Xác định vùng mang tính kháng nguyên của trình tự fliC và OmpN3, đồng thời trình tự nucleotide mã hóa cho các vùng này cũng được tối ưu hóa để biểu hiện trong Bacillus subtilis.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 XÁC ĐỊNH EPITOP TIỀM NĂNG TRÊN PROTEIN FLIC VÀ OMPN3 CỦA EDWARDSIELLA ICTALURI IN SILICO ĐỂ HƯỚNG ĐẾN ỨNG DỤNG LÀM VACCIN PHÒNG BỆNH GAN THẬN MỦ Nguyễn Thị Linh Giang*, Nguyễn Anh Minh*, Huỳnh Xuân Yến*, Trần Cát Đông*, Vũ Thanh Thảo* TÓMTẮT Mở đầu: Edwardsiella ictaluri vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ cá da trơn Một số protein kháng nguyên tiềm E ictaluri nghiên cứu OmpN3 fliC nhằm ứng dụng việc tạo vaccin tái tổ hợp để phòng bệnh Để vaccin chủng ngừa qua đường niêm mạc, kháng nguyên cần cố định lên giá mang Bacillus subtilis để tăng hiệu tác động Mục tiêu: Xác định vùng mang tính kháng nguyên trình tự fliC OmpN3, đồng thời trình tự nucleotide mã hóa cho vùng tối ưu hóa để biểu Bacillus subtilis Phương pháp: 30 chủng vi khuẩn phân lập từ cá bệnh gan thận mủ định danh phản ứng sinh hóa giải trình tự 16S rDNA Các gen fliC OmpN3 khuếch đại giải trình tự để so sánh độ tương đồng Vùng mang tính kháng nguyên fliC OmpN3 xác định chương trình Imed, EpiC Swiss-Model Q trình tối ưu hóa vùng có tính kháng nguyên để biểu Bacillus subitlis thực với chương trình ATGme Kết quả: 30 chủng E ictaluri MS-17-156 phân lập định danh thành công Nghiên cứu xác định tối ưu hóa thành cơng đoạn gen mã hóa cho vùng kháng nguyên gồm 60 acid amin protein fliC OMPN3 với số CAI trình tự sau tối ưu hóa đạt 0,825 0,811 Kết luận: Trình tự đoạn nucleotide mã hóa cho vùng kháng nguyên gen fliC OmpN3 tối ưu hóa in silico dự đốn có khả gây miễn dịch đặc hiệu bệnh gan thận mủ, làm tiền đề cho nghiên cứu phát triển vaccin tái tổ hợp Từ khóa: fliC, OmpN3, epitope, E ictaluri ABSTRACT IDENTIFICATION OF POTENTIAL EPITOPES ON OMPN3 AND FLIC PROTEIN FROM EDWARDSIELLA ICTALURI IN SILICO TO SERVE AS VACCINE CANDIDATES AGAINST SEPTICEMIA Nguyen Thi Linh Giang, Nguyen Anh Minh, Huynh Xuan Yen, Tran Cat Dong, Vu Thanh Thao * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol 23 ‐ No 2‐ 2019: 32 – 39 Introduction: Edwardsiella ictaluri is the causative agent of Enteric septicemia in catfish (ESC) OmpN3 and fliC protein from this bacteria have been proved to be potential vaccine candidates against ESC Therefore, in an attempt to develop recombinant mucosal vaccine, epitopes on these proteins are identified and presented on the flagella of Bacillus subtilis to induce effective immune responses Method: 30 bacterial strains were isolated from catfish with ESC and identified based on their biochemical profiles and 16S rDNA sequences fliC and OmpN3 genes of these strains were amplified, sequenced and aligned Their immunogenic regions were then identified and analyzed by bioinformatics software such as Imed, EpiC and Swiss-Model Besides, the coding sequence