Bài viết trình bày khảo sát sự ảnh hưởng của sulforaphane, một hợp chất isothiocyanate được tìm thấy trên rau cải xanh, lên sự biểu hiện của ICAM-1 trong nuôi cấy tế bào nội mô mạch máu ở người.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Tập 21 * Số * 2017 SULFORAPHANE ỨC CHẾ PMA HOẠT HÓA SỰ BIỂU HIỆN CỦA PHÂN TỬ KẾT DÍNH LIÊN BÀO (ICAM-1) TRÊN TẾ BÀO NỘI MƠ ECV304 THƠNG QUA CON ĐƯỜNG TÍN HIỆU ROS, NF-ΚB VÀ AP-1 Phạm Ngọc Khơi* TĨM TẮT Đặt vấn đề: Bệnh lý xơ vữa động mạch bệnh trình viêm lâu dài xảy thành động mạch Sự hoạt động tế bào nội mô thành động mạch bệnh lý xơ vữa chứng minh nhiều năm có liên quan trực tiếp đến biểu phân tử kết dính liên bào (intercellular adhesion molecule-1, ICAM1), xem nguyên nhân gây tăng kết dính nội bào làm tổn thương lòng động mạch bệnh lý Vì vậy, việc ức chế chức phân tử ICAM-1 xem mục tiêu quan trọng điều trị bệnh lý viêm xơ vữa động mạch Mục tiêu: Trong nghiên cứu này, khảo sát ảnh hưởng sulforaphane, hợp chất isothiocyanate tìm thấy rau cải xanh, lên biểu ICAM-1 nuôi cấy tế bào nội mô mạch máu người Phương pháp nghiên cứu: Kỹ thuật nuôi cấy tế bào nội mô, khảo sát biểu gen protein ICAM-1 thí nghiệm kiểm tra bám dính tế bào sử dụng nghiên cứu thử nghiệm với sulforaphane đối chứng âm Kết quả: Chích thử nghiệm sulforaphane (0 - 50 μM) lên tế bào nội mô mạch máu cho thấy giảm biểu rõ rệt phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) lên bám dính tế bào bạch cầu mono THP-1 lên tế bào nội mô thông qua chế giảm biểu gen protein ICAM-1 Bên cạnh đó, sulforaphane ức chế PMA tạo reactive oxygen species (ROS) nội bào, ức chế hoạt hóa đường tín hiệu nội bào NF-κB AP-1 Kết luận: Nghiên cứu chứng minh sulforaphane có khả ức chế bám dính tế bào lên tế bào nội mơ ECV304 giảm biểu PMA tạo tín hiệu ICAM-1 thơng qua việc kìm hãm sản xuất ROS nội bào, đường tín hiệu NF-κB AP-1 Vì thế, sulforaphane có hiệu tốt việc giảm viêm bệnh lý xơ vữa động mạch Từ khóa: Sulforaphane, ICAM-1, ROS, NF-κB, AP-1, tế bào nội mô ABSTRACT SULFORAPHANE INHIBITS PMA INDUCED INTERCELLULAR ADHESION MOLECULE-1 (ICAM-1) EXPRESSION IN HUMAN ECV304 ENDOTHELIAL CELLS: EFFECTS ON ROS, NF-κB AND AP-1 ACTIVATION PATHWAYS Pham Ngoc Khoi * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement Vol 21 - No - 2017: 168 - 174 Background: Atherosclerosis is a long-term inflammatory disease of the arterial wall Endothelial activation, identified by intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) expression, is present in atherosclerotic, and is considered to increase neointima or atherosclerotic lesion formation Therefore, the functional inhibition of adhesion molecules could be a critical therapeutic target of inflammatory disease *Bộ môn Mô Phôi - Di truyền, Đại học Y khoa Phạm Ngọc Thạch, TP.HCM Tác giả liên lạc: TS Phạm Ngọc Khôi ĐT: 0909 097 802 Email: pnkhoi@pnt.edu.vn 168 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2017 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Tập 21 * Số * 2017 Nghiên cứu Y học Objectives: In the present study, we investigate the effect of sulforaphane, an isothiocyanate found in cruciferous vegetables, on the expression of ICAM-1 induced by phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) in cultured human