Nhằm khẳng định tác dụng của chế phẩm ĐHTKS, bài viết tiến hành thực hiện đề tài: Khảo sát tác dụng kháng viêm giảm đau, sự thay đổi trên dạ dày, tiểu cầu chuột nhắt trắng khi sử dụng chế phẩm Độc hoạt tang ký sinh trên thực nghiệm.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 20 * Số * 2016 Nghiên cứu Y học KHẢO SÁT TÁC DỤNG KHÁNG VIÊM GIẢM ĐAU VÀ SỰ THAY ĐỔI TRÊN DẠ DÀY, TIỂU CẦU CHUỘT NHẮT TRẮNG KHI SỬ DỤNG CHẾ PHẨM “ĐỘC HOẠT TANG KÝ SINH” TRÊN THỰC NGHIỆM Dương Ngọc Bảo*, Nguyễn Thị Sơn*, Nguyễn Phương Dung* TĨM TẮT Mục tiêu nghiên cứu: Các thuốc Đơng y ngày sử dụng rộng rãi đặc biệt bệnh lý xương khớp Trong chế phẩm Độc hoạt tang ký sinh (ĐHTKS) thành phẩm sử dụng phổ biến để điều trị đau lưng, đau nhức xương khớp…Ngồi ra, ĐHTKS có vị thuốc có tác dụng chống loét dày Nhằm khẳng định tác dụng chế phẩm ĐHTKS, tiến hành thực đề tài:”Khảo sát tác dụng kháng viêm giảm đau, thay đổi dày, tiểu cầu chuột nhắt trắng sử dụng chế phẩm Độc hoạt tang ký sinh thực nghiệm” Đối tượng nghiên cứu: Chế phẩmĐộc hoạt tang ký sinh Chuột nhắt chủng Swiss albino Thực hai mơ hình gây viêm: Gây phù chân chuột carrageenan gây u hạt thực nghiệm cách cấy viên cotton Thực hai mơ hình gây đau: Quặn bụng acid acetic mâm nóng cải tiến Cuối mơ hình cấy u hạt, đánh giá thay đổi niêm mạc dày số lượng tiểu cầu chuột nhắt trắng Kết quả: Chế phẩm Độc hoạt tang ký sinh cho chuột uống liều tương ứng gấp 10 lần liều người khơng có biểu độc tính cấp Chế phẩm Độc hoạt tang ký sinh 1,818 g bột thuốc/kg (tương đương 12 viên chế phẩm ĐHTKS/người 60 kg/ngày) giảm nửa liều 0,909 g bột thuốc/kg (tương đương viên chế phẩm ĐHTKS/người 60 kg/ngày) có tác dụng kháng viêm cấp, mạn tính, có tác dụng giảm đau, làm tăng tổn thương niêm mạc dày chuột nhắt, không ảnh hưởng số lượng tiểu cầu chuột nhắt trắng Kết luận: Chế phẩm Độc hoạt tang ký sinh liều 1,818g bột thuốc/kg chuột giảm nửa liều0,909 g bột thuốc/kg chuột có tác dụng kháng viêm cấp, mạn tính, có tác dụng giảm đau, làm tăng tổn thương niêm mạc dày không ảnh hưởng số lượng tiểu cầu chuột nhắt trắng Từ khóa: Kháng viêm, giảm đau, Độc hoạt tang ký sinh, meloxicam, dày, tiểu cầu ABSTRACT STUDY ANALGESIC AND ANTI-INFLAMMATORY EFFECT, THE CHANGE IN THE GASTRIC MUCOSA AND THE PLATELET COUNT OF MICE USING DU-HUO-DANG-JI-SHENG TABLET ON EXPERIMENTAL ANIMALS Duong Ngoc Bao, Nguyen Thi Son, Nguyen Phuong Dung * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 20 - No - 2016: 197 - 207 Objectives: Oriental medicine remedies are increasingly widely used, particularly in osteoarthritis diseases Du-huo-dang-ji-sheng (DHDJS) tablet is one of the most remedies commonly used to treat back pain, osteoarthritis pain To clarify the effects of DHDJS, we have carried out: "Study analgesic and antiinflammatory effect, the change in the gastric mucosa and the plateletcountof mice using Du-huo-dang-jishengtablet on experimental animals" Methods: Edema was by carrageenan and granuloma was inducted by cotton, acetic acid-induced acute abdominal writhing pain on