of the chosen immunogenic region for expression in Bacillus subtilis was optimized by using ATGme program * Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: TS Vũ Thanh Thảo ĐT: 02838295641 – 127 32 Email: vuthanhthao@ump.edu.vn Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học Result: Collected strains are identified to be E ictaluri MS-17-156 The study has successfully determined and optimized the nucleotide sequence encoding for 60 amino acids which has highest immunogenicity for fliC and OMPN3 candidate protein The CAI values of the optimized fliC and OmpN3 coding sequences are 0.825 and 0.811, respectively Conclusion: The chosen antigenic regions of fliC and OMPN3 prove to be potential epitopes for development of recombinant vaccines against ESC Key words: fliC, OmpN3, epitope, E ictaluri MỞĐẦU Edwardsiella ictaluri trực khuẩn Gram (‐) thuộc họ Enterobacteriaceae, gây bệnh gan thận mủ cá da trơn, đặc biệt cá tra Bệnh ảnh hưởng lên cá giai đoạn, phát triển nhanh chóng, lây lan mạnh gây tỷ lệ chết cao(1) Điều trị với kháng sinh hiệu giai đoạn đầu cá nhiễm bệnh Do đó, biện pháp thích hợp để dự phòng bệnh cho cá sử dụng vaccin Các nghiên cứu giai đoạn đầu chủ yếu sử dụng vaccin vi khuẩn bất hoạt Tuy nhiên, khả gây miễn dịch cá không kéo dài(8) Sau đó, nghiên cứu hướng đến việc sử dụng vaccin giảm độc lực để chủng ngừa cho cá Các vaccin dạng thường dùng dạng tiêm phúc mơ khơng thể áp dụng với số lượng cá thể lớn Do đó, việc phát triển vaccin tái tổ hợp chủng ngừa qua đường niêm mạc giúp khắc phục nhược điểm Đối với vaccin tái tổ hợp, việc lựa chọn kháng nguyên có tính chất định hiệu chủng ngừa vaccin Trong số kháng nguyên E ictaluri, protein màng (Outer membrane protein ‐ Omp), protein tiêm mao chứng minh có khả gây đáp ứng miễn dịch tốt, ứng viên tiềm việc tạo vaccin tái tổ hợp Omp protein màng nhận diện cao kháng thể huyết cá nhiễm E ictalurid(7) Trong ba loại OmpN xác định E ictaluri, OmpN3 có khả gây đáp ứng miễn dịch cá tốt nhất(11) Đối với protein tiêm mao, gen mã hóa cho protein fliC E tarda tái tổ hợp vào E coli sử dụng để tạo vaccin DNA phòng bệnh Chuyên Đề Dược cho cá(3) Gần đây, Panangala cs xác định E ictaluri có hai flagellin 35 37 kDa mã hóa gen fliC1, fliC2, fliC3 fliC4(6) có tính kháng ngun thể ứng dụng làm vaccin gan thận mủ Sự phát triển tin sinh học kết hợp với tiến công nghệ DNA tái tổ hợp, kiến thức đáp ứng miễn dịch vật chủ vật liệu di truyền tác nhân gây bệnh mở hướng cho sản xuất vaccin Các phần mềm dự đốn vùng mang tính kháng ngun in silico từ trình tự amino acid phát triển dựa nhiều yếu tố, bao gồm cấu trúc biểu bề mặt dự đốn, tính linh động cấu trúc nhân tố trình tự gen có liên quan đến tính gây miễn dịch epitope tế bào T tế bào B(9) Hiện nay, phương pháp thơng dụng để dự đốn cấu trúc protein mơ tương đồng Trong đó, trình tự protein đích so sánh với sở liệu Protein Data Bank, từ tìm trình tự xác định cấu trúc thực