Dehydronifedipin (tạp A) và dehydronitroso nifedipin (tạp B) là hai tạp chất liên quan của nifedipin, phát sinh do phản ứng oxy hóa của nifedipin dưới tác dụng của oxy không khí hoặc ánh sáng tử ngoại. Do đó, Dược điển Việt Nam IV và Dược điển một số nước như BP 2013, USP 38 đều qui định phải kiểm tra giới hạn hàm lượng tạp A và tạp B cả trong nguyên liệu và thành phẩm nifedipin.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 TỔNG HỢP VÀ XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH KHIẾT CỦA DEHYDRONIFEDIPIN (TẠP A) VÀ DEHYDRONITROSO NIFEDIPIN (TẠP B) CỦA NIFEDIPIN Trần Văn Mười*, Nguyễn Xuân Thanh**, Văn Kim Thành**, Nguyễn Đức Tuấn** TÓM TẮT Mở đầu – Mục tiêu: Dehydronifedipin (tạp A) dehydronitroso nifedipin (tạp B) hai tạp chất liên quan nifedipin, phát sinh phản ứng oxy hóa nifedipin tác dụng oxy khơng khí ánh sáng tử ngoại Do đó, Dược điển Việt Nam IV Dược điển số nước BP 2013, USP 38 qui định phải kiểm tra giới hạn hàm lượng tạp A tạp B nguyên liệu thành phẩm nifedipin Trong đó, chuẩn tạp A tạp B bán với giá đắt phải đặt mua từ nước nên gây khó khăn, bị động cho cơng tác kiểm nghiệm tạp chất nguyên liệu thành phẩm nifedipin Cho đến nay, Việt Nam chưa có nghiên cứu nước cơng bố qui trình tổng hợp tạp A tạp B nifedipin Từ nhu cầu thực tế trên, nghiên cứu thực với mục tiêu tổng hợp hai tạp A B đạt độ tinh khiết cao, dùng để thiết lập chất đối chiếu Đối tượng: Dehydronifedipin (tạp A) dehydronitroso nifedipin (tạp B) nifedipin Phương pháp nghiên cứu: Tạp A tổng hợp từ nifedipin phản ứng oxy hóa với tác nhân HNO3 – SiO2 Tạp B tổng hợp từ nifedipin phản ứng quang hóa tia tử ngoại Sản phẩm sau tổng hợp kết tinh xác định cấu trúc kỹ thuật phổ nghiệm IR, MS NMR, xác định độ tinh khiết phương pháp HPLC qui 100% diện tích pic Kết quả: Tạp A tạp B nifedipin tổng hợp với hiệu suất 31,1% (khoảng g) 73,4% (khoảng 1,7 g) Sản phẩm tổng hợp đạt độ tinh khiết sắc ký 99% Kết luận: Dehydronifedipin (tạp A) dehydronitroso nifedipin (tạp B) nifedipin tổng hợp thành công với độ tinh khiết sắc ký 99%, đủ điều kiện thiết lập chất đối chiếu Từ khóa: Tạp chất liên quan nifedipin, dehydronifedipin (tạp A nifedipin), dehydronitroso nifedipin (tạp B nifedipin), tổng hợp dehydronifedipin, tổng hợp dehydronitroso nifedipin ABSTRACT SYNTHESIS AND PURITY DETERMINATION OF DEHYDRONIFEDIPINE (IMPURITY A) AND DEHYDRONITROSO NIFEDIPINE (IMPURITY B) AS RELATED SUBSTANCE OF NIFEDIPINE Tran Van Muoi, Nguyen Xuan Thanh, Van Kim Thanh, Nguyen Duc Tuan * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement of Vol 20 - No - 2016: 170 - 176 Background - Objectives: Dehydronifedipine (impurity A, DH-NIF) and dehydronitroso nifedipine (impurity B, DHN-NIF), two related compounds of nifedipine, are arisen by oxydation of nifedipine by atmospheric