua cột sắc ký lực có khả ức chế phát triển nấm Colletotrichium gloeosporioides gây bệnh thán thư thực vật (Fuente-Salcido et al., 2016) Như vậy, chitinase có ý nghĩa quan trọng đời sống, đặc biệt với xu hướng phát triển nền nơng nghiệp sạch, bền vững loại phân bón, thuốc bảo vệ thực vật hữu hoặc có nguồn gốc sinh học đề cao nghiên cứu phát triển Ở Việt Nam, nghiên cứu về chitinase chủ yếu tập trung vào trình tối ưu sinh tổng hợp chitinase số loài vi sinh vật nhằm thu nhận lượng enzym cao nhất, nghiên cứu tính chất chitinase biểu gen chitinase thực vật giúp trồng có khả chống lại số nấm gây bệnh Do q trình biểu gen mã hóa chitinase từ Bt nhằm thu enzym có hoạt tính cao, có tác dụng ức chế phát triển số nấm gây bệnh trồng, đồng thời hỗ trợ hoạt tính diệt sâu protein tinh thể Bt hướng nghiên cứu cần thiết Việt Nam Hướng nghiên cứu góp phần nâng cao hiệu chế phẩm sinh học bảo vệ trồng CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu Các mẫu đất (320 mẫu), kit huyết thanh, nấm F oxysporum R solani, sâu tơ (Plutella xylostella), sâu khoang (Spodoptera litura), cặp mồi chi F chi R để khuếch đại gen chiA mã hóa chitinase Plasmid pGEM®-Teasy (Promega) sử dụng thí nghiệm tách dòng gen Vector pET28b(+) (Novagen) sử dụng để thiết kế vector biểu gen chiA E coli 2.2 Phương pháp - Phân lập vi khuẩn Bt theo phương pháp Thiery Frachon (1997) - Phân loại vi khuẩn Bt theo phương pháp de Barjac Bonnefoi (1990) - Hoạt tính chitinase định tính theo phương pháp khuếch tán đĩa thạch - Định lượng chitinase theo phương pháp Miller (1959) - Hàm lượng protein xác định theo phương pháp Bradford (1986) - Tách chiết DNA vi khuẩn tiến hành theo phương pháp Sambrook Russell (2001) - Tối ưu điều kiện biểu theo phương pháp bề mặt đáp ứng, sử dụng phần mềm Design expert 10.0.6 - Quá trình điện di protein thực theo phương pháp Laemli (1970) - Thí nghiệm Zymogram (điện di khơng biến tính) theo phương pháp Barboza-Corona (2003) có cải tiến - Thử sâu theo phương pháp Park cộng (1997) - Thử khả kháng nấm kiểm tra thủy phân thành tế bào nấm theo Harighi cộng (2007) 2.3 Sơ đồ nghiên cứu Tồn q trình nghiên cứu tóm tắt sơ đồ sau: Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus thuringiensis có khả sinh chitinase Việt Nam 3.1.1 Phân lập vi khuẩn B thuringiensis Từ 320 mẫu đất thu thập từ tỉnh thành khác Việt Nam đã phân lập 1026 khuẩn lạc với đặc tính nhóm Bacillus cereus Trong đó, đã xác định 452 khuẩn lạc vi khuẩn Bt nhờ khả hình thành tinh thể với bào tử Đã xác định số Bt 0,44; tần suất xuất Bt 60,94%; chủng sinh tinh thể hình lưỡng tháp chiếm số lượng nhiều (38,93 %), hình cầu (38,49%) hình lập phương (1,54%) Một số chủng (4,64%) tạo tinh thể dạng không xác định Hầu hết chủng đều sinh loại tinh thể đặc trưng số (16,37%) sinh tinh thể khác (Bảng 3.1; Hình 3.1) Bảng 3.1 Kết phân lập xác định hình dạng tinh thể chủng Bt phân lập Tỉnh thành/khu vực Số mẫu có Bt/số mẫu kiểm tra (%) Số chủng Bt/số khuẩn lạc kiểm tra (chỉ số Bt) Tinh thể hình lưỡng tháp Tinh thể hình cầu Tinh thể hình lập phương Tinh thể hình khác Hòa Bình/ Tây Bắc Bộ 38/48 (79,2) 146/356 (0,46) 63/146 (43,15) 70/146 (47,94) 3/146 (2,05) 5/146 (3,42) Tinh thể hình khơng xác định 5/146 (3,42) Hà Nội/ Đông Bắc Bộ Thừa Thiên Huế/Bắc Trung Bộ Quảng Nam/Nam Trung Bộ Đắc Lắc/Cao nguyên Đồng Nai/Đông Nam Bộ Kiên Giang/ Đồng sông Mê Kông Tổng số 87/120 (72.5) 10/46 (21,7) 158/256 (0,54) 12/36 (0,33) 48/158 (30,38) 6/12 (0,50) 35/158 (22,15) 6/12 (0,50) 1/158 (9.4) - 69/158 (43,67) - 5/158 (4.3) - 16/27 (59.2) 56/136 (0,41) 33/56 (58,92) 20/56 (35,71) - - 3/56 (5,35) 26/56 (46) 12/15 (80) 46/154 (0,30) 18/52 (0,23) 10/46 (21,73) 12/18 (66,66) 27/46 (58.69) 4/18 (22,22) 1/46 (2,17) 2/18 (11,11) - 8/46 (17,39) - 6/8 (75.0) 16/36 (0,44) 4/16 (25,0) 12/16 (75.0) - - - 195/320 (60,94) 452/1026 (0,44) 176/452 (38,93) 174/452 (38,49) 7/452 (1,54) 74/452 (16,37) 21/452 (4,64) 3.1.2 Phân loại loài chủng B thuringiensis phân lập Tiến hành phân loại 452 chủng Bt phân lập thu kết quả: 29,2% (132 chủng) số chủng thuộc typ huyết 3a, 3b, 3c (dưới loài kurstaki), 16,4% thuộc loài aizawai 16,4% thuộc loài morrisoni Dưới loài novosibirsk pondicheriensis chủng Việt Nam với tỷ lệ 0,6% lồi, 10 chủng khơng có