Mục tiêu của nghiên cứu là đánh giá độ chính xác của bộ xét nghiệm cải tiến xác định mức độ đứt gãy ADN tinh trùng ở các trường hợp nam giới vô sinh. Đối tượng nghiên cứu và phương pháp: nghiên cứu mô tả cắt ngang trên 50 mẫu tinh dịch của bệnh nhân nam giới được chẩn đoán vô sinh đến làm xét nghiệm tại Trung tâm Tư vấn Di truyền, Bệnh viện Đại học Y Hà Nội và có mật độ tinh trùng ≥ 1 triệu/ml. Kết quả nghiên cứu cho thấy, bộ xét nghiệm cải tiến có hệ số biến thiên CV% = 2,26% < 5%; ttn = 0,97 < tc . Như vậy có thể kết luận: bộ xét nghiệm xác định mức độ đứt gãy ADN tinh trùng cải tiến đạt yêu cầu của một bộ xét nghiệm định lượng.
Khoa học Y - Dược Đánh giá độ xác xét nghiệm xác định mức độ đứt gãy ADN tinh trùng ứng dụng chẩn đốn vơ sinh nam giới Nguyễn Minh Thu, Nguyễn Thị Trang* Trường Đại học Y Hà Nội Ngày nhận 8/5/2019; ngày chuyển phản biện 16/5/2019; ngày nhận phản biện 26/6/2019; ngày chấp nhận đăng 2/7/2019 Tóm tắt: Mục tiêu nghiên cứu đánh giá độ xác xét nghiệm cải tiến xác định mức độ đứt gãy ADN tinh trùng trường hợp nam giới vô sinh Đối tượng nghiên cứu phương pháp: nghiên cứu mô tả cắt ngang 50 mẫu tinh dịch bệnh nhân nam giới chẩn đốn vơ sinh đến làm xét nghiệm Trung tâm Tư vấn Di truyền, Bệnh viện Đại học Y Hà Nội có mật độ tinh trùng ≥ triệu/ml Kết nghiên cứu cho thấy, xét nghiệm cải tiến có hệ số biến thiên CV% = 2,26% < 5%; ttn = 0,97 < tc Như kết luận: xét nghiệm xác định mức độ đứt gãy ADN tinh trùng cải tiến đạt yêu cầu xét nghiệm định lượng Từ khóa: DFI, đứt gãy ADN tinh trùng, vơ sinh Chỉ số phân loại: 3.2 Đặt vấn đề Vô sinh vấn đề sức khoẻ sinh sản với tỷ lệ gia tăng mức đáng báo động, tồn xã hội quan tâm Trong đó, vơ sinh nam có tỷ lệ cao (gần tương đương vơ sinh nữ) chưa coi trọng mức vấn đề sở vật chất kỹ thuật, định kiến xã hội [1, 2] Tại Việt Nam, có xét nghiệm tinh dịch đồ định thường quy phổ biến, số có mức độ quan trọng tương đương định lượng kẽm, fructose tinh dịch [2], số đứt gãy ADN tinh trùng, mức độ stress oxy hóa lại chưa quan tâm mức Xét nghiệm đánh giá mức độ đứt gãy ADN tinh trùng xây dựng phương pháp đánh giá phân tán chất nhiễm sắc (Sperm Chromatin Dispersion - SCD) Fernandez cs công bố năm 2003 [3], khơng cho biết độ hồn thiện ADN tinh trùng mà đánh giá khả sinh sản nam giới, góp phần chẩn đốn theo dõi điều trị vơ sinh [4] Mặc dù khẳng định vai trò chẩn đốn vơ sinh nam [4], xét nghiệm đánh giá mức độ đứt gãy ADN tinh trùng xuất số trung tâm hỗ trợ sinh sản bệnh viện lớn; lại tiến hành kit nhập ngoại Halosperm Hãng Halotech ADN (Tây Ban Nha) với giá thành cao, nên số lượng bệnh nhân đồng ý làm xét nghiệm hạn chế Xuất phát từ tình hình thực tế trên, nhóm nghiên cứu tiến hành xây dựng đánh giá độ xác xét nghiệm cải tiến xác định mức độ đứt gãy ADN tinh trùng nam giới vô sinh theo phương pháp SCD với mục tiêu hồn thiện quy trình, hạ giá thành đảm bảo chất lượng xét nghiệm để đánh giá mức độ đứt gãy ADN tinh trùng nam giới Việt Nam Đối tượng phương pháp nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu 50 mẫu tinh dịch bệnh nhân nam chẩn đốn vơ sinh Bệnh viện