endothelial cell line Methods: Human ECV304 endothelial cells culture, ICAM-1 gene and protein expression, inhesion assay are used for this study Results: Pretreatment of human ECV304 endothelial cell for h with sulforaphane (0 - 50 μM) dosedependently inhibited PMA-induced adhesion of THP-1 monocytic cells, gene and protein expression of ICAM-1 Furthermore, sulforaphane also suppressed PMA-induced production of intracellular ROS, NFκB and AP-1 activation Conclusions: This study suggested that sulforaphane inhibited the adhesive capacity of ECV304 and down regulates the PMA-mediated induction of ICAM-1 in ECV304 by inhibiting intracellular ROS production, NFκB and AP-1 signaling pathways Thus, sulforaphane may have beneficial effects to suppress inflammation within the atherosclerotic lesion Keywords: Sulforaphane, ICAM-1, ROS, NF-κB, AP-1, endothelial cell tự nhiên trà xanh(7), olive(6),… phối MỞ ĐẦU hợp tác động toàn diện, giãn mạch, cải thiện Xơ vữa động mạch tình trạng động mạch bị tuần hoàn mạch vành, giảm cholesterol máu, xơ cứng lòng mạch bị tắc hẹp chống viêm chí ức chế stress nhờ tạo mảng xơ vữa làm hạn chế lưu lượng máu dẫn mạng lưới chống oxy hóa mạnh mẽ, giúp hỗ đến thiếu máu nuôi quan thể trợ điều trị bệnh mạch vành, giảm đau thắt ngực Đây bệnh lý diễn tiến chậm, âm ỉ qua phòng ngừa nguy nhồi máu tim hiệu nhiều năm, nguyên nhân chủ yếu chất mỡ Bên cạnh đó, nghiên cứu dịch thặng dư đọng vào thành mạch, qua nhiều tễ học gần cho thấy loại trái tươi chế phức tạp, lâu dần đọng thêm calci tạo thành rau có vai trò bảo vệ hệ tim mạch mảng xơ vữa ổn định không ổn tốt ví dụ hợp chất isothiocyanate định(2,9) Cơ chế tạo mảng xơ vữa giải tìm thấy loại họ rau cải cải thích tế bào nội mơ mạch máu điều hòa xanh, cải Brussels, súp lơ, bắp cải Sulforaphane di chuyển bạch cầu vào tổ chức thông qua thành phần isothiocyanate tìm phân tử kết dính Các phân tử điều chỉnh thấy số loại rau họ cải đặc biệt có kết dính bạch cầu với nội mơ mạch máu hàm lượng cao cải xanh súp lơ cách gắn kích thích (ligand) đặc hiệu lên bạch xanh chứng minh nghiên cầu Lúc này, tế bào nội mô mạch máu tiết cứu gần làm giảm nguy nhiều E-selectin, P-selectin, phân tử kết dính liên bào loại ung thư(1), giúp điều trị bệnh béo phì tiểu loại (intercellular adhesion molecule-1, ICAMđường(10), chống oxy hóa, giảm tăng huyết áp 1) phân tử kết dính tế bào mạch máu loại viêm tuần hoàn mạch máu(11) (vascular cell adhesion molecule, VCAM-1) để Mục tiêu nghiên cứu kết dính bạch cầu với nội mô mạch máu tạo nên Nghiên cứu nhằm khảo sát vai trò mảng xơ vữa(3,2,5) Vì thế, ICAM-1 xem hợp chất sulforaphane, hợp chất dấu hiệu tiên lượng xấu cho bệnh lý xơ vữa isothiocyanate quan trọng tìm thấy động mạch rau cải, cải xanh ảnh hưởng lên biểu Trong năm gần đây, nhà khoa học phân tử kết dính liên bào ICAM-1 quan tâm nghiên cứu nhận thấy nuôi cấy tế bào nội mô người hoạt chất sinh học chiết xuất từ thảo dược Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2017 169 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Tập 21 * Số * 2017 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Hóa chất Sulforaphane (1-isothiocyanato – [methylsulfinyl] - butane) hóa chất cần thiết sử dụng nghiên cứu cung cấp từ hãng Sigma-Aldrich (Missouri, Hoa Kỳ) Kháng thể dùng thử nghiệm biểu protein ICAM-1 cung cấp từ hãng Cell Signaling Technology (Beverly, MA, Hoa Kỳ) Ni cấy tế bào nội mơ mạch máu Dòng tế bào nội mô mạch máu ECV304 cung cấp từ American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA, Hoa Kỳ) nuôi cấy môi trường dinh dưỡng Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) có bổ sung thêm 10% huyết thai bò (fetal bovine serum, FBS) 1% penicillin streptomycin nhiệt độ 37 oC tủ cấy với 5% CO2 Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) Các cặp primer đưa vào lựa chọn nghiên cứu dựa trình tự cặp mồi cơng bố ngân hàng gen NCBI (Hoa Kỳ) Trình tự mẫu dò dùng nghiên cứu bao gồm: ICAM-1 sense, 5’- CGA CTG Đo bám dính tế bào tín hiệu huỳnh quang Thí nghiệm đo bám dính tế bào bạch cầu mono THP-1 lên tế bào nội mô ECV304 thực kit 10 ng/mL calcein-AM (Molecular Probes, The Netherlands) theo nghiên cứu trước (Park cộng sự, 2009)(8) Đo sản xuất reactive oxygen species (ROS) Sự sản xuất ROS tế bào quan sát kính hiển vi đồng tiêu (confocal microscopy) sử dụng probe 5- 6-carboxyl-2’, 7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFDA, Molecular Probes, Eugene, OR, Hoa Kỳ) theo nghiên cứu trước tác giả (Khoi cộng sự., 2013)(4) Đo hoạt động gen báo cáo NF-κB AP-1 Tế bào nội mô ECV304 chuyển vector mang μg gen báo cáo pGL3-NF-κB pGL3-AP-1 phương pháp sử dụng Lipofectamine 2000 (Invitrogen) Các promoter sử dụng nhằm đo lường hoạt động NF-κB AP-1 luciferase tế bào xử lý với sulforaphane Xử lý thống kê AGT GGT CGT TGA GG-3’ (836 bp) (GAPDH Số liệu hiển thị thống kê dạng trung bình ±SD thí nghiệm lặp lại ba lần riêng biệt cho thí nghiệm Sự khác biệt tập hợp liệu xác định kiểm định Student's t-test Sự khác biệt mô tả với P < 0.05 sử dụng chứng nội phản KẾT QUẢ ứng PCR nghiên cứu này) Ảnh hưởng sulforaphane lên biểu ICAM-1 tế bào nội mô ECV304 GAC GAG AGG GAT TG -3’, ICAM-1 antisense, 5’- TTA TGA CTG CGG CTG CTA CC -3’ (289 bp); GAPDH sense, 5’-TTG TTG CCA TCA ATG ACC CC-3’; GAPDH antisense, 5’-TGA CAA Western blot Kháng thể ICAM-1, β-actin (chứng nội tại) (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) sử dụng nghiên cứu với tỷ lệ pha loãng 1:1000 phát dựa vào kit ECL (Amersham, Franklin Lakes, NJ, Hoa Kỳ) Dòng tế bào nội mơ ECV304 xử lý với hoạt chất sulforaphane (30 μM) (hình 1A) - 12 giờ, tế bào nội mô thu hoạch sau thời gian xử lý để kiểm tra biểu gen protein ICAM-1 phản ứng RT-PCR 170 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2017 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Tập 21 * Số * 2017 Nghiên cứu Y học western blot Kết cho thấy, sulforaphane ức chế biểu gen protein ICAM-1 tỷ lệ thuận với thời gian xử lý mẫu (hình 1B 1C) C A B D E Hình 1: Ảnh hưởng sulforaphane lên biểu ICAM-1 tế bào nội mô ECV304 A B Hình 2: Sulforaphane ngăn chặn lên bám dính tế bào bạch cầu mono THP-1 lên tế bào nội mô ECV304 thông qua chế giảm biểu phân tử bám dính ICAM-1 viêm cho tế bào nội mô bệnh lý xơ vữa Tương tự cách làm trên, tế bào nội mô động mạch; sau ủ, phản ứng RT-PCR ECV304 xử lý trước với hoạt chất western blot tiến hành nhằm kiểm tra sulforaphane (0 - 50 μM) vòng sau biểu gen protein ICAM-1 xử lý với PMA vòng nồng trường hợp độ 100 nM PMA xem chất gây Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2017 