phản ứng với kháng thể (Bảng 3.2) Bảng 3.2 Phân loại Bt phương pháp huyết Số TT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Dưới loài Type huyết H alesti 3a, 3c sumiyoshiensis 3a, 3d kurstaki 3a, 3b, 3c fukuokaensis 3a, 3d, 3e gallariae 5a, 5b aizawai morrisoni 8a, 8b nigeriensis 8b, 8d tolwothy israelensis 14 indiana 16 yunnanensis 20a, 20b pondicheriensis 20a, 2oC colmeri 21 novosibirsk 24a, 24c coreanensis 25 leesis 33 konkukian 34 Tổng số chủng phản ứng dương Số chủng phản ứng âm Số chủng phản ứng ngưng kết 35 132 18 74 74 16 13 13 12 11 442 10 Tỷ lệ (%) 7,7 1,3 29,2 3,9 1,5 16,4 16,4 3,5 2,8 1,5 2,8 0,8 0,6 2,6 0,6 1,3 1,7 2,4 97,8 2,2 Hình 3.1 Hình dạng tinh thể bào tử số chủng Bt chụp kính hiển vi điện tử qt với độ phóng đại 5000 lần Hình lưỡng tháp, Hình cầu, Hình cầu, hình lưỡng tháp hình khối lập phương, Hình lập phương, C Tinh thể (Crystal), S Bào tử (Spore) 11 3.3), đồng thời protein tái tổ hợp thể tan thu biểu 30ºC cao (Hình 3.6B) Bảng 3.3 Sinh trưởng tế bào hoạt tính enzyme nhiệt độ cảm ứng khác Nhiệt độ cảm ứng Mật độ tế bào Hoạt tính (oC) (OD600nm) (U/ml) 25 1,45 ± 0,11 0,76 ± 0,03 28 2,13 ± 0,12 1,22 ± 0,08 30 2,07 ± 0,15 2,27 ± 0,02 34 2,99 ± 0,09 2,16 ± 0,07 37 3,41 ± 0,17 1,12 ± 0,19 A B Hình 3.6 Điện di protein rChiA biểu nhiệt độ khác Hình A Băng 1-5: protein tái tổ hợp biểu 25, 28, 30, 34 37oC sau cảm ứng Hình B Protein tổng số, thể tan thể vùi biểu 30, 34 37oC; M: Maker protein 3.4.2.2 Nồng độ chất cảm cảm ứng Vector biểu pET28b(+) có chứa promoter T7, trình biểu gen ngoại lai cần cảm ứng IPTG, nhiên cần phải xác định nồng độ chất cảm ứng phù hợp, vừa đủ để trung hòa chất ức chế khơng ảnh hưởng đến giá thành sản phẩm Chủng tái tổ hợp E coli BL21(DE3)pET28b/chiA biểu nồng độ chất cảm ứng IPTG khác Sau mẫu thu hồi đánh giá kiểm tra hoạt tính với điện di SDS-PAGE (Hình 3.7A, B) Kết cho thấy, nồng độ ITPG1 0,05 mM hoạt tính enzyme đạt cao (đạt 3,17 U/ml) M kDa A B 12 Hình 3.7 Kết di protein ChiA tái tổ hợp biểu nồng độ IPTG khác (A) ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng đến hoạt tính protein tái tổ hợp (B) Giếng 1: Mẫu không cảm ứng (nồng độ IPTG 0); Giếng 2-9: Protein tái tổ hợp biểu nồng độ IPTG 0,05; 0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 1,0; 1,3 1,5 mM; Giếng M: Thang protein chuẩn 3.4.2.3 Thời gian cảm ứng Chủng tái tổ hợp biểu theo mô tả phần phương pháp, mẫu thu sau khoảng thời gian khác để xác định hoạt tính enzyme Kết cho thấy, sau cảm ứng hoạt tính enzyme protein tái tổ hợp bắt đầu tăng đến sau cảm ứng đạt cực đại (4,83 U/ml), kéo dài thời gian sau cảm ứng đến 12 hoạt tính bắt đầu giảm (chỉ 3,74 U/ml) 3.4.2.4 Mật độ tế bào thời điểm cảm ứng Mật độ tế bào mơi trường lên men ảnh hưởng lớn đến q trình sinh tổng hợp protein chủng tái tổ hợp Kết thể hoạt tính enzyme đạt cao (5,73 U/ml) mật độ tế bào OD600nm = 0,7 3.4.2.5 Chất cảm ứng lactose Lactose nghiên cứu chất cảm ứng thay IPTG Ở nồng độ lactose mM mật độ tế bào đạt 4,34 đơn vị hoạt tính chitinase đạt cao 5,71 U/ml, hoạt tính thấp khơng đáng kể so với cảm ứng IPTG nồng độ 0,05 mM (hoạt tính 5,73 U/ml) (Hình 3.8A) Mặt khác, điện di protein tái tổ hợp thu từ mẫu cảm ứng lactose IPTG gel polyacrylamide cho thấy, mẫu đều xuất băng protein đậm khoảng 70 kDa, tương ứng với trọng lượng protein ChiA (Hình 3.8B) A B Hình 3.8 Ảnh hưởng nồng độ lactose đến hoạt tính chitinase sinh trưởng chủng E coli tái tổ hợp (A); Phổ điện di protein tái tổ hợp cảm ứng lactose (B) Hình B Băng 1: protein rChiA cảm ứng ITPG 0,05mM; Băng 2: protein rChiA cảm ứng lactose 7mM; M: Thang protein chuẩn 3.4.3 Tối ưu khả biểu rChiA phương pháp bề mặt đáp ứng Những kết đánh giá tác động độc lập yếu tố mà chưa đánh giá tác động cộng hưởng, tương tác yếu tố với Với 13 mục tiêu thu protein ChiA có hoạt tính cao nhất, chúng tơi tìm tương tác đồng thời yếu tố ảnh hưởng tới trình sinh tổng hợp rChiA như: nồng độ chất cảm ứng, thời gian cảm ứng mật độ tế bào thời điểm cảm ứng Tiến hành tối ưu theo phương pháp bề mặt đáp ứng với miền khảo sát yếu tố ảnh hưởng: Nồng độ chất cảm ứng lactose (A) - mM; Thời gian cảm ứng (B) - 12 mật độ tế bào (C) (OD600 nm) 0,6 - Bằng phần mềm Design expert 10.0.6, thu ma trận gồm 20 thí nghiệm cho yếu tố