oxygen and UV light The Vietnamese pharmacopoeia IV, BP 2013 and USP 38 require conducting the impurity test in nifedipine pharmaceutical substance as well as corresponding finished product Additionally, two mentioned impurity reference standards are costly with limited accessibility that affects implementation of these impurity test There have been no published local studies on chemical synthesis of two nifedipine impurities so far Therefore, this study was conducted with the aim of synthesis of DH-NIF and DHN-NIF with high purity that conform to establish reference standard *Sở Y tế Thành phố Hồ Chí Minh **Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: PGS TS Nguyễn Đức Tuấn ĐT: 0913 799 068 Email: diemnhim@yahoo.com 170 Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Nghiên cứu Y học Method: The subject of this study was DH-NIF and DHN-NIF Method: DH-NIF was synthesized from nifedipine by redox reaction, using nitric acid suported by silica gel (HNO3 – SiO2) DHN-NIF was synthesized by exposure of nifedipine to UV light The synthetic and crystallized products were determined chemical structure from their IR, MS and NMR spectroscopic data, purified by HPLC using peak area normalization method Results: DH-NIF and DHN-NIF were synthesized with 31.1% (ca g) and 73.4% yields (ca 1.7 g), respectively By using HPLC-PDA, their chromatographic purity was determined over 99% on the basis of peak area normalization method Conclusion: DH-NIF and DHN-NIF were successfully synthesized with their purity over 99% that conform to establish reference standards Key words: Related compound of nifedipine, dehydronifedipine (nifedipine impurity A), dehydronitroso nifedipine (impurity B), synthesis of dehydronifedipine, synthesis of dehydronitroso nifedipine ĐẶT VẤN ĐỀ Nguyên vật liệu Dehydronifedipin (tạp A) dehydronitroso nifedipin (tạp B) hai tạp chất liên quan nifedipin, phát sinh phản ứng oxy hóa nifedipin tác dụng oxy khơng khí ánh sáng tử ngoại(7), gây ảnh hưởng đến hiệu điều trị đặc tính an tồn nifedipin bệnh nhân(8) Do đó, Dược điển Việt Nam IV Dược điển số nước BP 2013, USP 38 qui định phải kiểm tra giới hạn hàm lượng tạp A tạp B nguyên liệu thành phẩm nifedipin(2,3,9) Trong đó, chuẩn tạp A tạp B bán với giá đắt phải đặt mua từ nước ngồi nên gây khó khăn, bị động cho cơng tác kiểm nghiệm tạp chất nguyên liệu thành phẩm nifedipin Cho đến nay, Việt Nam chưa có nghiên cứu nước cơng bố qui trình tổng hợp tạp A tạp B nifedipin Từ nhu cầu thực tế trên, nghiên cứu thực với mục tiêu tổng hợp hai tạp A B đạt độ tinh khiết cao, dùng để thiết lập chất đối chiếu Nguyên liệu nifedipin: nhà sản xuất Moehs (Tây Ban Nha), hàm lượng 98% - 102%, hạn dùng 11/2014 ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Hóa chất dung mơi: acid