nghiệm tương đồng với trình tự mục tiêu Dựa trình tự này, phần mềm xây dựng cấu trúc dự đoán protein mục tiêu Bên cạnh đó, gen mục tiêu cần tối ưu hóa cho biểu chủng tái tổ hợp dự kiến nhằm tránh tượng dị biệt codon Tần suất sử dụng codon đồng nghĩa thường có khác biệt lồi, thường xem nguyên nhân tác động đến 33 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học mức độ biểu protein(10) Chỉ số tương VẬTLIỆU-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU thích codon (Codon Adaption Index ‐ CAI) Vikhuẩn số lượng codon hoạt động hiệu (Effective E ictaluri Các trình tự mang tính kháng 30 chủng vi khuẩn phân lập từ cá tra bị gan thận mủ Đồng sông Cửu Long cung cấp công ty Vemedim E ictaluri medium (EIM) môi trường chọn lọc để phân lập vi khuẩn Kit API 20E (BioMerieux) dùng để khảo sát đặc điểm sinh hóa vi khuẩn nguyên chèn vào vùng biến động Định danh chủng vi khuẩn (acid amin 144‐217) cấu trúc tiêm mao Vi khuẩn thu nhận cấy môi trường EIM, quan sát mô tả đặc điểm khuẩn lạc number of codon ‐ ENc) hai số thường quan tâm tiến hành tối ưu hóa Nghiên cứu tiến hành xác định tối ưu hóa đoạn nucleotide mã hóa vùng mang tính kháng ngun protein OmpN3 fliC hag B subtilis nhằm hướng đến ứng dụng làm vaccin niêm mạc phòng bệnh gan thận mủ cá tra Bảng 1: Danh sách mồi sử dụng nghiên cứu Gen mục tiêu 16S rDNA fliC4 OmpN3 Tên 27F 1492R fliC4_F fliC4_R OmpN3_F OmpN3_R Trình tự 5’-3’ AGAGTTTGATCMTGGCTCAG TACGGYTACCTTGTTACGACTT TTTTCACTATGGGTGCCGATAG GCCAATCGGCCATATACACTGG AAAAAGCAACGCCGTTGCTC AGCATAGGGTATCAGAGGGTATC Các chủng vi khuẩn định danh dựa đặc điểm sinh hóa thơng qua kit API 20E Đồng thời, chủng vi khuẩn định danh cấp độ phân tử giải trình tự gen 16S rDNA (Bảng 1) Mỗi mẫu giải trình tự với phản ứng sử dụng mồi 27F 1492R, thực công ty Base I (Malaysia) Trình tự thu từ phản ứng lắp ráp lại dựa vùng gối đầu trình tự chương trình SeqMan (Lasergene 7.0) Trình tự đưa lên NCBI nBLAST để so sánh với liệu DNA GenBank Các lồi có giá trị E thấp vùng Query Coverage cao tương đối gần với chủng giải trình tự Xác định trình tự mang tính kháng ngun fliC OmpN3 Nghiên cứu Panangala cs xác định giải trình tự gen fliC1, fliC2, fliC3 fliC4 quy định cho tiêm mao fliC 34 Kích thước 1492 bp 1227 bp 1269 bp E ictaluri, có trình tự acid amin sở liệu NCBI tương ứng AVZ83421.1, AVZ83422.1, AVZ83423.1 AVZ83424.1(6) Các trình tự acid amin gióng hàng cho thấy vùng bảo tồn thuộc acid amin 1‐160 đầu tận N 74 acid amin cuối đầu tận C, tương ứng với domain D0/D1 cấu trúc flagella vi khuẩn Gram âm Domain D0/D1 gấp cuộn tương tác với Toll‐like Receptor gây đáp ứng miễn dịch Vì vậy, lựa chọn trình tự mang tính kháng nguyên vùng biến động gen để tạo miễn dịch đặc hiệu E ictaluri Khi so sánh vùng biến động trình tự fliC1‐fliC4, nhận thấy vùng biến động trình tự acid amin quy định gen fliC4 biểu bề mặt phân tử protein (theo kết mơ cấu trúc protein từ chương trình Swiss‐Model), có