ảnh hưởng Các thí nghiệm tiến hành lặp lại lần Kết phân tích hồi quy (Bảng 3.4) cho thấy mơ hình hồn tồn có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 99,99% Chuẩn F cho không tương thích mơ hình 5,01 chứng tỏ khơng tương thích mơ hình khơng có ý nghĩa, có 5,08% (P = 0,0508) hội xuất lỗi độ nhiễu gây nên Bảng 3.4 Kết phân tích hồi quy hoạt độ chitinase Thơng số Mơ hình A-Lactose B-Thời gian cảm ứng C-Mật độ tế bào AB AC BC A2 B2 C2 Độ lệch thực nghiệm mơ hình Sự khơng tương thích mơ hình Sai số Phương sai tổng Tổng phương sai Bậc tự Trung bình phương sai khác Chuẩn Fisher Giá trị P 1 1 8,91 24,16 1,05 2,11 0,18 3,11 136,95 371,27 16,12 32,46 2,72 47,83 < 0,0001 < 0,0001 0,0025 0,0002 0,1301 < 0,0001 1,250E-005 1,921E-004 0,9892 1 27,15 13,79 17,44 417,13 211,87 268,02 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 0,65 10 0,065 0,54 0,11 5,01 0,0508 0,11 80,87 19 0,022 80,22 24,16 1,05 2,11 0,18 3,11 1,250E005 27,15 13,79 17,44 Giải toán tối ưu cách chập mục tiêu theo thuật toán “hàm mong đợi” dùng phần mềm Design-Expert 10.0.6 với 100 phương án tối ưu đưa Phương án tối ưu cho sinh tổng hợp chitinase chủng E coli tái tổ hợp là: nồng độ lactose 6,15 mM; thời gian cảm ứng 8,12 mật độ tế bào thời điểm cảm ứng OD600nm = 0,87 với giá trị chitinase theo tính tốn đạt 7,49 U/ml Để kiểm tra xác mơ hình, thí nghiệm xác nhận tiến hành lần Kết cho 14 thấy: hoạt độ chitinase theo thực nghiệm (7,54 U/ml) mơ hình (7,49 U/ml) khơng có chênh lệch lớn, mơ hình phù hợp với thực nghiệm Như vậy, sau tối ưu điều kiện lên men chủng E coli tái tổ hợp phương pháp bề mặt đáp ứng đã làm tăng hoạt tính enzym tái tổ hợp lên 1,32 lần (hoạt tính trước tối ưu đạt 5,71 U/ml) 3.4.4 Tinh xác định hoạt tính chitinase tái tổ hợp Kết điện di (Hình 3.9A) cho thấy, rChiA sau tinh cho băng đậm kích thước khoảng 70 kDa (Băng 1) tương ứng với trọng lượng chitinase tái tổ hợp Hình 3.9B cho thấy, kết điện di khơng biến tính (phương pháp zymogram) thu vệt sáng khoảng kích thước 70 kDa, tương ứng với kích thước rChiA trước sau tinh Do sản phẩm rChiA số băng kích thước nhỏ, tiến hành kiểm tra Western blot mẫu protein tái tổ hợp trước sau tinh Kết hình 3.9C cho thấy, phổ Western blot mẫu rChiA trước sau tinh xuất băng đậm kích thước khoảng 70 kDa Kết chứng tỏ protein chitinase đã tinh thành cơng Protein tinh có hoạt độ riêng 72,11 U/mg protein, tăng 4,65 lần so với ban đầu Hiệu suất thu hồi enzym cao đạt 40,32% B C Hình 3.9 Điện di SDS-PAGE chitinase tinh (A); kiểm tra hoạt tính chitinase zymogram (B) phân tích Western blot (C) Hình A: M Thang protein chuẩn, Protein sau tinh sạch, Protein trước tinh Hình B: Dịch chiết protein khơng cảm ứng, Dịch chiết protein từ chủng E coli BL21(DE3)pET28b/chiA đệm phosphate pH6, 3-5 Dịch chiết protein từ chủng E coli BL21(DE3)pET28b/chiA đệm sodium acetate pH6 với hàm lượng protein tương ứng 1, 20 µg Hình C: M Thang protein chuẩn, Protein sau tinh sạch, Protein trước tinh 3.5 Nghiên cứu tính chất chitinase tái tổ hợp 3.5.1 Nhiệt độ tối ưu độ bền nhiệt Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động rChiA 40 oC (hoạt tính đạt cực đại 72,12 U/mg), rChiA bền dải nhiệt độ 35 oC (ở 30oC 35oC, hoạt tính rChiA giảm khơng đáng kể, trì 94,6 91,3% sau ủ 24 giờ) 3.5.2 pH tối ưu độ bền pH 15 pH tối ưu cho hoạt động rChiA hoạt tính rChiA bền pH7, sau 24 ủ 70,1% hoạt tính 3.5.3 Ảnh hưởng ion kim loại EDTA lên hoạt tính chitinase Một số ion kim loại hóa trị 2: Mn 2+, Mg2+, Cu2+, Zn2+, Fe2+ với nồng độ 10 mM đã làm giảm hoạt tính enzyme từ 13,3 – 32,2% Ngoại trừ ion Hg 2+ nồng độ 10 mM làm cho rChiA hoàn toàn hoạt tính enzyme Đặc biệt, ion Ca 2+ nồng độ 10 mM làm hoạt tính enzyme tăng 17,61% Hoạt tính enzyme rChiA tăng từ 1- 4% bổ sung ion K+ Na+ nồng độ 1-10 mM Ion Ag+ nồng độ 10 mM làm hoạt tính enzyme giảm 58% EDTA nồng độ 1-10 mM làm giảm hoạt tính enzyme 17,6 – 47,2% 3.5.4 Ảnh hưởng chất tẩy rửa Trong số chất tẩy rửa Trixton X100 với nồng độ 2% đã làm hoạt tính enzyme rChiA tăng 14,6% Đặc biệt, SDS với nồng độ 2% hoạt tính enzyme rChiA 66,8% 3.5.5 Ảnh hưởng dung mơi hữu Hoạt tính enzym rChiA bị ảnh hưởng dung môi hữu nồng độ khác Khi bổ sung ethanol, acetone, methanol n-butanol với nồng độ 10% đã làm hoạt tính