Bài viết nghiên cứu Mitomycin C ức chế quá trình phát triển in vitro của phôi chuột trinh sản giai đoạn tiền làm tổ dựa trên các phương pháp: gây siêu bài noãn và thu trứng; xử lý Mitomycin C hoạt hóa trinh sản và nuôi trứng;... Để nắm chi tiết nội dung nghiên cứu mời các bạn cùng tham khảo bài viết.
33(2): 89-94 T¹p chÝ Sinh häc 6-2011 MITOMYCIN C øC CHế QUá TRìNH PHáT TRIểN IN VITRO CủA PHÔI CHUộT TRINH SảN GIAI ĐOạN TIềN LàM Tổ Lê Thành Long, Hoàng Nghĩa Sơn Viện Sinh học nhiệt đới, Hồ Chí Minh Nguyễn Văn Đảm Công ty Công nghệ sinh học xanh, Hồ Chí Minh Nguyễn Thị Thơng Huyền Trờng đại học S phạm, Hồ Chí Minh Mitomycin C nhân tố hoá liệu pháp đợc dùng điều trị khối u rắn [2] Nó đợc dùng nhiều điều trị ung th nh ung th bàng quang, ung th dày, ung th ruột ung th vú [3] Tuy nhiên, việc điều trị ung th sử dụng Mitomycin C gây tác dụng phụ khác phụ nữ điều trị ung th vú, ảnh hởng đến trình sinh sản trình phát triển phôi phụ nữ mang thai Để hiểu rõ ảnh hởng Mytomycin C, phôi chuột đợc dùng làm mô hình cho việc đánh giá tác dụng phụ Mitomycin C lên phát triển in vivo Việc sử lý phôi chuột giai đoạn phôi dâu làm giảm số lợng tế bào khối tế bào bên (ICM) phôi nang [9] Chuột đợc tiêm Mitomycin C với liều 0,0707 mg/con làm giảm 50% số lợng trứng buồng trứng [8] Hơn nữa, tr×nh xư lý cht mang thai víi Mitomycin C cã thể làm số lợng tế bào ICM lớp dỡng bào (trophectoderm), làm giảm khả làm tổ phôi nang gây nhiều bất thờng trình phát triển thai nh gây sai hỏng thành bụng, sai hỏng vùng xơng sờn, giảm khối lợng thai gia tăng khối lợng thai [10] Tuy nhiên, nghiên cứu tập trung chủ yếu vào trình phát triển in vivo phôi giai đoạn phôi nang phôi giai đoạn sau làm tổ, đánh giá mặt giải phẫu mô phôi mà cha nghiên cứu sâu vào việc phát triển giai đoạn phôi tiền làm tổ in vitro nh tìm hiểu nguyên nhân làm giảm phát triển phôi chuột đợc xử lý với Mitomycin C Do đó, nghiên cứu khảo sát phát triển in vitro phôi chuột trinh sản dới tác động Mitomycin C Những ảnh hởng Mitomycin C đợc khảo sát từ lúc hoạt hoá trứng chín phát triển thành phôi giai đoạn tế bào, tế bào giai đoạn phôi dâu phôi nang nh biến đổi tế bào chất nhân tế bào phôi I PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU Đối tợng Chuột chủng Swiss tuần tuổi, có khối lợng 20 g Chuột đợc cung cấp Viện Pasteur, thành phố Hồ Chí Minh Phơng pháp a Gây siêu no n thu trứng Chuột đợc tiêm PMSG (Organon) 10 IU/con Sau 48 tiếng chuột đợc tiªm hCG (Organon) 10 IU/con Sau 14 tiÕng, trøng chÝn đợc thu từ ống dẫn trứng đợc chuẩn bị PBS/PVA 0,1% b Xư lý Mitomycin C, ho¹t hãa trinh sản nuôi trứng Trứng sau đợc thu nhận đợc xử lí với Mitomycin C (Sigma) nồng độ 10 àg/ml 0,5, 1, nồng độ 10, 20, 30, 40, 50 àg/ml để khảo sát ảnh hởng nồng độ thời gian xử lý Mitomycin C phát triển phôi trinh sản Sau đó, trứng đợc hoạt hóa trinh sản môi trờng KSOM chứa ethanol 7% vòng phút Để ức chế sự hình thành thoi vô sắc, trứng sau hoạt hóa đợc nuôi môi trờng KSOM chứa Cytochalasin B (5 àg/ml) 89 vòng tiếng Tiếp theo trứng đợc nuôi môi trờng KSOM đánh giá phát triển giai đoạn khác c Nhuộm DAPI (4'-6-Diamidino-2phenylindole) (Molecular Probes) Phôi chuột trinh sản đợc cố định dung dịch PBS chứa paraformaldehyade 4% vòng 30 phút, sau đợc ủ với dung dịch PBS/PVA (0,1%) chứa Trixton X100 0,1% qua đêm, phôi đợc rửa lần với dung dịch PBS/PVA (0,1%) lần 10 phút Sau đó, phôi đợc nhuộm với DAPI (2 àg/ml) 30 