khả Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 tạo miễn dịch tốt hơn(2) Cụ thể, trình tự biểu lên bề mặt tương tác với kháng thể hiệu (hoạt động B‐cell epitope) Vì vậy, nhóm nghiên cứu lựa chọn gen fliC4 gen đích để xác định vùng mang tính kháng nguyên đặc hiệu E ictaluri Neema cs ứng dụng tin sinh học xác định cấu trúc chức OmpN Kết quả, E ictaluri có OmpN (OmpN1, OmpN2 OmpN3)(5) Yang cs tạo dòng biểu thành công rOmpN để thử nghiệm khả bảo vệ chống lại E ictaluri Kết cho thấy chủng ngừa protein rOmpN3 có phần trăm sống sót tương đối 67,5%, cao so với rOmpN1 rOmpN2(11) Vì vậy, nhóm nghiên cứu lựa chọn gen OmpN3 gen đích để xác định vùng mang tính kháng ngun Trình tự fliC4 OmpN3 khuếch đại phản ứng PCR với DNA nhiễm sắc thể 30 chủng E ictaluri phân lập sau tinh chế giải trình tự với cặp mồi tương ứng (Bảng 1), đưa lên NCBI BLASTx để so sánh với liệu GenBank so sánh độ tương đồng phần mềm MegAlign (Lasergene 7.0) Trình tự mang tính kháng ngun dự đốn chương trình Imed (imed.med.ucm.es) EpiC (bioware.ucd.ie/epic) với tiêu chí: có tính kích thích miễn dịch mạnh, quy định cho chuỗi 60 acid amin nằm bề mặt protein fliC OmpN3 E ictaluri (kiểm tra với chương trình Swiss‐Model) Mơ cấu trúc protein tái tổ hợp hag mang kháng nguyên khảm Các trình tự mang tính kháng ngun fliC OmpN3 sau lựa chọn thành công tiến hành tái tổ hợp giả định chương Chuyên Đề Dược Nghiên cứu Y học trình SnapGene để thu nhận protein hag.NFC hag.NOC Các protein tái tổ hợp kiểm tra lại tính kháng nguyên biểu lên bề mặt tiêm mao đoạn kháng nguyên chèn chương trình Imed Swiss‐Model Tối ưu hóa gen cho biểu Bacillus subtilis Quá trình tối ưu hóa thực cách thay codon trình tự mang tính kháng nguyên thành codon tối ưu cho B subtilis (dựa bảng mã tần suất sử dụng codon B subtilis subsp subtilis str 168), nhiên, codon có xuất gen hag ngun thủy khơng thay Mục tiêu đạt số CAI tương đương với CAI vùng biến động gen hag 0,812 Sau đạt trình tự tối ưu cho B subtilis, tiến hành kiểm tra tối ưu trình tự E coli B ( giúp biểu protein có tính kháng nguyên dạng vaccin tiểu đơn vị để so sánh với vaccin tái tổ hợp Bacillus subtilis nghiên cứu tiếp theo) thay đổi codon khơng sử dụng (nếu có), số CAI cần đạt khoảng 0,5‐0,6 Trình tự sau tối ưu hóa tổng hợp cơng ty Genscript® dạng plasmid pUC57.FNG KẾTQUẢ Định danh chủng vi khuẩn Trên môi trường EIM, E ictaluri khuẩn lạc tròn, trơn, lồi, có màu xanh lá, đường kính từ 1‐2 mm sau 48 28 oC (Hình 1A) Thử nghiệm kit API 20E (Hình 1B) cho kết mã tất 30 chủng 4004000, E ictaluri 35 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 (B) (A) Hình 1: Hình thái khóm phản ứng sinh hóa kit API 20E hình thái, sinh hóa trình tự 16S rDNA, có Gen 16S rDNA khuếch đại thành thể kết luận chủng vi khuẩn phân lập từ cá công với cặp mồi 27F/1492R (giếng 1‐30, Hình bệnh chủng E ictaluri MS‐17‐156 2) Kết giải trình tự cho thấy độ tương đồng 100% với trình tự tham chiếu (CPCP028813.1) từ GenBank Từ kết M 10 11 12 13 14 15 1500 bp M 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 1500 bp Hình 2: Sản phẩm PCR trình tự 16S rDNA 30 chủng vi khuẩn Xác định tối ưu hóa trình tự mang tính kháng ngun fliC thông qua BLASTx nhận thấy tương đồng Gen fliC4 (1.227 bp) thu nhận thành chủng E ictaluri MS‐17‐156, Accession ID công từ DNA nhiễm sắc thể E ictaluri AVZ83424.1 30 trình tự fliC4 giống phản ứng PCR Kết giải trình tự fliC4 so sánh công cụ Clustal W so sánh với liệu DNA GenBank (A) phần mềm MegAlign 99‐100% với trình tự quy định flagellin C (B) (C) Hình 3: Kết dự đốn vùng mang tính kháng ngun trình tự fliC AVZ83424.1 (A) Vùng mang tính kháng nguyên xác định Imed; (B) Vùng mang tính kháng nguyên xác định EpiC; (C) Mô tương đồng fliC Swiss-Model thu nhận trình tự nằm từ acid amin 201 Trình tự mang tính kháng ngun fliC đến 259 (Hình 3A 3B) Khi tiến hành mô xác định dựa trình tự acid amin tương đồng cấu trúc protein fliC E flagellin C, GenBank Accession ID ictaluri dựa khn mẫu protein 3K8V AVZ83424.1 chương trình Imed EpiC, 36 Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 chương trình Swiss‐Model nhận thấy vùng acid amin 201 đến 259 biểu bề mặt protein fliC (vùng màu đỏ, Hình 3C) Xác định trình tự mang tính kháng ngun OmpN3 Gen OmpN3 (1.269 bp) thu nhận thành công từ DNA NST E ictaluri Kết so sánh trình tự với nhờ công cụ Clustal W phần mềm MegAlign cho thấy trình tự nucleotide đoạn gen mã hóa protein OMPN3 bảo tồn chủng khơng ghi nhận vùng biến động trình tự Kết BLASTx cho thấy trình tự (A) Nghiên cứu Y học OmpN3 quy định cho porin E ictaluri MS‐ 17‐156, Accession ID WP_081167023.1 Vùng mang tính kháng nguyên OmpN3 xác định chương trình Imed EpiC dựa trình tự WP_081167023.1, kết cho thấy đoạn acid amin có giá trị dự đốn cao toàn phân tử protein đoạn 50 acid amin từ vị trí 258 đến 308 (Hình 4A 4B) Kết mô tương đồng OMPN3 E ictaluri chương trình Swiss‐Model cho thấy cấu trúc vùng acid amin 258‐308 rộng, dễ tương tác không gian với phân từ khác (Hình 4C) (B) (C) Hình 4: Kết dự đốn vùng mang tính kháng nguyên OMPN3 (A) Vùng mang tính kháng nguyên xác định Imed; (B) Vùng mang tính kháng nguyên xác định EpiC; (C) Mô tương đồng OMPN3 Swiss-Model OMPN3 sử dụng để tái tổ hợp giả định Mô cấu trúc protein tái tổ hợp mang với fragment N‐terminal C‐terminal kháng nguyên khảm gen hag để thu nhận protein hag.NFC Trình tự DNA quy định cho vùng mang hag.NOC tính kháng nguyên dự đoán fliC (A) (B) hag.NFC (C) hag.NOC 5WJZ 5WJT Hình 5: Kết kiểm tra tính kháng ngun protein hag.NFC hag.NOC (A) Kiểm tra vùng mang tính kháng nguyên protein hag.NFC Imed; (B) Kiểm tra vùng mang tính kháng nguyên protein hag.NOC Imed; (C) Bề mặt protein hag.NFC hag.NOC mô tương đồng Swiss-Model Chuyên Đề Dược 37 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Trình tự acid amin protein khảm kiểm tra với phần mềm Imed, nhận thấy tính kháng nguyên đoạn chèn vào vùng biến động gen hag bảo