giảm 1,3; 5,4; 6,3 8,4% Đặc biệt, xử lý enzym với dung mơi hữu nồng độ 30% hoạt tính enzym rChiA giảm nhiều từ 16,3% đến 40,2% 3.5.6 Động học phản ứng enzyme Các thông số động học Km Vmax rChiA với chất chitin chất 4-MU(GlcNAc)3 xác định dựa phương trình Linewever-Burk (Bảng 3.5) Bảng 3.5 Các thơng số động học rChiA với chất khác Cơ chất Phương trình Linewever-Burk y=14,199x + 1.596 y= 0,7693x + 1,8731 Chitin 4-MU-(GlcNAc)3 Vmax 0,63 µM/ phút ± 0,09 0,53 nM/phút ± 0,087 Km (mg/ml) 8,90 ± 0,34 0,41 ± 0,06 3.5.7 Sản phẩm thủy phân chất chitinase Sử dụng rChiA tinh colloidal chitin nguồn chất, oligosaccharit với mức trùng hợp (GlcNAc2), (GlcNAc3) (GlcNAc4) đã phát Ngồi ra, thấy lượng khơng nhỏ N-acetyl-D–glucosamine (GlcNAc) (Hình 3.10) Hình 3.10 Phân tích mỏng (TLC) sản phẩm thủy phân chitin chitinase Sản phẩm thủy phân chitin huyền phù sau 24 giờ, Chất chuẩn (N-acetyl D glucosamine oligomer (Sigma), rChiA tinh sạch, Chitin huyền phù 0,5% GlcNAc (GlcNAc)2 (GlcNAc)3 (GlcNAc) 4 16 3.6 Khả kháng nấm gây bệnh thực vật tăng hoạt tính diệt sâu chitinase tái tổ hợp 3.6.1 Khả kháng nấm gây bệnh thực vật chitinase tái tổ hợp rChiA có khả ức chế phát triển số nấm gây bệnh thực vật như: F oxysporum R solani Hoạt tính ức chế quan sát sau ngày, đĩa bổ sung rChiA sợi nấm phát triển hẳn so với đĩa đối chứng bổ sung enzym đã bất hoạt (Hình 3.11A, B) Đối với nấm Mucor sp sợi nấm đĩa bổ sung chitinase phát triển bình thường giống đĩa đối chứng (Hình 3.11C) Khi quan sát kính hiển vi thấy, nấm F oxysporum R solani xử lý với rChiA sợi nấm bị thủy phân, biến dạng sợi nấm xử lý với enzym đã bất hoạt giữ nguyên hình dạng ban đầu Ngược lại, sợi nấm Mucor sp khơng ảnh hưởng xử lý với rChiA (Hình 3.12) Khi xử lý nấm gây bệnh thực vật F oxysporum, R solani Mucor sp với rChiA, đã xác định lượng N-acetyl D-glucosamine giải phóng 22,14 µg/ml; 18,36 µg/ml µg/ml Như vậy, rChiA có khả ức chế loại nấm gây bệnh thực vật F oxysporum R solani A 3 B C Hình 3.11 Sự ức chế phát triển nấm F oxysporum (A), R solani (B) Mucor sp (C) rChiA sau ngày Đĩa 1: đối chứng (bổ sung enzym đã bất hoạt), Đĩa 2: bổ sung 100 µl rChiA (tương đương 3,49 U) Đĩa 3: bổ sung 200 µl rChiA (6,98 U) 17 Hình 3.12 Sợi nấm F oxysporum, R solani Mucor sp xử lý với enzym đã bất hoạt (A, C, E) với rChiA (B, D, F) 3.6.2 Hỗ trợ hoạt tính diệt sâu Bộ cánh vẩy chitinase tái tổ hợp 3.6.2 Hỗ trợ hoạt tính diệt sâu Bộ cánh vẩy chitinase tái tổ hợp Khi sử dụng kết hợp chitinase rChiA với protein tinh thể Bt từ chủng SP10.6 đã rút ngắn thời gian gây chết từ 72 xuống 48 (gây chết 100% sâu tơ 84,3% sâu khoang) (Hình 3.13), đồng thời giá trị LC 50 giảm 8,04% 6,80% sâu tơ sâu khoang (Bảng 3.6) A B Hình 3.13 Thử nghiệm khả diệt sâu tơ (A) sâu khoang (B) protein tinh thể Cry, rChiA Bảng 3.6 Nồng độ gây chết 50% (LC50) protein tinh thể Bt rChiA LC50 sâu tơ (ng/cm2) 167,8 ± 8,5 154,3 ± 9,4 Mẫu thử nghiệm SP10.6 SP10.6 + rChiA LC50 sâu khoang (ng/cm2) 283,5 ± 12,6 264,2 ± 7,3 CHƯƠNG BÀN LUẬN KẾT QUẢ 4.1 Phân lập vi khuẩn B thuringiensis có khả sinh chitinase Việt Nam 4.1.1 Phân lập vi khuẩn B thuringiensis Chỉ số Bt mẫu đất Mỹ 0,25 - 0,31 (Martin Traverst, 1989); NewZealand 0,2 - 0,5 (Chilcott Wigley, 1993) Trong đó, tần suất xuất Bt tỉnh thành Việt Nam 60,94% số Bt 0,44 Như vậy, so với số liệu A B 18 công bố tác giả tần suất xuất Bt số Bt mà phân lập cao Chứng tỏ số lượng vi khuẩn Bt Việt Nam phong phú, cung cấp nhiều nguồn gen quý 4.1.2 Phân loại loài kurstaki chủng Bt phân lập Kết phân loại cho thấy, 29,2% số chủng thuộc typ huyết 3a, 3b, 3c (dưới loài kurstaki), chiếm tỷ lệ cao Kết phân loại cao so với New Zealand 25% số chủng thuộc loài kurstaki (Young, 1998) Theo nghiên cứu giới, chủng vi khuẩn thuộc loài B thuringiensis var kurstaki (Btk) vừa có khả chống lại ấu trùng Cánh vẩy (Lepidoptera) vừa có khả sinh endochitinase – enzyme có khả kháng nấm gây bệnh thực vật làm tăng hoạt tính diệt trùng Bt (Barboza, 2008; Gomaa, 2012) 4.1.3 Sàng lọc hoạt tính thủy phân chitin chủng Btk Số chủng có khả sinh chitinase chiếm tỉ lệ 75% tổng số chủng Btk kiểm tra Kết cao so với công bố Cottrell cộng (2000) sàng lọc gen chitinase từ vi khuẩn biển số chủng có khả sinh chitinase chiếm 73,68% tổng số chủng kiểm tra