nitric, methanol, dicloromethan, ethyl acetat, n-hexan đạt tiêu chuẩn phân tích Acetonitril (ACN), methanol (MeOH) đạt tiêu chuẩn dùng cho sắc ký lỏng Trang thiết bị: hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Hitachi 2000, đầu dò PDA Máy quang phổ IR Bruker alpha-T Máy LC-MS Agilent 1200 nguồn ESI Máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Advance II Đèn UVA Reptile Vision Exo Terra 26W Bản mỏng silica gel F254 Máy đo nhiệt độ nóng chảy Gallenkamp Sanyo Cân phân tích ABT 220 – 5DM (Kern) Phương pháp nghiên cứu Tổng hợp tạp (dehydronifedipin) A nifedipin Dehydronifedipin tổng hợp từ nifedipin phản ứng oxy hóa khử, sử dụng tác nhân oxy hóa HNO3 - SiO2 Phản ứng tổng hợp sau(1): Đối tượng nghiên cứu Tạp A tạp B nifedipin Nifedipin Chuyên Đề Dược Dehydronifedipin (tạp A) 171 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Nghiên cứu Y học Tổng hợp tạp B (dehydronitroso nifedipin) nifedipin Nifedipin Dehydronitroso nifedipin tổng hợp từ nifedipin phản ứng quang hóa với tác nhân tia tử ngoại Phản ứng tổng hợp sau(4,5): Dehydronitroso nifedipin (tạp B) Sản phẩm sau tổng hợp tinh chế kỹ thuật sắc ký cột kết tinh hỗn hợp aceton - nước nồng độ 250 µg/ml ACN Qui trình xác định độ tinh khiết tạp F thẩm định dựa theo hướng dẫn ICH(6) Sắc ký cột: cột silicagel (60 x cm, 80 g), pha động ethyl acetat - n-hexan (2 : 8), mẫu thử: khoảng g sản phẩm thô hòa tan với lượng tối thiểu dicloromethan Kiểm tra phân đoạn (5 ml/phân đoạn) sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi ethyl acetat - n-hexan (tỷ lệ : với tạp A : với tạp B) Quá trình sắc ký cột kết thúc mỏng khơng xuất vết sản phẩm KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Sản phẩm sau tinh chế sơ kiểm tra độ tinh khiết nhiệt độ nóng chảy sắc ký lớp mỏng với hệ dung mơi có độ phân cực khác Sắc ký lớp mỏng: mỏng silicagel F254 (10 x cm) Hệ dung môi: n-hexan - ethyl acetat (8 : 2), n-hexan - ethyl acetat (6 : 4), n-hexan - aceton (4 : 6) Mẫu thử: mg/ml dicloromethan Sản phẩm sau thử tinh khiết xác định cấu trúc phương pháp phổ nghiệm IR, MS NMR Xác định độ tinh khiết tạp A tạp B HPLC-PDA Độ tinh khiết tạp A tạp B xác định phương pháp HPLC qui 100% diện tích pic Điều kiện sắc ký: cột Phenomenex Gemini NX C18 (150 x 4,6 mm; µm), pha động ACN nước (50 : 50), tốc độ dòng 0,8 ml/phút, đầu dò PDA với bước sóng phát 254 nm, thể tích tiêm mẫu 20 µl, nhiệt độ cột 30 oC Mẫu thử có 172 Tổng hợp tinh chế tạp A nifedipin (dehydronifedipin) Tạp A tổng hợp cách cân khoảng 3,46 g nifedipin ( 0,01 mol), cho vào bình cầu, thêm 100 ml dicloromethan Cân 2,5 g hỗn hợp HNO3-SiO2 chuẩn bị trước (2 g silicagel + 3,2 ml HNO3 đậm đặc, trộn 10 phút), cho vào bình cầu chứa nifedipin, khuấy 15 phút Lọc hỗn hợp phản ứng qua giấy lọc, hứng dịch lọc vào bình chiết, rửa bình cầu