phút Sau phôi đợc rửa lần PBS/PVA (0,1%) lần 10 phút Phôi đợc cố định quan sát phổ cho DAPI (Olympus) d Nhuộm AO-PI (Acridine Orange-Propidium Iodide) Phôi đợc nhuộm với thuốc nhuém Acridine Orange (Sigma) 100 µg/ml vµ Propidium Iodine (Sigma) 100 àg/ml để xác định phân mảnh tế bào chất phân mảnh nhân Phôi đợc quan sát phổ cho PI AO (Olympus) e Xử lý thống kê Số liệu thu đợc từ lô thí nghiệm đợc phân tích One way Anova theo Tukeys multiple range test Giá trị P nhỏ 0,05 đợc đánh giá có ý nghĩa thống kê II KếT QUả Và BàN LUậN ảnh hởng thời gian xử lý MC lên phân chia phôi trinh sản Sự phát triển in vitro phôi từ trứng hoạt hoá trinh sản đợc xử lý với Mitomycin C 10 àg/ml thời gian 0,5, 1, giảm (bảng 1).Tỉ lệ phôi phân chia lô thí nghiệm nh (52,38%; 52,54%; 68,33%) Lô xử lí có tỉ lệ phát triển phôi tế bào lô đối chứng (68,33% so với 74,19%) Tuy nhiên, trình phát triển phôi từ giai đoạn tế bào đến giai đoạn tế bào, số lợng phôi giảm mạnh, điều cho thấy Mitomycin C làm cho phôi trinh sản giai đoạn tế bào bị ức chế phát triển mạnh (hình 1.B, 1.E, 1.H) Tỷ lệ phôi bị ức chế phát triển tăng thêi gian xư lý trøng chÝn víi Mitomycin C cµng lâu Tỷ lệ phôi dâu hình thành lô thí nghiệm bị giảm mạnh Hầu hết phôi 90 phát triển đến giai đoạn phôi nang Tất phôi bị dừng phát triển giai đoạn phôi dâu (hình 1.C, 1.F, 1.I) Chúng không hình thành đợc khoang phôi (blastocoel) bị thoái hóa Trong đó, phôi trinh sản phát triển bình thờng đến giai đoạn phôi nang nhóm đối chứng (hình 1K, 1L, 1M) ảnh hởng nồng độ Mitomycin C lên phân chia phôi trinh sản Trong thí nghiệm khảo sát ảnh hởng thời gian xử lý Mitomycin C lên phát triển phôi trinh s¶n, thêi gian xư lý giê cho kÕt ức chế phát triển phôi cao nhất, nên kết đợc sử dụng việc đánh giá tác động nồng độ Mitomycin C lên phát triển in vitro phôi trinh sản Trứng chín đợc xử lí với Mitomycin C nồng độ khác sau đợc hoạt hoá trinh sản bị ức chế phát triển giai đoạn phôi tế bào (bảng 2) Tỉ lệ ức chế phát triển nồng độ 10, 20, 30, 40 àg/ml không khác mặt thống kê (P < 0,05) Nồng độ 50 àg/ml, Mitomycin C ức chế phát triển phôi trinh sản nhiều nhất, không qua phôi vợt qua trình ức chế phát triển phôi giai đoạn Không có phôi trinh sản phát triển đến giai đoạn phôi dâu nh phôi nang Kết cho thấy, trứng chuột bị xử lý Mitomycin C nồng độ 50 àg/ml làm phôi bị ức chế hoàn toàn trình phát triển phôi sau hoạt hóa Mitomycin C làm chậm trình phân chia tế bào phôi chuột trinh sản Mitomycin C không lảm giảm trình phát triển phôi chuột trinh sản, mà làm chậm trình phân chia tế bào phôi Bình thờng phôi chuột hoàn tất phân chia lần sau đợc hoạt hoá 24 [7] Tuy nhiên, trứng chín tất c¸c nhãm xư lý Mitomycin C theo thêi gian sau hoạt hoá thành phôi 48 để hoàn tất trình phân chia lần (Bảng 3) Điều cho thấy, Mitomycin C không ảnh hởng đến trình akyl hoá DNA phôi, mà làm chậm động lực phân chia tế bào phôi liên quan đến thoi vô sắc, ảnh hởng đến số protein trình phân bào Quá trình làm chậm phân chia diễn chủ yếu prometaphase metaphase II [5] Bảng Tác động thời gian lên phát triển in vitro phôi trinh sản Thời gian xử lí Số trứng hoạt Số phôi phát triển (giờ) hoá Phôi tế bào Phôi tế bào Phôi dâu (%) (%) (%) 0,5 63 33(52,38)a 19(30,15)a 14(22,22) 59 31(52,54)a 15(25,42)b 6(10,17) ab c 60 41(68,33) 5(8,33) 1(1,67) §èi chøng 62 46(74,19)b 44(70,96)d 43(69,35) Ghi chó: a, b, c, d kh¸c biƯt cã ý nghĩa thống kê (P 0,05) Phôi