Chủng Bt MSS1.1 có đường kính vòng phân giải chitin lớn (29 mm) Kết nghiên cứu phù hợp so với kết nghiên cứu Shivalee (Shivalee et al., 2016), đường kính vòng thủy phân chitin lớn chủng vi khuẩn phân lập từ đất 30 mm thấp so với nghiên cứu tác giả Ajayi cộng (2016), đã phân lập vi khuẩn Bacillus sp từ da ruột cá da trơn có đường kính vòng thủy phân 40 mm Mặt khác, hoạt tính chitinase chủng MSS1.1 xác định cao nhất, đạt 0,54 U/ml Kết cao nhiều so với chủng Bt phân lập Pakistan (hoạt tính đạt 0,23 U/ml) (Saleem et al., 2014) Như vây, vi khuẩn phân lập từ nguồn khác có khả thủy phân chitin khác 4.1.4 Sàng lọc gen endochitinase (chiA) chủng Btk Số chủng Bt mang gen chiA chiếm tỷ lệ cao (73,74%) so với nghiên cứu Cottrell cộng (2000) sàng lọc gen chitinase từ vi khuẩn biển có 47,37% chủng mang gen Đây nguồn nguyên liệu dồi để khai thác ứng dụng chitinase công - nông nghiệp y dược Kết làm sở cho nghiên cứu đồng thời làm phong phú thêm cho Bộ Sưu tập nguồn gen Bt Việt Nam 4.1.5 Sàng lọc hoạt tính kháng nấm chủng Btk Chủng Bt MSS1.1 có khả ức chế sinh trưởng loại nấm gây bệnh thực vật F oxysporum R solani Những nghiên cứu trước cho thấy, Streptomyces griseus có khả sinh chitinase kháng nấm F oxysporum R solani với đường kính vòng phân giải cm 1,5 cm (Anitha Rabeeth, 2010) Chitinase từ chủng nấm A terrus có khả kháng nhiều loại nấm, đường kính vòng ức chế nấm F oxysporum R solani mm mm 19 (Aida Taghreed, 2014) Như vậy, chitinase từ chủng vi sinh khác có khả kháng nhiều loại nấm gây bệnh thực vật với mức độ không giống 4.2 Khảo sát điều kiện sinh tổng hợp chitinase chủng MSS1.1 Thời gian sinh tổng hợp chitinase dài hay ngắn tùy thuộc vào loài vi sinh vật khác nhau: Để thu hoạt tính chitinase cao chủng B subtilis B298 15 nuôi cấy (Lestari et al., 2017), xạ khuẩn S sporovirgulis ngày ni (Brzezinska, 2013) Bên cạnh đó, chủng vi sinh vật có nhiệt độ sinh trưởng sinh tổng hợp chitinase không giống nhau: vi khuẩn B alvei NRC14 28oC (Abdel-Aziz et al., 2012), B subtilis 35oC (Chauhan Singh, 2013) Ngoài ra, trình sinh tổng hợp chitinase vi sinh vật cần phải có chất chitin đóng vai trò chất cảm ứng Mỗi lồi vi sinh vật thích hợp với loại chất chitin có nguồn gốc nồng độ khác nhau: xạ khuẩn S albus FS12 thích hợp với chất bột vỏ tôm (Santhi, 2016) Chủng B cereus TKU030 sinh chitinase chitosanase ni mơi trường có chứa nguồn chất cảm ứng bột mai mực (Liang et al., 2014) Hơn nữa, nhu cầu về nguồn cac bon nguồn nitơ cho sinh trưởng sinh tổng hợp chitinase lồi sinh vật khơng giống nhau: Nguồn bon thích hợp cho chủng vi khuẩn A hydrophila HS4 A punctata HS6 sinh chitinase tinh bột với hàm lượng 1% nguồn nitơ thích hợp malt cao men (Saima Roohi, 2013) Trong nghiên cứu chúng tôi, chủng Bt MSS1.1 ni cấy mơi trường có sử dụng bột ngơ, bột đậu tương làm nguồn cac bon nguồn ni tơ, có bổ sung 0,5% colloidal chitin chất cảm ứng với điều kiện pH môi trường 7, nhiệt độ ni 28 oC sau 36 bắt đầu sinh chitinase đạt cực đại sau 96 nuôi (0,87 U/ml), tăng 1,36 lần so với môi trường ban đầu (0,64 U/ml) Ở Việt Nam, bột ngô, bột đậu tương, vỏ tôm, vỏ cua đều nguyên liệu rẻ tiền dễ kiếm Kết nghiên cứu khảo sát điều kiện nuôi cấy chủng Bt MSS1.1 đã tận dụng nguồn phế thải, phụ phẩm nông nghiệp công nghiệp chế biến thủy sản Chủng MSS1.1 sử dụng nguồn phế phụ phẩm nguồn bon, nguồn ni tơ để tăng sản lượng chitinase mà giải vấn đề nhiễm mơi trường Điều có ý nghĩa lớn việc xử lý chất thải, chống ô nhiễm, bảo vệ mơi trường 4.3 Nhân dòng gen chiA mã hóa chitinase từ chủng vi khuẩn Btk MSS1.1 Trình tự gen chiA có 10 vị trí thay đổi so với trình tự đã cơng bố xuất vị trí cắt enzym giới hạn BamHI (GGATCC) khoảng đoạn gen sai khác vị trí nucleotide C915T Điều chủng phân lập Việt Nam nên trình tự gen có thay đổi, đồng thời thay đổi làm xuất vị trí cắt enzyme giới hạn BamHI dẫn đến thay đổi amino acid vị trí, ngun nhân dẫn đến khác về hoạt tính enzyme chủng 4.4 Biểu gen chiA vi khuẩn E coli BL21 4.4.1 Biểu chủng E.coli mang vector tái tổ hợp chứa gen chiA 20 Theo thiết kế vector biểu hiện, gen chiA chèn vào vector pET28b(+) vị trí EcoRI XhoI Như vậy, protein ChiA biểu dung hợp với Histidine đầu C 36 amino acid đầu N, protein dung hợp có kích thước khoảng 79 kDa Kết biểu