lần, lần 10 ml dicloromethan, cho nước rửa vào bình chiết, thêm tiếp 50 ml nước cất, lắc đều, để yên lấy dịch dicloromethan, cho vào cốc có mỏ Tiếp tục thực - lần với 50 ml nước cất dịch nước không làm giấy quỳ xanh chuyển sang đỏ (đã loại hết HNO3) Lọc dịch dicloromethan qua giấy lọc chứa Na2SO4 khan, hứng dịch lọc vào bình cầu Tiến hành cô chân không đến khô sấy chân không nhiệt độ không 50 oC Cho sản phẩm thơ vào lọ màu nâu, đậy kín bảo quản nhiệt độ oC Tiến hành sắc ký cột sản phẩm thô tinh chế sản phẩm thu lượng tối thiểu aceton cốc có mỏ, thêm từ từ nước cất hỗn hợp trở nên đục, để hỗn hợp nhiệt độ oC xuất tinh thể Lọc áp suất giảm, thu sản phẩm kết tinh sấy chân không nhiệt độ không 50 oC để thu sản Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 phẩm Hiệu suất toàn phần khoảng 31,1% (khoảng g) Sản phẩm sau kết tinh đo nhiệt độ nóng chảy lần, cho kết 104,6 ± oC, tương đương với nhiệt độ nóng chảy dehydronifedipin Kết khai triển sắc ký lớp mỏng với hệ dung mơi có độ phân cực khác cho thấy sản phẩm cho vết Phổ IR sản phẩm sau kết tinh xuất đỉnh đặc trưng phù hợp với công thức Nghiên cứu Y học cấu tạo dehydronifedipin: IR (KBr): max (cm1) C=O (1728), NO2 (1524), C-O (1111) Phổ ESIMS(+) sản phẩm sau kết tinh có m/z = 367,0908 [M-Na]+; M phù hợp với cơng thức phân tử dehydronifedipin: C17H16N2O6 (M = 344,3) Dữ liệu phổ 13C-NMR phổ 1H-NMR sản phẩm sau kết tinh trình bày bảng Phân tích liệu phổ 13C-NMR 1H-NMR cho thấy số lượng vị trí proton, carbon sản phẩm kết tinh phù hợp với công thưc cấu tạo dehydronifedipin (tạp A) Bảng 1: Dữ liệu phổ NMR sản phẩm sau kết tinh H-NMR(500 MHz, DMSO-d6): H (ppm) 8,26 (d; J = 9,5 Hz); 1H; H3’ 7,81 (t; J = 7,75 Hz); 1H; H5’ 7,73 (t; J = 10 Hz); 1H; H4’ 7,29 (d; J = Hz); 1H; H6’ 3,44; s; 6H; CH3 nhóm ester 2,55; s; 6H; CH3 gắn vòng pyridin 13 C-NMR(125 MHz,DMSO-d6): C (ppm) 23,10; 2C; CH3 gắn vòng pyridin 52,23; 1C; CH3 ester 124,35; 2C; C3, C5 124,46; 1C; C3’ 130,35; 1C; C5’ 130,60; 1C; C6’ 130,81; 1C; C4’ 133,80; 1C; C1’ 144,67; 1C; C4 146,81; 1C; C2’ 156,05; 2C; C2,C6 166,54; 2C; C=O ester Công thức cấu tạo dehydronifedipin (tạp A) Tổng hợp tinh chế tạp B nifedipin (dehydronitroso nifedipin) Tạp B tổng hợp cách cân khoảng 1,73 g nifedipin ( 0,005 mol), cho vào cốc có mỏ 250 ml Thêm 50 ml methanol, khuấy đều, chiếu đèn UV khoảng 15 (khoảng cách từ đèn tới bề mặt dung dịch khoảng 10 cm, che tồn hệ thống thùng carton kín) Sau phản ứng lắc dung dịch phản ứng với Na2SO4, chuyển dung dịch thu vào bình cầu, rửa cốc có mỏ với methanol lần, lần 10 ml, cho nước rửa vào bình cầu Tiến hành quay loại dung môi sấy chân không sản phẩm thu nhiệt độ không 50oC Cho sản phẩm thô vào lọ màu nâu, đậy kín bảo quản nhiệt độ 4oC Tiến hành sắc ký cột sản phẩm thơ tập trung phân đoạn có vết vị trí kiểm tra sắc