mice, hot-plate test In the end of granuloma transplanting, evaluate the gastric Khoa Y học cổ truyền – Đại học Y Dược TP.HCM Tác giả liên lạc: Bs Dương Ngọc Bảo ĐT: 01267336917 Email: duongngocbao89@gmail.com 197 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 20 * Số * 2016 mucosal changes and the number of platelets in mice Results: Du-huo-dang-ji-sheng did not show any signs of acute toxicity in mice at dose of 10-time higher than the human does At dose of 1.818g/kg mouse body weight (equivalent to 12 tablets DHDJS/human 60kg/day) and 0.909g/kg (equivalent to tablets DHDJS/human 60kg/day) had shown an anti-inflammation and analgesic effect, increased the gastric mucosa lesions in mice and did not affect platelet count of mice Conclusions: At dose of 1.818g/kg mouse body weight and 0.909g/kg, DHDJS tablet had shown an antiinflammation and analgesic effect, increased the gastric mucosa lesions in mice and did not affect platelet count of mice Key word: anti-inflamatory, Du-huo-dang-ji-sheng, meloxicam, stomach hiệu kháng viêm, giảm đau chế ĐẶT VẤN ĐỀ phẩmĐộc hoạt tang ký sinh động vật thí Các NSAIDs mang lại hiệu nghiệm, đồng thời tìm hiểu ảnh hưởng kháng viêm tốt cho bệnh nhân Tuy nhiên, chế phẩm miêm mạc dày số NSAIDs gây nhiều hệ lụy cho tim mạch, lượng tiểu cầu chuột nhắt trắng thận, đặc biệt tác dụng bất lợi hệ NGUYÊNLIỆU-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU tiêu hóa loét, xuất huyết tiêu hóa, tiêu chảy, thiếu máu, buồn nơn, biếng ăn, đau bụng(1) Vì Ngun liệu thế, tìm kiếm phương cách giảm đau hiệu Chế phẩm Độc hoạt tang ký sinh Mỗi viên quả, an toàn cho bệnh nhân cần điều trị bao phim chứa cao khơ Độc hoạt 330 mg, Phòng NSAIDs ln vấn đề quan tâm phong 330 mg, Tang ký sinh 330 mg, Đỗ trọng Xu hướng sử dụng thuốc Đông y điều trị ngày tăng, đặc biệt bệnh lý xương khớp Theo thống kê Bộ Y tế, Việt Nam khoảng 30% bệnh nhân điều trị với y học cổ truyền Vì vậy, việc sử dụng thuốc cổ truyền điều trị bệnh lý xương khớp có mang lại hiệu mong đợi, cụ thể tăng tác dụng kháng viêm hạn chế tác dụng phụ NSAIDs hay không? Cho đến nay, chưa có nhiều chứng khoa học trả lời cho câu hỏi Theo số liệu thống kê Bệnh viện Y học cổ truyền TP Hồ Chí Minh (2014 - 2015), chế phẩm từ Độc hoạt tang ký sinh (ĐHTKS) có tần suất sử dụng cao nhất.Trong thành phần Độc hoạt tang ký sinh có Cam thảo, Bạch thược, Quế, Đương quy, vị thuốc nghiên cứu có tác dụng chống loét dày Chế phẩm thường phối hợp với thuốc kháng viêm nguồn gốc tổng hợp điều trị bệnh lý xương khớp Để có sở đánh giá hiệu phối hợp phối hợp Độc hoạt tang ký sinh với NSAIDs, thực nghiên cứu để đánh giá 198 330 mg, Ngưu tất 330 mg, Tần giao 330 mg, Sinh địa 330mg, Bạch thược 330 mg, Cam thảo 330mg, bột Tế tân 60 mg, Quế nhục 60 mg, Nhân sâm 60 mg, Đương quy 60 mg, Xuyên khung 30mg Động vật thí nghiệm: Chuột nhắt trắng phái (đực), nặng 18-22g, chủng Swiss albino Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh cung cấp Vật liệu – hóa chất: Bơng cotton, carrageenin (Sigma Ltd Co., USA) Dung dịch chống