tồn (Hình 5A 5B), vùng mang tính kháng nguyên biểu lên bề mặt protein hag.NFC hag.NOC mô tương đồng Swiss‐Model dựa khuôn mẫu subunit flagella filament 5WJT 5WJZ B subtilis (vùng màu đỏ, Hình 5C) CTT AAA CCT TCA CTT GCA TAT CTT AAC GGA Tối ưu hóa trình tự mang tính kháng ngun OmpN3 fliC Giá trị CAI trình tự mã hóa kháng nguyên fliC OmpN3 đạt mục tiêu đề ra, xấp xỉ 0,812 vùng biến động gen hag, dựa tần suất sử dụng codon B subtilis Hệ số CAI trình tự mã hóa vùng mang tính kháng nguyên E coli khoảng 0,55 Các codon xuất trình tự mã hóa vùng mang tính kháng ngun fliC ompN3 xác định chương trình ATGme ACT, TCC, GTC, ACC, GCT, TAC codon có mức độ biểu trung bình GAG, GGT, CAG, GCA, GAT, AAG, AGC thay codon có mức độ biểu cao nhằm đạt số CAI tương dương với gen hag B subtilis Trình tự DNA mã hóa vùng mang tính kháng ngun fliC ompN3 sau tối ưu hóa trình bày với codon tối ưu in đậm Trình tự mang tính kháng ngun fliC sau tối ưu hóa có CDS 180 bp: GCT ACA GGC TCT TTG GAA CTG ACA AAA GGA CAA ACA CTG GTT TCA GGA ACA GAT GCT ACA GGA GCT GCG ACA TAT TAT CTG AAG GGT GTT GAC GCA GCA ACA GGT AAA GTA ACA TAT TCA TCT GTT AAA TTT ACT GTT GAT GCA AAA GAT GCA ACA AAA GTT ACT GTT GCG GCA GAT AAA Trình tự mang tính kháng nguyên OmpN3 sau tối ưu hóa có CDS 174 bp: CTT GCA CGC TAT GAT AAC CAC AAT GTA TAT CTT GCA GCA ATC TAT GGT GAA GTA AAG AAT ATG CAC TAT ATT GGT AAA CAG GAT GGA TTC GCA CCT AAG GCA CGT GGA TAT GAG CTT CTT GCA CAG TAT CAG TTC GAC TGC GGT 38 Các giá trị tham số q trình tối ưu hóa trình bày Bảng Bảng 2: Các giá trị tham số trình tối ưu hóa Trình tự Vùng biến động gen hag fliC sau tối ưu hóa OmpN3 sau tối ưu hóa Bacillus subtilis Escherichia coli B CAI ENc CAI 0,812 41 0,825 34 0,569 0,811 32 0,583 BÀNLUẬN Trong số kháng nguyên, fliC OMPN3 ứng viên tiềm cho vai trò tác nhân trị liệu FliC protein tiêm mao vi khuẩn Gram âm chứng minh có liên quan đến độc lực nhiều tác nhân gây bệnh cá Vibrio anguillarum, V fischeri, Aeromonas hydrophila, E tarda Các nghiên cứu trước chủ yếu sử dụng flagellin C tá dược miễn dịch(3) chưa có nghiên cứu ứng dụng fliC làm tác nhân gây miễn dịch đặc hiệu nghiên cứu Việc nhóm nghiên cứu lựa chọn vùng biến động gen fliC4 E ictaluri thể nhiều đặc tính kháng nguyên hiệu quả: thân nước, đặc hiệu E ictaluri có khả kích thích miễn dịch mạnh Protein màng ứng dụng nhiều nghiên cứu sản xuất vaccin chống lại bệnh nhiễm cá(4) Nghiên cứu thực mô cấu trúc 3D protein OMPN3 dự đốn vùng mang tính kháng ngun mạnh phân tử Từ đó, lựa chọn vùng 51 acid amin (258‐308) OMPN3, nhằm mục đích tăng đáp ứng miễn dịch vùng dễ dàng nhận diện hệ thống miễn dịch cá Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 KẾTLUẬN Nghiên cứu định danh 30 chủng vi khuẩn phân lập từ cá bệnh vùng đồng sông Cửu Long E ictaluri giải trình tự 16S rDNA phản ứng sinh hóa Trình tự vùng mang tính kháng nguyên ứng viên tiềm fliC OmpN3 xác định tối ưu hóa in silico cho biểu B subtilis Lời cảm