western blot thu băng protein khoảng 70 kDa Protein tái tổ hợp thu từ khoang chu chất chủ yếu dạng tan Khi phân tích trình tự gen chiA phần mềm SignalIP4.1, kết 34 amino acid đầu N peptide tín hiệu, điểm phân cắt nằm amino acid thứ 34 35, điểm phân cắt trùng với điểm phân cắt peptide tín hiệu vi khuẩn Gram(-) Như vậy, peptide tín hiệu vi khuẩn Bt tương thích với đường tiết E coli Vì vậy, peptide tín hiệu đã nhận chế tiết E coli protein tái tổ hợp tiết khoang chu chất peptide tín hiệu đã bị cắt peptidase màng sau vận chuyển protein qua màng Đồng thời 36 amino acid đầu N bị cắt peptide tín hiệu Kết trình biểu thu protein tái tổ hợp có kích thước khoảng 70 kDa Tương tự, enzym chitosanase B subtilis đã biểu E coli, protein tái tổ hợp dễ dàng thu từ môi trường ni cấy khoang gian bào peptide tín hiệu nhận chế tiết E coli (Pechsrichuang et al., 2016) Ngoài ra, endochitinase từ Bt serovar konkukian biểu E coli Protein tái tổ hợp thu có kích thước 70 kDa (kích thước protein trưởng thành sau peptide tín hiệu bị cắt) (Mehmood et al., 2010) Như vậy, sử dụng peptide tín hiệu để sản xuất ngoại bào protein enzym E coli Protein chitinase tái tổ hợp thu có hoạt tính enzym 1,10 U/ml, cao hoạt tính chitinase tự nhiên 1,26 lần Tương tự, gen chiA74 từ Bt đã biểu E coli chủng K12, hoạt tính enzyme tái tổ hợp thu tăng xấp xỉ 500% (Castaneda-Ramirez et al., 2013) 4.4.2 Nghiên cứu điều kiện biểu Nhiệt độ yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu suất biểu hoạt tính protein tái tổ hợp Trong nghiên cứu chúng tôi, biểu 30 oC, protein tái tổ hợp thu có hoạt tính cao (2,27 U/ml) protein thu chủ yếu dạng tan Điều giải thích: tổng hợp với tốc độ chậm khả cuộn gấp phục hồi cấu trúc xác protein tái tổ hợp cao khôi phục hoạt tính enzym Thời gian lên men yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến suất biểu protein Nếu thu sớm protein chưa tổng hợp tối đa, thu muộn sinh chất ức chế phân hủy protein tạo thành Trong biểu protein chitinase, sử dụng lactose làm chất cảm ứng thay cho IPTG Do có mặt lactose môi trường, E coli sinh tổng hợp βgalactosidase chuyển hóa lactose thành glucose galactose Đồng thời βgalactosidase xúc tác chuyển hóa phần đường lactose thành dạng allolactose Allolactose đồng phân lactose có cấu trúc khơng gian tương tự IPTG, liên kết chất kìm hãm operon, để operon thực trình phiên mã (Gerd, 2005) 21 Như vậy, sau tối ưu điều kiện biểu hiện, enzyme tái tổ hợp thu có hoạt tính 5,71 U/ml Kết cao 2,75 lần so với công bố Casados-vazquez (2014) biểu chiA74 từ vi khuẩn Bt E coli, protein tái tổ hợp thu có hoạt tính 2,07 U/ml Tác giả Mehmood (2010) đã biểu gen chitinase từ vi khuẩn Bt serovar konkukian E coli, thu chitinase tái tổ hợp có hoạt tính khác từng loại chất, hoạt tính cao chất colloidal chitin 65,56 U, α-chitin 4,35 U Như vậy, chitinase tái tổ hợp có hoạt tính khác tùy nguồn gốc gen mã hóa chitinase tùy thuộc vào từng loại chất Nhằm mục đích thu protein ChiA có hoạt tính enzyme cao nhất, sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng để tìm tương tác đồng thời yếu tố ảnh hưởng tới trình sinh tổng hợp rChiA dựa kết đánh giá độc lập từng yếu tố Kết đã làm tăng hoạt tính enzyme protein tái tổ hợp lên 1,32 lần Cũng nhờ phương pháp đáp ứng bề mặt mà sản sinh chitinase chủng Lysinibacillus fusiformis B-CM18 tăng 56,1 lần (Rajesh et al., 2012), hoạt tính chitinase từ xạ khuẩn S heteromorphus 4075 đã tăng 2,15 lần (Kotra et al., 2013) 4.4.3 Tinh xác định hoạt tính chitinase tái tổ hợp Hoạt tính đặc hiệu chitinase sau tinh đạt 72,11 U/mg protein cao hoạt tính chitinase tái tổ hợp Chi18H8 đạt sau tinh 63,9 U/mg protein, thấp so với hoạt tính chitinase tái tổ hợp tinh cột lực Nikel HiTrap có hoạt tính đặc hiệu 74,2 U/mg protein (Casados-Vazquez et al., 2014) 1,02 lần Độ hiệu suất thu hồi chitinase nghiên cứu 4,65 lần 40,32%; kết nghiên cứu cao so với chiA74 tái tổ hợp tinh Nikel (hiệu suất 32,24%; độ 1,55 lần) tương đương so với nghiên cứu de la Fuente-Salcido (2017), chitinase tái tổ hợp tinh cột Nikel có hiệu suất 40,27% độ 4,39 lần 4.5 Nghiên cứu tính chất chitinase tái tổ hợp 4.5.1 Nhiệt độ pH thích hợp cho hoạt động chitinase tái tổ hợp Sự khác biệt về nhiệt độ làm thay đổi cấu trúc enzyme, dẫn đến