thấm Omano imbidente (Ugo Basile, Italia) Meloxicam (meloxicam 7,5mg - Stada®) Phương pháp nghiên cứu Thử nghiệm độc tính cấp Chuột nhắt chia thành lô tương tự,những chuột lô nhận liều chất khảo sát Sự đánh giá dựa vào phản ứng toàn ứng hay bất ứng (sống hay chết) nhận thấy chuột nhóm sau 72 giờ.Chuột tiếp tục theo dõi sau 14 ngày uống để ghi nhận triệu chứng bất thường (nếu có) Xác định liều thấp có tác dụng mà không làm chết chuột liều làm chết 100% chuột Tính LD50 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 20 * Số * 2016 Nghiên cứu Y học theo công thức Karber -Behrens Trường hợp tất liều thử khơng có vật chết, liều lớn đãthử ký hiệu Dmax(5,7) Tác dụng kháng viêm đánh giá tỷ lệ % mức độ giảm thể tích sưng phù lơ thử nghiệm so với lơ chứng Mơ hình gây viêm gây carrageenan Theo phương pháp Winter – 1962 (2,5) Mức độ phù chân chuột tính theo cơng thức: Đo thể tích chân chuột bình thường (V0) máy Plethysmometer Nhúng chân phải chuột vào dung dịch chống thấm đến khuỷu chân, nhấn giữ bàn đạp để cố định, ghi nhận thể tích máy, tiến hành đo lần lấy kết trung bình Chuột gây viêm cách tiêm da gan bàn chân phải 0,05 ml hỗn hợp dung dịch carrageenan 1% (hỗn hợp dung dịch carrageenan 1% pha dung dịch nước muối sinh lý 0,9% chuẩn bị trước thử nghiệm để carrageenan trương nở) Chuột sau gây viêm cho vào lồng có giá đỡ để tránh nhiễm trùng chân Sau tiêm giờ, đo thể tích chân chuột (V3h) máy Plethysmometer Các chuột có chân sưng phù 50 % so với bình thường chọn cho thí nghiệm chia ngẫu nhiên vào lô, chuột chia lô Chuột lô cho uống nước thuốc thể tích 0,1 ml/10 g thể trọng: Lơ (n=10): Uống nước cất (Chứng) Lô (n=10): Uống meloxicam, liều mg/kg thể trọng (Melo 8) Lô 3(n=10): Uống chế phẩm ĐHTKS 1/10 Dmax, tương đương 1,818 g bột thuốc/kg chuột (ĐHTKS 1,818) Lô 4(n=11): Uống chế phẩm ĐHTKS 1/20 Dmax, tương đương 0,909 g bột thuốc/kg chuột (ĐHTKS 0,909) Cho chuột uống thuốc ngày thử nghiệm đo thể tích chân ngày, thời điểm đo lúc sáng Ký hiệu thể tích chân chuột theo ngày: V1, V2, V3, V4, V5, V6 Đánh giá kết quả: Trong đó: X: Độ phù tính theo % Vo: Thể tích chân chuột trước gây viêm Vt: Thể tích chân chuột thời điểm t sau gây viêm Tác dụng kháng viêm thuốc đánh giá khả ức chế phản ứng phù (%) biểu thị tỷ lệ % giảm mức độ tăng thể tích bàn chân chuột lô đối chứng lô thử so với mức độ tăng lơ khơng uống thuốc, tính theo công thức: I% = (ΔVc % -ΔVt %)/ ΔVc % Trong đó: ΔVc %: Trung bình độ tăng thể tích chân chuột lơ khơng điều trị ΔVt %: Trung bình độ tăng thể tích chân chuột lơ uống thuốc Mơ hình gây u hạt thực nghiệm cấy viên bơng cotton Một mẫu cotton có trọng lượng 10 ± mg vê tròn sấy tiệt khuẩn nhiệt độ 120ºC tủ sấy Chuột gây mê ether, cạo lông vùng lưng phía trên, dùng kéo phẫu thuật mắt bấm lỗ chếch sang bên, luồn kéo vào hướng đầu, mở rộng mũi kéo để tách kỹ da lưng khỏi cơ, cấy viên cotton da Khâu vô trùng để nối liền chỗ mổ lưng (3,5) Mổ chuột dụng cụ tiệt khuẩn cách ngâm cồn 90 %.Sát trùng vết mổ dung dịch cồn iod (Povidine) Chuột lô cho uống nước thuốc thể