171 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Tập 21 * Số * 2017 A B C Hình 3: Sulforaphane ngăn chặn biểu ICAM-1 thơng qua đường hoạt hóa tín hiệu sản xuất ROS nội bào, kích hoạt yếu tố phiên mã NF-κB AP-1 tế bào nội mô ECV304 172 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2017 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Tập 21 * Số * 2017 Kết cho thấy sulforaphane ức chế PMA tạo tín hiệu ICAM-1 tế bào nội mô theo liều lượng sử dụng từ - 50 μM (hình 1D 1E) Sulforaphane ngăn chặn lên bám dính tế bào bạch cầu mono THP-1 lên tế bào nội mô ECV304 thông qua chế giảm biểu phân tử bám dính ICAM-1 Ni cấy tế bào nội mơ ECV304 điều kiện có xử lý trước với sulforaphane (0 - 50 μM) PMA (100 nM), tiến hành bổ sung vào môi trường nuôi cấy tế bào nội mô dòng bạch cầu mono THP-1 để chứng minh bám dính bạch cầu mono tế bào nội mơ Kết cho thấy sulforaphane làm giảm rõ rệt bám dính bạch cầu mono tế bào nội mơ chụp kính hiển vi đồng tiêu (hình 2A) xử lý số liệu thông qua máy đọc kết phát huỳnh quang (hình 2B) Thí nghiệm lặp lại lần với ±SD Sự khác biệt tập hợp liệu xác định kiểm định Student's t-test Sự khác biệt mô tả với P < 0.05 có ý nghĩa mặt thống kê Sulforaphane ngăn chặn biểu ICAM-1 thông qua đường hoạt hóa tín hiệu sản xuất ROS, kích hoạt yếu tố phiên mã NF-κB AP-1 tế bào nội mô ECV304 Để kiểm tra đường tín hiệu ROS nội bào, chúng tơi sử dụng nồng độ thay đổi hoạt chất sulforaphane (0 - 50 μM) nuôi cấy tế bào nội mô ECV304 tiến hành đo tín hiệu ROS nội bào tạo đĩa nuôi cấy thông qua định lượng máy đọc kết phát huỳnh quang, kết cho thấy sulforaphane có khả ức chế biểu ICAM-1 thơng qua đường tín hiệu tạo ROS nội bào (hình 3A) Bên cạnh đó, để kiểm tra sulforaphane có ức chế ICAM-1 theo đường NF-κB và/hay AP-1 hay không, tế bào nội mô ECV304 tiếp tục thử thuốc với nồng độ sulforaphane (0 - 50 μM) lần kiểm tra độ hoạt động NF-κB AP-1 luciferase tương đối (hình 3B 3C) chứng minh yếu tố phiên mã NF-κB AP- Nghiên cứu Y học có liên quan mật thiết đến ức chế biểu ICAM-1 sulforaphane chuỗi truyền tín hiệu nội bào Như vậy, đường ức chế hoạt hóa biểu ICAM-1 sulforaphane theo đường tín hiệu nội bào ROS, yếu tố phiên mã NF-κB AP1.Thí nghiệm lặp lại lần với ±SD Sự khác biệt tập hợp liệu xác định kiểm định Student's t-test Sự khác biệt mơ tả với P < 0.05 có ý nghĩa mặt thống kê KẾT LUẬN Trong nghiên cứu này, lần đầu tiên, vai trò hoạt chất sulforaphane chứng minh việc ức chế biểu phân tử kết dính liên bào ICAM-1 mà hiệu có hoạt chất có ý nghĩa việc bảo vệ thành mạch bệnh lý xơ vữa động mạch thực dòng tế bào nội mơ mạch máu ECV304 người Nghiên cứu chúng tơi kết luận đường truyền tín hiệu nội bào sulforaphane ức chế biểu ICAM-1 nhằm chống xơ vữa động mạch là: ROS, NF-κB AP-1 Do đó, phần ăn bơng cải xanh có chứa nhiều hàm lượng hoạt chất sulforaphane khuyến cáo hứa hẹn đem đến tiềm phòng ngừa điều trị bệnh lý xơ vữa động mạch tương lai gần Lời cảm ơn: Chúng biết ơn GS.TS Young Do Jung (Bộ mơn Hóa Sinh, Khoa Y, Đại học Quốc gia Chonnam, Gwangju, Hàn Quốc) cố vấn khoa học, giúp đỡ trang thiết bị thực nghiên cứu Nghiên cứu tài trợ từ Quỹ Nghiên cứu (0720570) Trung tâm ung thư Quốc gia (Hàn Quốc), từ Chương trình nghiên cứu khoa học Bộ Giáo dục, Khoa học