Đại học Y Hà Nội, làm xét nghiệm đánh giá độ đứt gãy ADN tinh trùng Trung tâm Tư vấn Di truyền, Bệnh viện Đại học Y Hà Nội Tiêu chuẩn lựa chọn: bệnh nhân nam từ 18 tuổi, xét nghiệm tinh dịch đồ kết mật độ tinh trùng ≥ triệu/ml đồng ý tham gia nghiên cứu Tiêu chuẩn loại trừ: bệnh nhân nam giới không thoả mãn tiêu chuẩn trên, bị bệnh: ung thư phận sinh dục, HIV, giang mai, lậu, bệnh cấp tính, bệnh tâm thần bệnh nhân khơng đồng ý tham gia nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu Cỡ mẫu: để hồn thiện quy trình, xác định độ xác, chúng tơi sử dụng cơng thức tính cỡ mẫu cho nghiên Tác giả liên hệ: Email: trangnguyen@hmu.edu.vn * 61(9) 9.2019 Khoa học Y - Dược Bước giá Chuẩn ộ stress oxy hóa lại chưa quan tâm mức Xét nghiệm đánh mức bị độhỗn hợp tinh dịch - thạch: cho 25 µl ứt gãy ADN tinh trùng xây dựng phương pháp đánh giátinh sựdịch phân vàotán ốngchất agarose trộn pipet Giữ ống hiễm sắc (Sperm Chromatin Dispersion - SCD) Fernandez cs ởcông nhiệtbố độ năm 37 C 2003 nhanh chóng thực bước kế tiếp, ], khơng cho biết độ hồn thiện ADN tinh trùng mà tránh đánh giábịđược agarose đơng Nhỏ giọt 25 µl hỗn hợp tinh sinh sản nam giới, góp phần chẩn đốn theo dõi điều vô sinh dịch trị - thạch lên vị[4] trí khoanh tròn lam kính, đậy ặc dù khẳng định vai trò chẩn* đốn vơ sinh nam [4], lamen, ấn nhẹ, tránh bọt khí xuất Lam kính đặt Minh Nguyen, ện xét nghiệm đánh giáThu mức độ đứtThi gãyTrang ADNNguyen tinh trùng xuất suốt mộtquá trình thao tác Đặt tiêu vào tủ nằm ngang University trung tâm hỗ trợ sinh sản Hanoi bệnhMedical viện lớn; lại tiến hành bằnglạnh bộ4kit nhập ngoại C, 10 phút để agarose đông lại alosperm Hãng Halotech (Tây Ban2 July Nha) Received ADN May 2019; accepted 2019với giá thành khá cao, nên số Bước Sau hỗn hợp tinh dịch - thạch đông lại, lấy ợng bệnh nhânAbstract: đồng ý làm xét nghiệm hạn chế Xuất phát từ tình hình thực tế tiêu khỏibộ tủ lạnh, ên, nhóm nghiên cứu tiến hành xây dựng đánh giá độ xác racủa xét bỏ lamen cách trượt nhẹ The objective of this study is to evaluate the accuracy ghiệm cải tiến xác định mức độ đứt gãy ADN tinh trùng nam giới vô bịsinh Chuẩn dungtheo dịch biến tính làm biến tính ADN tinh of the improved test kit for analysing sperm DNA hương pháp SCD với mục tiêu hồn thiện quy trình, hạ giá thành đảm bảo trùng: lấy 80 µl dung dịch biến tính cho vào ống đựng 10 fragmentation in infertile men Subjects and methods: a ất lượng xét nghiệm để đánh độ đứt ADNsamples tinh trùng nam Việtsẽ dung dịch biến tính cần thiết ml nước cất,giới lắc cross-section study giá was mức conducted on gãy 50 semen am from infertile men with the sperm concentration ≥ Đặt tiêu vào khay chứa dung dịch biến tính vòng Evaluation on the accuracy of a test kit for analysing sperm DNA fragmentation in infertile men millions/ml Results exhibited the improved test kit had ối tượng phương pháp nghiên cứu phút the variable index CV% = 2.26% < 5%; ttn = 0.97 < tc Bước Ly giải tế bào: lấy tiêu từ dung dịch biến can be concluded that the improved test kit for sprem Đối tượngItnghiên cứu đặt vào DNA fragmentation