tích 0,1 ml/10g thể trọng: Lơ (n=10): Uống nước cất (Chứng) 199 Nghiên cứu Y học Lô (n=10): Uống meloxicam, liều mg/kg thể trọng (Melo 8) Lô (n=10): Uống chế phẩm ĐHTKS 1/10 Dmax, tương đương 1,818 g bột thuốc/kg chuột (ĐHTKS 1,818) Lô (n=11): Uống chế phẩm ĐHTKS 1/20 Dmax, tương đương 0,909 g bột thuốc/kg chuột (ĐHTKS 0,909) Cho chuột uống ngày, ngày lần vào định với thể tích 0,1ml/10g trọng lượng chuột Đến ngày thứ 8, giết chết chuột, bóc tách u hạt, cân tươi u hạt Sau cho u hạt vào tủ sấy 60 ºC 18 giờ, cân u hạt khô Thông số đánh giá Khối lượng u hạt tươi/ khô chuột (Sau trừ khối lượng trước cấy) Tỷ lệ % độ giảm khối lượng u hạt lô thử so với lô chứng biểu thị công thức sau: X % = [(Mch – Mth) / Mch] x 100 X %: Tỷ lệ % giảm khối lượng u hạt lô thử so với lô chứng Mch: Khối lượng u hạt trung bình lơ chứng Mth: Khối lượng u hạt trung bình lơ thử Mơ hình chuột nhắt trắng gây đau nhiệt (mâm nóng cải tiến)(6) Đo thời gian phản ứng với nhiệt độ chuột nhắt trước thí nghiệm Chuột lô cho uống nước thuốc thể tích 0,1 ml/10 g thể trọng: Lơ (n=10): Uống nước cất (Chứng) Lô (n=10): Uống meloxicam, liều mg/kg thể trọng (Melo 8) Lô (n=10): Uống chế phẩm ĐHTKS 1/10 Dmax, tương đương 1,818 g bột thuốc/kg chuột (ĐHTKS 1,818) Lô (n=11): Uống chế phẩm ĐHTKS 1/20 Dmax, tương đương 0,909 g bột thuốc/kg chuột (ĐHTKS 0,909) 200 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 20 * Số * 2016 Đặt chuột lên mâm nóng (Hot plate), ln trì nhiệt độ 55 ± 1oC hệ thống ổn nhiệt Thời gian phản ứng với kích thích tính từ lúc đặt chuột lên mâm nóng đến chuột có phản xạ liếm chân hay giẫy chân sau hay nhảy chồm lên Loại bỏ chuột phản ứng nhanh (trước giây) chậm (sau 30 giây) Tiêm tác nhân gây đau carrageenin 1% với liều 0,05 ml vào gan bàn chân sau chuột Cho chuột uống thuốc theo lô Xác định ngưỡng đau thời điểm sau tiêm tác nhân gây đau uống thuốc Mơ hình mâm nóng có sử dụng thêm tác nhân gây tăng nhận cảm đau áp dụng để đánh giá tác dụng giảm đau trung ương hay ngoại vi chất thử thông qua việc lựa chọn thông số đánh giá Khả giảm đau trung ương đánh giá qua thông số thời gian phản ứng đau, khả giảm đau ngoại vi đánh giá qua thông số rút ngắn thời gian phản ứng đau sau gây đau so với chứng Mô hình gây đau quặn acid acetic(6) Theo phương pháp nghiên cứu Koster cộng (1959) Chuột lô cho uống nước thuốc thể tích 0,1 ml/10 g thể trọng: Lơ (n=10): Uống nước cất (Chứng) Lô (n=10): Uống meloxicam, liều mg/kg thể trọng (Melo 8) Lô (n=10): Uống chế phẩm ĐHTKS 1/10 Dmax, tương đương 1,818 g bột thuốc/kg chuột (ĐHTKS 1,818) Lô (n=11): Uống chế phẩm ĐHTKS 1/20 Dmax, tương đương 0,909 g bột thuốc/kg chuột (ĐHTKS 0,909) Sau dùng thuốc 30 phút, tiến hành gây đau quặn cách tiêm phúc mạc dung dịch acid acetic 1% liều 0,1 ml/10 g thể trọng Chuột xuất đau quặn biểu thóp bụng lại, áp bụng xuống sàn, duỗi dài thân chân sau Đếm số đau quặn phút thời gian 30 phút kể từ tiêm acid acetic Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 20 * Số * 2016 So sánh kết lơ nghiên cứu, tính % ức chế đau quặn theo