Công nghệ Hàn Quốc (2010-0009910) từ Trung tâm Nghiên cứu Y học (20110030731) Tổ chức Khoa học Công nghệ Hàn Quốc TÀI LIỆU THAM KHẢO Clarke JD, Dashwood RH, Ho E (2008) Multi-targeted prevention of cancer by sulforaphane Cancer Lett., 269, 291 304 Jakab L (2003) The pathogenesis of atherosclerosis Orv Hetil., 144, 1121 - 1128 Jensen HA, Mehta JL (2016) Endothelial cell dysfunction as a novel therapeutic target in atherosclerosis Expert Rev Cardiovasc Ther., 14, 1021 - 1033 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2017 173 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Tập 21 * Số * 2017 Khoi PN, Park JS, Kim NH, Jung YD (2012) Nicotine stimulates urokinase-type plasminogen activator receptor expression and cell invasiveness through mitogen-activated protein kinase and reactive oxygen species signaling in ECV304 endothelial cells Toxicol Appl Pharmacol., 259, 248 - 256 Kim JY, Park HJ, Um SH, Sohn EH, Kim BO, Moon EY, Rhee DK, Pyo S (2012) Sulforaphane suppresses vascular adhesion molecule-1 expression in TNF-α-stimulated mouse vascular smooth muscle cells: involvement of the MAPK, NF-κB and AP-1 signaling pathways, Vascul Pharmacol., 56, 131 - 141 Loffredo L, Perri L, Nocella C, Violi F (2017) Antioxidant and antiplatelet activity by polyphenol-rich nutrients: focus on extra virgin olive oil and cocoa Br J Clin Pharmacol., 83, 96 - 102 Myasoedova VA, Kirichenko TV, Melnichenko AA, Orekhova VA, Ravani A, Poggio P, Sobenin IA, Bobryshev YV, Orekhov AN (2016) Anti-atherosclerotic effects of a phytoestrogen-rich herbal preparation in postmenopausal women Int J Mol Sci., 17, E1318 Park JS, Kim KM, Kim MH, Chang HJ, Baek MK, Kim SM, Jung YD (2009) Resveratrol inhibits tumor cell adhesion to 10 11 endothelial cells by blocking ICAM-1 expression Anticancer Res., 29, 355 - 362 Reiner Z, Tedeschi-Reiner E (2001) New information on the pathophysiology of atherosclerosis Lijec Vjesn., 123, 26 - 31 Souza CG, Riboldi BP, Hansen F, Moreira JD, Souza DG., de Assis AM., Brum LM., Perry ML, Souza DO (2013) Chronic sulforaphane oral treatment accentuates blood glucose impairment and may affect GLUT3 expression in the cerebral cortex and hypothalamus of rats fed with a highly palatable diet Food Funct., 4, 1271 - 1276 Wu L, Noyan Ashraf MH, Facci M, Wang R, Paterson PG, Ferrie A, Juurlink BH (2004) Dietary approach to attenuate oxidative stress, hypertension, and inflammation in the cardiovascular system Proc Natl Acad Sci USA., 101, 7094 7099 Ngày nhận báo: 02/01/2017 Ngày phản biện nhận xét báo: 17/01/2017 Ngày báo đăng: 20/04/2017 174 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2017 ... thống kê Sulforaphane ngăn chặn biểu ICAM-1 thông qua đường hoạt hóa tín hiệu sản xuất ROS, kích hoạt yếu tố phiên mã NF-κB AP-1 tế bào nội mô ECV304 Để kiểm tra đường tín hiệu ROS nội bào, chúng... có khả ức chế biểu ICAM-1 thơng qua đường tín hiệu tạo ROS nội bào (hình 3A) Bên cạnh đó, để kiểm tra sulforaphane có ức chế ICAM-1 theo đường NF-κB và/ hay AP-1 hay không, tế bào nội mô ECV304. .. ECV304 A B Hình 2: Sulforaphane ngăn chặn lên bám dính tế bào bạch cầu mono THP-1 lên tế bào nội mô ECV304 thông qua chế giảm biểu phân tử bám dính ICAM-1 viêm cho tế bào nội mô bệnh lý xơ vữa