anlysis is qualified for quantitative 50 mẫu tinh dịch bệnh nhân nam chẩn đốn vơ sinhtính Bệnh việnkhay Đạichứa 10 ml dung dịch ly giải tests ọc Y Hà Nội, làm xét nghiệm đánh giá độ đứt gãy ADN tinh trùngphút Trung tâm Tư n Di truyền, Bệnh viện DFI, Đại học Y Hàsperm Nội DNA fragmentation Keywords: infertile, Bước Rửa dung dịch ly giải: sau kết thúc bước ly Tiêu chuẩnClassification lựa chọn: bệnh nhân đồbản kếtvào giải,dịch đặt tiêu khay chứa nước cất phút để rửa number: 3.2 nam từ 18 tuổi, xét nghiệm tinh ật độ tinh trùng ≥ triệu/ml đồng ý tham gia nghiên cứu dung dịch ly giải Tiêu chuẩn loại trừ: bệnh nhân nam giới không thoả mãn các tiêu chuẩn trên, bị Bước Khử c bệnh: ung thư phận sinh dục, HIV, giang mai, lậu, bệnh cấp tính, bệnh tâmnước: thần khử nước cách cho tiêu vào dung dịch cồn vòng phút, sau để khơ tự nhiên bệnh nhân khơng đồng ý tham gia nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu Nhuộm tiêulàm bản:biến đặt tính tiêu ADN nằm Chuẩn bị dungBước dịch7.biến tính tinhngang, trùng: nhỏ lấy 80 µl dung Cỡ mẫu: để hồn thiện quy trình, xác định độ chúng tơi sử dụng cơng dịch xác, biến tính cho vào ống đựng 10 ml nước cất, lắc dung dịch biến tính dung dịch Giemsa - 30% phủ lên bề mặt tiêu bản, để cứu mô công thức Lwanga Lemeshow [5]: cần thiết Đặtthức tiêu vào khay chứa dung dịch biến tính vòng phút ức tính cỡ mẫu chotả tính mộttheo nghiên cứucủamơ tả tính theo cơng Lwanga nhiệt độ phòng 10 phút rửa qua nước từ vòi, Bước Ly giải tế bào: lấy tiêu từ dung dịch biến tính đặt vào khay chứa Trong đó: α/2 = 0,95; ε = 0,10; emeshow [5]: Trong đó: 1- α/2 = 0,95; ε = 0,10; p =giải 95% chínhlàm nhạt màu quầng halo rửa (độ mạnh 10 ml dung dịchýlytránh phút p =tham 95% (độ chínhnxác củalần quythực trình nghiệm tham chiếu), =Bước số lần Rửa dung ly giải:21, sau kết thúc bước ly giải, đặt tiêu vào khay c quy trình chiếu), = số cầnnthực hiện, tính Xửđược lýdịch số liệu chứa nước cất phút để rửa dung dịch ly giải thực cầntròn thựcsố hiện, tính 21, lấy úng lấy gấp đôinghiệm làm 50 Bước Khử nước: khử nước cách cho tiêu vào dung dịch cồn Đánh giá kết quả: gấp đơicứu: làm tròn sốcứu 50 Thiết kế nghiên nghiên mơ tả cắt ngang vòng phút, sau để khơ tự nhiên Phương phápThiết làmkếtiêu bản: cảinghiên tiến dựa trêntả quy trìnhBước SCD Fernandez cs Quan lam kính kínhngang, hiển vinhỏ quang học, đếm Nhuộm tiêusát bản: đặt tiêu nằm dung dịch Giemsa - 30% nghiên cứu: cứu mô cắt ngang 003) [3], sử dụng kit Halosperm Hãng Halotech nhấttiêu 500bản, tinhđểtrùng trênđộtiêu bảntrong để xác độqua đứtnước từ vòi, phủnhư lên sau: bề mặt nhiệt phòng 10 định phút mức rửa Phương pháp làm bản:thủy cải tiến dựa trình chúquy ý tránh rửa làm nhạt màu halo Bước Chuẩn bị thạch: đuntiêu cách eppendorf chứa agarose pha nhiệt gãy mạnh ADNsẵn tinh trùng.quầng Độ đứt gãy ADN tinh trùng o SCD Fernandez cs (2003) [3], sử dụng kit Xử lý số liệu ộ 95-100 C phút lò vi sóng phút, hóa hồn tồnHalo tinh trùng theo Fernandez xác lỏng định quầng kết quả: Halosperm Hãng sau: arose Pha loãng mẫu tinh dịchHalotech dung dịch PBS saoĐánh chogiá nồng độ khoảng