công thức: A% =(Dc – Dt) x 100/ Dc Trong đó: A%: Tỷ lệ giảm số đau quặn lô thử thuốc; Dc: Số đau quặn lô chứng; Dt: Số đau quặn lô thử thuốc Đánh giá thay đổi niêm mạc dày chuột nhắt trắng Cuối mơ hình u hạt (ngày thứ 8) giết chuột đá CO2, rửa dày chuột nhắt nước muối sinh lý, quan sát niêm mạc dày chuột kính hiển vi soi nổi, ống kính 10 Chỉ số loét ghi nhận theo thang điểm Takagi Okabe để đánh giá mức độ tổn thương dày (4): = Khơng có tổn thương = Phù nề niêm mạc xuất huyết = 1-5 tổn thương nhỏ (1-2 mm) = Nhiều năm tổn thương nhỏ tổn thương trung gian (3-4 mm) = Hai đến tổn thương trung gian nhiều tổn thương gộp (> mm) = Loét thủng Trong đó, số loét tính mức độ tổn thương dày 100% Đánh giá thay đổi số lượng tiểu cầu chuột nhắt trắng Cuối mơ hình cấy u hạt (ngày thứ 8) giết chuột, lấy máu tim, cho vào ống nghiệm có chứa sẵn EDTA, đếm số lượng tiểu cầu máy xét nghiệm huyết học hoàn toàn hãng Sysmex (Nhật), thực phòng thí nghiệm khoa Y học cổ truyền- Thành phố Hồ Chí Minh Xử lý kết Các liệu trình bày dạng Mean ± SEM (standard error of mean – sai số chuẩn Nghiên cứu Y học số trung bình).Việc xử lý thống kê đề tài dùng phần mềm STATA 13.0 Sự khác biệt lô phân tích phương pháp Wilcoxon, Mann – Whitney – U test P < 0,05 cho có ý nghĩa thống kê Đồ thị vẽ phần mềm MS EXCEL 2010 KẾT QUẢ Độc tính cấp Bảng Kết thử nghiệm độc tính cấp chế phẩm ĐHTKS Liều Số chuột thử nghiệm Số chết % chết 18,18 g bột thuốc/kg 16 0 Nhận xét: Ở liều tối đa bơm qua kim 18,18 g bột thuốc/kg chuột (tương đương 120 viên thuốc ĐHTKS) chuột chết 72 Trong thời gian tuần quan sát, không ghi nhận dấu hiệu bất thường xảy chuột thử nghiệm Tất chuột ăn uống hoạt động bình thường khơng có chuột chết Do đó, khơng tìm LD50 đường uống chuột nhắt thử nghiệm Từ bảng 1, xác định Dmax =18,18 g bột thuốc/kg Từ Dmax, chọn liều cho thử nghiệm dược lý là: 1/10 Dmax = 1,818 g bột thuốc/kg (tương đương 12 viên/ người 60 kg/ ngày) 1/20 Dmax = 0,909 g bột thuốc/kg (tương đương viên/ người 60 kg/ ngày) Tác dụng kháng viêm mơ hình gây phù chân bằngcarrageenin Kết thay đổi độ phù chân chuột theo thời gian lơ trình bày bảng 201 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 20 * Số * 2016 Bảng Sự thay đổi độ phù chân chuột (%) sau gây viêm carrageenan Sô TT Lô Thời gian Chứng Độ phù (%) (n=10) Melo (n=10) Độ phù (%) P2-1 % GPSVC Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày 121,2± 23,84 107,46± 26,67 86,99± 29,17 73,42± 25,97 63,89± 15,53 52,4 ± 9,86 113,7± 29,15 71,57 ± 26,7** 33,4 Ngày 36,83 ± 8,3 47,51± 20,03** 31,01 ±18,53* 20,46 ±13,54** 12,58 ± 9,5** ± 6,07** 45,38 57,76 67,98 75,99 83,7 ĐHTKS 1,818 Độ phù (%) 121,28 ± 49,8 81,17± 37,04* 61,64± 25,06 47,8 ± 21,13 36,21± 19,98 23,01 ± 15,9 11,08 ± 8,44 (n=10) P3-1 * * ** ** ** % GPSVC 24,46 29,14 34,9 43,32 56,09 69,91 ĐHTKS 0,909 Độ phù (%) (n=11) P4-1 % GPSVC 91,1± 29,53 55,08 ±20,47 39,75± 21,64 30,71 ±17,04 26 ± 17,81 17,38 ±12,53 14,06± 11,67 ** * * * ** * 48,74 54,3 58,17 59,31 66,83 61,82 Ghi chú: % GPSVC: Tỷ lệ % giảm phù sau viêm cấp (*) P