hoạt động enzyme bị ảnh hưởng Nhiệt độ độ pH enzym thường thông số phân biệt để xác định liệu enzym có phù hợp với ứng dụng công nghệ sinh học hay không Giá trị pH tối ưu chitinase phụ thuộc vào loài sinh vật sinh ra, nguồn chất mà enzyme thủy phân chất enzyme Trong nghiên cứu chúng tôi, rChiA hoạt động dải pH rộng từ - nhiệt độ từ 20 - 60 oC, enzyme hoạt động tối ưu pH nhiệt độ 40 oC Điều quan trọng pH - 9, hoạt tính thủy phân chitin trì 38,7 18,7% Đây yếu tố quan trọng cho tác dụng tương hỗ enzym rChiA protein tinh thể (Cry) - độc tố diệt côn trùng vi khuẩn Bt, protein Cry đòi hỏi mơi trường kiềm để hoạt hóa, mà ruột trùng Bộ cách vẩy có mơi trường kiềm Như vậy, nghiên cứu về nhiệt độ phản ứng, độ bền nhiệt độ bền pH có ảnh hưởng đến hoạt động xúc tác enzyme 22 cần thiết, điều đảm bảo cho việc sử dụng enzyme chuyển hóa cách hiệu 4.5.2 Ảnh hưởng ion kim loại EDTA lên hoạt tính chitinase Chitinase thu nhận từ nguồn khác chịu ảnh hưởng ion kim loại lên hoạt tính khác Trong nghiên cứu chúng tôi, ion Hg 2+ nồng độ mM đã làm giảm hoạt tính rChiA xuống 4,7% nồng độ 10 mM làm cho rChiA hồn tồn hoạt tính enzym Điều giải thích tương tác ion Hg2+ với nhóm S - S hoặc –SH rChiA hình thành phức hợp chitinase Hg, làm thay đổi cấu hình giảm hoạt động enzym Ion Ca 2+ nồng độ 10 mM làm hoạt tính enzyme tăng 17,61% Hoạt động rChiA kích thích ion Ca2+, pha trộn ion Ca 2+ cần thiết cho vị trí xúc tác cấu trúc protein xác giống số chitinase khác (García-Fraga et al., 2014) Theo đó, diện ion Ca 2+ làm thay đổi cấu trúc bậc protein làm hoạt tính enzym tăng 4.5.3 Ảnh hưởng chất tẩy rửa dung môi hữu Các chất tẩy rửa như: Tween 20 Tween 80 nồng độ 0,5 1% trì ổn định hoạt tính rChiA có mặt hợp chất bảo vệ làm bền phân tử protein enzym tác động tác nhân làm thay đổi cấu trúc enzym trình xúc tác phản ứng; 4.5.4 Động học phản ứng enzyme Giá trị Km bé lực enzym với chất lớn ngược lại Trong nghiên cứu chúng tơi, sử dụng 4-MU-(GlcNAc)3 làm chất giá trị Km 0,41 ± 0,06 mg/ml (tương đương 0,52 mM), dùng chất chitin K m đạt 8,9 ± 0,34 mg/ml Như vậy, chất 4-MU-(GlcNAc) thể tính đặc hiệu cao so với chất chitin Điều 4-MU-(GlcNAc) chất đặc hiệu cho endochitinase, mà lực rChiA với chất lớn Đối với chất 4-MU-(GlcNAc)3, thông số Km Vmax thu 0,41 ± 0,06 mM 0,53 ± 0,087 nM/phút cao so với nghiên cứu về endochitinase trước vi khuẩn B thuringiensis chiA74 có Km Vmax tương ứng 2,15 μM ± 0,45 0,11 ± 0,01 nM/phút, sử dụng 4-MU-(GlcNAc) làm chất (Casados-Vázquez, 2015) Khi sử dụng chitin làm chất, giá trị K m Vmax chúng tơi đã tính tương ứng 8,9 ± 0,34 mg/ml 0,63 ± 0,09 µM/phút, cao so với K m Vmax enzym chitinase chịu nhiệt từ vi khuẩn Cohnella sp A01 5,7 mg/ml 0,87 µM/phút (Aliabadi et al., 2016) thấp so với K m, Vmax chitinase tái tổ hợp từ Glaciozyma antarctica PI12 27,918 mg/ml 3,559 µM/µg (Ramli et al., 2011) Như vậy, giá trị Km Vmax đặc trưng cho tính đặc hiệu loại enzym loại chất 23 4.5.5 Sản phẩm thủy phân chất chitinaseQuá trình thủy phân chitin bắt đầu endochitinase phân cắt nội mạch phân tử chitin thành oligo-N-acetyl-D-glucosamine, N-acetyl-glucosaminidase (NAGase), NAGase tiếp tục thủy phân diacetyl-chitobiose, triacetyl-chitotriose, tetraacetylchitotetraose oligo-N-acetyl-D-glucosamine từ đầu không khử tạo thành đơn phân N-acetyl-D-glucosamine Trong nghiên cứu này, tỷ lệ NAGase thấp khơng đủ để thủy phân hồn tồn oligomer tạo đơn phân Vì vậy, sản phẩm q trình thủy phân chất ngồi N-acetyl-D-glucosamine có oligosaccharide với mức trùng hợp khác 4.6 Thử nghiệm khả kháng nấm gây bệnh thực vật tăng hoạt tính diệt sâu chitinase tái tổ hợp 4.6.1 Khả kháng nấm gây bệnh thực vật chitinase tái tổ hợp Trong nghiên cứu chúng tơi, rChiA có khả ức chế phát triển loại nấm gây bệnh thực vật F.oxysporum R solani mà khơng gây ảnh hưởng đến Mucor sp Kết nghiên cứu chitinase có hoạt tính kháng nấm khác cấu trúc bề mặt tỷ lệ chitin thành tế bào nấm Chitinase dễ dàng tương tác với chitin có thành tế bào nấm vật liệu bên xếp theo cách cho phép tiếp xúc với bó sợi chitin bề mặt thành tế bào nấm Các enzym dễ dàng liên kết với chất chitin thành tế bào nấm, sau tăng vận tốc thủy phân chitin ức chế nấm gây bệnh Tương tự, chitinase từ chủng B subtilis TV-125A có hoạt tính kháng