ký lớp mỏng Bay dung mơi Chun Đề Dược dòng khí argon sấy chân không để thu sản phẩm Hiệu suất toàn phần khoảng 73,4% (khoảng 1,7 g) Sản phẩm sau kết tinh đo nhiệt độ nóng chảy lần, cho kết 94 ± 1oC, tương đương với nhiệt độ nóng chảy dehydronitroso nifedipin Kết khai triển sắc ký lớp mỏng với hệ dung mơi có độ phân cực khác cho thấy sản phẩm cho vết Phổ IR sản phẩm sau kết tinh xuất đỉnh đặc trưng phù hợp với công thức cấu tạo dehydronitrso nifedipin: IR (KBr): max (cm-1) C=O (1729), NO (1492), C-O (1110) Phổ ESI-MS(+) sản phẩm sau kết tinh có m/z = 351,0956 [M-Na]+; M phù hợp với công thức phân tử dehydronitroso nifedipin: C17H16N2O5 (M = 328,32) Dữ liệu phổ 13C-NMR 173 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Nghiên cứu Y học 135,01; 1C; C4’ 139,95; 1C; C1’ 144,40; 1C; C4 156,46; 1C; C2’ 161,64; 2C; C2,C6 167,71; 2C; C=O ester phổ 1H-NMR sản phẩm sau kết tinh trình bày bảng Phân tích liệu phổ 13C-NMR 1H-NMR cho thấy số lượng vị trí proton, carbon sản phẩm kết tinh phù hợp với công thưc cấu tạo dehydronitroso nifedipin (tạp B) Bảng 2: Dữ liệu phổ NMR sản phẩm sau kết tinh H-NMR (500 MHz, CDCl3): H (ppm) 7,72 (t; J = 7,5 Hz); 1H; H5’ 7,52 (d; J = Hz); 1H; H3’ 7,44 (t; J = 7,5 Hz); 1H; H4’ 6,55 (d; J = 10 Hz); 1H; H6’ 3,39; s; 6H; CH3 nhóm ester 2,67; s; 6H; CH3 gắn vòng pyridin 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3): C (ppm) 23,52; 2C; CH3 gắn vòng pyridin 52,02; 1C; CH3 ester 107,86; 2C; C3, C5 127,27; 1C; C3’ 128,86; 1C; C5’ 130,68; 1C; C6’ Công thức cấu tạo dehydronitroso nifedipin (tạp B) Xác định độ tinh khiết tạp A tạp B HPLC-PDA Kết thẩm định qui trình xác định độ tinh khiết tạp A tạp B nifedipin kỹ thuật HPLC-PDA trình bày bảng bảng Bảng 3: Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống phương pháp (n = 6) Giá trị thống kê Trung bình RSD Trung bình RSD Tạp A Tạp B tR (phút) 6,446 0,02% 7,167 0,18% Nhận xét : RSD thông số sắc ký diện tích đỉnh (S), thời gian lưu (tR) số đĩa lý thuyết (N) nhỏ 2%, hệ số bất đối S (µV x giây) 8588137 0,73% 6399361 0,12% As 1,16 0,00% 1,06 1,31% N 10839 1,09% 28073 1,79% (As) khoảng 0,8 – 1,5 Như qui trình xác định độ tinh khiết tạp A tạp B đạt tính phù hợp hệ thống (a) (b) (c) Hình 1: Sắc ký đồ mẫu trắng (a), mẫu thử tạp A (b), pha động (c) 174 Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 (a) (b) Nghiên cứu Y học (c) Hình 2: Sắc ký đồ mẫu thử tạp B (a), mẫu trắng (b), pha động (c) Kết khảo sát tính chọn lọc cho thấy KẾT LUẬN điều kiện phân tích: sắc ký đồ mẫu trắng Dehydronifedipin (tạp A) dehydronitroso mẫu pha động không xuất pic có thời gian nifedipin (tạp B) nifedipin tổng hợp lưu tương ứng với pic tạp A tạp B sắc ký thành công với hiệu suất toàn phần đồ mẫu thử Sắc ký đồ mẫu thử không xuất khoảng 31,1% (khoảng g) 73,4% (khoảng 1,7 pic tạp