ơn: Nghiên cứu sử dụng kinh phí đề tài số 240/2017/HĐ-SKHCN Sở Khoa học Công nghệ TP.Hồ Chí Minh cấp cho Vũ Thanh Thảo TÀILIỆUTHAMKHẢO Crumlish M, Dung TT, Turnbull JF, et al (2002), "Identification of Edwardsiella ictaluri from diseased freshwater catfish, Pangasius hypophthalmus (Sauvage), cultured in the Mekong Delta, Vietnam", Journal of Fish Diseases 25(12), pp.733‐736 Hopp TP, Woods KR (1981), "Prediction of protein antigenic determinants from amino acid sequences", Proc Natl Acad Sci U S A 78(6), pp.3824‐3828 Jiao XD, Zhang M, Hu YH, et al (2009), "Construction and evaluation of DNA vaccines encoding Edwardsiella tarda antigens", Vaccine 27(38), pp.5195‐5202 Luo Z, Fu J, Li N, et al (2016), "Immunogenic proteins and their vaccine development potential evaluation in outer membrane proteins (OMPs) of Flavobacterium columnare", Aquaculture and Fisheries 1, pp.1‐8 Chuyên Đề Dược Nghiên cứu Y học Neema NM, Karunasagar I, et al (2011), Structural and functional characterization of outer membrane protein N in Edwardsiella ictaluri: A bioinformatic approach Vol Panangala VS, Russo R, Santen VLV, et al (2009), "Organization and sequence of four flagellin‐encoding genes of Edwardsiella ictaluri", Aquaculture Research 40(10), pp.1135‐1147 Park SB, Jang HB, Nho SW, et al (2011), "Outer Membrane Vesicles as a Candidate Vaccine against Edwardsiellosis", Plos One 6(3), e17629 Shoemaker CA, Klesius P H (1997), "Protective immunity against enteric septicaemia in channel catfish, Ictalurus punctatus (Rafinesque), following controlled exposure to Edwardsiella ictaluri", Journal of Fish Diseases 20(5), pp.361‐368 Soria‐Guerra RE, Nieto‐Gomez R, Govea‐Alonso DO, et al (2015), "An overview of bioinformatics tools for epitope prediction: Implications on vaccine development", Journal of Biomedical Informatics 53, pp.405‐414 10 Villalobos A, Ness JE, Gustafsson C, et al (2006), "Gene Designer: a synthetic biology tool for constructing artificial DNA segments", BMC Bioinformatics 7, pp.285 11 Yang Q, Pan YL, Wang KY, et al (2016), "OmpN, outer membrane proteins of Edwardsiella ictaluri are potential vaccine candidates for channel catfish (Ictalurus punctatus)", Molecular Immunology 78, pp.1‐8 Ngày nhận báo: 18/10/2018 Ngày phản biện nhận xét báo: 01/11/2018 Ngày báo đăng: 15/03/2019 39 ... đây, Panangala cs xác định E ictaluri có hai flagellin 35 37 kDa mã hóa gen fliC1 , fliC2 , fliC3 fliC4 (6) có tính kháng ngun thể ứng dụng làm vaccin gan thận mủ Sự phát triển tin sinh học kết hợp... tiến hành xác định tối ưu hóa đoạn nucleotide mã hóa vùng mang tính kháng nguyên protein OmpN3 fliC hag B subtilis nhằm hướng đến ứng dụng làm vaccin niêm mạc phòng bệnh gan thận mủ cá tra Bảng... với vaccin tái tổ hợp, việc lựa chọn kháng ngun có tính chất định hiệu chủng ngừa vaccin Trong số kháng nguyên E ictaluri, protein màng (Outer membrane protein ‐ Omp), protein tiêm mao chứng minh