mạnh nấm F culmorum loài nấm kiểm tra (Senol et al., 2014); chitinase từ lồi Apergillus terrus có khả kháng loại nấm gây bệnh thực vật với mức độ khác nhau, hoạt tính thể mạnh A niger (đường kính vòng ức chế 20 mm) yếu F oxysporum (đường kính vòng ức chế mm) (Aida Taghreed, 2014) 4.6.2 Hỗ trợ hoạt tính diệt sâu Bộ cánh vẩy chitinase tái tổ hợp Một ứng dụng tiềm chitinase kiểm soát sinh học tăng khả diệt côn trùng độc tố Bt Trong nghiên cứu chúng tôi, sử dụng kết hợp enzym rChiA với protein tinh thể Bt từ chủng SP10.6 đã rút ngắn thời gian gây chết từ 72 xuống 48 (gây chết 100% sâu tơ 84,3% sâu khoang), đồng thời giá trị LC 50 giảm 8,04% 6,80% sâu tơ sâu khoang Theo công bố Ni cộng (2015), thêm chitinase tinh Chi9602 ChiW50A vào chế phẩm bào tử, tinh thể chủng Bt YBT-1502 đã làm tăng hoạt tính diệt trùng ấu trùng sâu bướm H armigera, thể giá trị LC50 giảm 17,6% 30,4% tương ứng Sở dĩ chitinase có tác dụng tăng khả diệt côn trùng rút ngắn thời gian gây chết côn trùng enzym dễ dàng phân hủy màng peritrophic, lớp màng bao bọc ruột trùng, màng có cấu trúc protein sợi chitin Đây rào ngăn cản nhiễm trùng vi khuẩn hoặc vi rút cho phép dòng chảy chất dinh dưỡng, chất khoáng nước Khi chitinase tiếp xúc với 24 màng peritrophic enzym phân cắt ngẫu nhiên vị trí bên mạch chitin dẫn đến suy yếu ruột côn trùng gây thủng màng peritrophic, tạo điều kiện cho độc tố Bt tăng cường khả tiếp xúc với thụ thể biểu mô ruột, giúp cho trình gây độc protein tinh thể Bt diễn dễ dàng nhanh Sâu tơ loại sâu khó trị tính kháng thuốc hóa học cao, sâu khoang loại sâu lớn, ăn tạp, gây hại tất loại rau, đối tượng gây hại nặng rau, đậu Sâu non tuổi nhỏ thường gây hại nghiêm trọng hàng trăm sâu non tập trung lại ăn nhanh chóng làm xơ xác Sâu non ăn vỏ làm giảm phẩm chất Sâu khoang loại sâu khó diệt thuốc trừ sâu hóa học Vì vậy, kết thử nghiệm hoạt tính diệt sâu protein tinh thể Bt với hỗ trợ chitinase khả quan có ý nghĩa Kết nghiên cứu cho thấy tiềm chitinase sử dụng q trình diệt trùng mở hướng nghiên cứu cách phối trộn enzym với chế phẩm Bt KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Từ 132 chủng B thurigiensis serovar kurstaki phân lập Việt Nam, đã sàng lọc tuyển chọn chủng B thuringiensis serovar kurstaki MSS1.1, chủng sinh tổng hợp chitinase cao (hoạt tính đạt 0,54 U/ml) Gen chiA từ chủng Btk MSS1.1 đã tách dòng, xác định trình tự nucleotide đăng ký GenBank với mã số MF630994 Gen chiA đã biểu thành công E coli BL21(DE3) với hiệu suất cao cho hoạt tính cao Chitinase tái tổ hợp (rChiA) thuộc họ glycosyl hydrolase 18 tiết khoang chu chất nhờ peptide tín hiệu gen chiA nhận biết hệ thống biểu E coli Đã tinh thành công rChiA, enzym sau tinh có khối lượng phân tử ~70 kDa, hoạt tính riêng đạt 72,11 U/mg protein với hiệu suất thu hồi 40,32%, độ 4,65 lần rChiA hoạt động tốt 40 oC pH 7; bền 35oC pH Các ion kim loại: Mn2+, Mg2+, Cu2+, Zn2+, Fe2+, Hg2+, Ag+ EDTA làm giảm hoạt tính rChiA; Các ion: Ca 2+, K+, Na+ làm tăng hoạt tính rChiA Dung môi hữu cơ: ethanol, acetone, methanol, n-butanol chất tẩy rửa SDS đều làm giảm hoạt tính rChiA Chitinase tái tổ hợp có khả ức chế sinh trưởng nấm F oxysporum R solani; rChiA có khả tăng hoạt tính diệt trùng protein tinh thể Bt thể giá trị LC 50 giảm 8,04% 6,80% tương ứng sâu tơ sâu khoang, rút ngắn thời gian gây chết protein tinh thể Bt sâu tơ (Plutella xylostella) sâu khoang (Spodoptera litura) từ 72 xuống 48 (gây chết 100% sâu tơ 84,3% sâu khoang) Kiến nghị 25 Tiếp tục nghiên cứu tác động ảnh hưởng chitinase đến nhóm gây bệnh khác, nghiên cứu mức độ cấu trúc protein rChiA Nghiên cứu điều kiện bảo quản để giữ hoạt tính chitinase thời gian dài ... thủy phân thành tế bào nấm theo Harighi cộng (2007) 2.3 Sơ đồ nghiên cứu Tồn q trình nghiên cứu tóm tắt sơ đồ sau: Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus. .. nghiên cứu tính chất endochitinase từ Bacillus thuringiensis phân lập Việt Nam Mục tiêu đề tài: Thu nhận chủng vi khuẩn Bt địa có khả sinh chitinase cao biểu chitinase tái tổ hợp E coli phục vụ nghiên. .. Bacillus thuringiensis có khả sinh chitinase Việt Nam 3.1.1 Phân lập vi khuẩn B thuringiensis Từ 320 mẫu đất thu thập từ tỉnh thành khác Việt Nam đã phân lập 1026 khuẩn lạc với đặc tính nhóm Bacillus