trùng với pic tạp A B Pic tạp A pic g) Cả tạp đánh giá để làm chất đối tạp B tinh khiết Vậy qui trình có tính chọn lọc chiếu với độ tinh khiết 99%, sử (Hình Hình 2) dụng kiểm nghiệm tạp chất liên quan Bảng 4: Kết khảo sát khoảng tuyến tính, độ xác độ phương pháp nifedipin Phương trình hồi qui Khoảng tuyến tính (ppm) Hệ số tương quan (R) Độ xác (RSD, n=6) Độ tinh khiết sắc ký Tạp A Tạp B ŷ = 26507786X ŷ = 25684885X 50 - 500 30 - 700 0,9999 0,22% 0,9999 0,16% 99,56% 99,71% Kết thẩm định cho thấy qui trình xác định độ tinh khiết tạp A tạp B nifedipin có tính chọn lọc, khoảng tuyến tính rộng với giá TÀI LIỆU THAM KHẢO trị hệ số tương quan cao, đạt yêu cầu độ xác Tạp A tạp B có độ tinh khiết sắc ký 99,56% 99,71% nên đủ điều kiện để thiết lập chất đối chiếu Chuyên Đề Dược Arash GC, Mohsen N, Hamid GI, Lotfi S, Zahra C (2009), “Oxidation of Hantzsch 1,4-Dihydropyridines Using Supported Nitric Acid on Silica Gel and Poly Vinyl Pyrrolidone (PVP) under Mild and Heterogeneous Conditions”, Bull Korean Chem Soc, 30(4), 972-974 Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tr 435-436 BP 2013, CD-ROM Henk de V, Gerard MJ Beijersbergen van H (1998) “Photoreactivity of nifedipine in vitro and in vivo”, Journal of photochemistry and photobiology B, 43, 217-221 Henkde V, Gerard MJ, Beijersbergen Van H (1995), “Photodegradation of nifedipine under in vivo related circumstances”, Photochemistry and Photobiology, 62(6), 959963 ICH Harmonized tripartite guideline (2005), Validation of analytical procedures: text and methodology, pp – 13 Nguyễn Thị Kim Thanh, Cao Ngọc Anh, Mai Thanh Hà, Lê Quang Thảo (2007), “Nghiên cứu tạo tạp chất nifedipin nitrophenylpyridin analog (tạp A) nifedipin nitrosophenylpyridin analog (tạp B) để kiểm tra phù hợp hệ thống sắc ký xác định tạp chất nguyên liệu 175 Nghiên cứu Y học 176 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 nifedipin phương pháp HPLC”, Tạp chí Kiểm nghiệm thuốc, số 3, 13-18 Syed LA (1989), Analytical profiles of drug substances, Academic Press, volume 18, pp 221-268 USP 38, Electronic Edition Ngày nhận báo: Ngày phản biện nhận xét báo: Ngày báo đăng: 30/10/2015 20/11/2015 20/02/2016 Chuyên Đề Dược ... 130,68; 1C; C6’ Công thức cấu tạo dehydronitroso nifedipin (tạp B) Xác định độ tinh khiết tạp A tạp B HPLC-PDA Kết thẩm định qui trình xác định độ tinh khiết tạp A tạp B nifedipin kỹ thuật HPLC-PDA... dicloromethan Sản phẩm sau thử tinh khiết xác định cấu trúc phương pháp phổ nghiệm IR, MS NMR Xác định độ tinh khiết tạp A tạp B HPLC-PDA Độ tinh khiết tạp A tạp B xác định phương pháp HPLC qui 100%... Related compound of nifedipine, dehydronifedipine (nifedipine impurity A), dehydronitroso nifedipine (impurity B), synthesis of dehydronifedipine, synthesis of dehydronitroso nifedipine ĐẶT VẤN