nang (%) 1(1,59) 0(0) 0(0) 34(54,84) Hình Sự phát triển phôi chuột trinh sản Phôi trinh sản thời điểm tế bào, tế bào giai đoạn phôi nang thời gian xử lý Mitomycin C 10 µg/ml 0,5 giê (A-C), 1,0 giê (D-F), 2,0 (G-I) K-M: phát triển phôi trinh sản không xử lý Mitomycin C (nhóm đối chứng) giai đoạn tế bào, tế bào phôi nang Quá trình làm giảm phát triển phôi giai đoạn tế bào (mũi tên trắng) giai đoạn phôi dâu (mũi tên đen) diễn tất lô thí nghiệm lô đối chứng Dấu trắng (C) cho thấy phôi nang lô phôi xử lý Mitomycin C 0,5 lô đối chứng (M) không xử lý Mitomycin C 91 Bảng Tác động nồng độ Mitomycin C lên phát triển in vitro phôi trinh sản Nồng độ Số trứng hoạt Số phôi phát triển Mitomycin C hoá Phôi tế bào Phôi tế bào Phôi dâu (%) Phôi nang (%) (%) (%) (àg/ml) a a 10 60 41(68,33) 5(8,33) 0 20 61 38(62,23)a 4(6,56)a 0 30 66 38(57,58)a 4(6,06)a 0 a a 40 78 59(75,64) 3(3,85) 0 50 91 31(34,07)b 0(0)b 0 Ghi chó: a, b: kh¸c biƯt cã ý nghÜa thèng kê (P 0,05) Sự phân ly bất thờng nhiễm sắc thể Những phôi đợc xử lý với Mitomycin C 10 àg/ml 0,5 cha vào trình apoptosis có trình phân chia nhiễm sắc thể bất thờng Trong trình phát triển thành phôi tế bào, nhiễm sắc thể trớc phân chia hình thành cấu trúc giống metaphase II, (hình 2A) Sự phân chia số lợng nhiễm sắc thể hai cực tế bào phôi không số nhiễm sắc thể không di chuyển hai cực tế bào (hình 2B, 2C) Điều cho thấy Mitomycin C không tác nhân akyl hoá DNA [11] mà akyl hoá protein Sự bất thờng phân ly nhiễm sắc thể nguyên nhân dẫn tới hầu hết phôi xử lý với Mitomycin C bị ức chế phát triển đợc đến giai đoạn phôi nang Mitomycin C cảm ứng apoptosis phôi trinh sản trình Các lô thí nghiệm có phôi biểu đặc điểm hình thái trình apoptosis nh tế bào chất phôi phân mảnh, nhân phân mảnh nhiễm sắc chất cô đặc lại, màng nhân biến phôi bắt màu Acrindine Orange Propodium Iodide trình apoptosis muộn [1] Phôi xử lý 10 àg/ml Mitomycin C 0,5 bị phân mảnh sau 48 tiếng hoạt hoá (hình 3A) Phơng pháp nhuộm AO-PI cho thấy phôi trình apoptosis, phần tế bào chất phôi phân mảnh bắt màu Acrindine orange Propidium Iodide (hình 3D) Để xác định biến đổi nhân trình apoptosis, phơng pháp nhuộm đơn DAPI đợc sử dụng để đánh hình thái nhân nhiễm sắc chất nhân [6] Phôi apoptosis lô xử lý với Mitomycin C 10 àg/ml 0,5 cho thấy nhiễm sắc chất cô đặc lại, nhân phân mảnh tách nhóm, màng nhân bắt đầu đứt g y (hình 3B) [4] Phôi apoptosis đợc xử lý với Mitomycin C 10 àg/ml cho thấy nhân phân mảnh nhiễm sắc chất đặc lại, màng nhân đứt g y hoàn toàn (mũi tên trắng), hình dạng nhân trở nên cong trình tách nhóm phần nhiễm sắc chất cô đặc (hình 3C) [4] Hiện tợng nhân phân mảnh diễn nhiều lô phôi đợc xử lý Mitomycin C vòng giờ, phôi xuất nhiều thể apoptosis (hình 3E) Bảng Mitomycin C làm chậm phân chia theo thời gian xử lý Số phôi phân chia Thời gian xư lý (2 tÕ bµo) Mitomycin C Sè trøng xư lý (giê) 24h 48h 0,5 63 32a 59 30a 60 40ab b §èi chøng 62 46 Ghi chó: a, b: kh¸c biƯt cã ý nghÜa thống kê (P 0,05) 92 Hình Sự bất thờng trình phân chia nhiểm sắc thể Cấu trúc giống metaphase II hình thành phôi xử lý Mitomycin C 10 àg/ml 0,5 (A) (vòng tròn trắng) Nhiễm sắc thể phân chia không đồng hai cực tế bào phôi (B, C) (vòng tròn trắng) Hình Phôi apoptosis nhuộm với DAPI AO-PI Tế bào chất phôi đợc xử lý Mitomycin C 10 àg/ml 0,5 phân mảnh sau 48 tiếng hoạt hoá (A) Mũi tên trắng (D) cho thấy tế bào chất phần phôi phân mảnh trình apoptosis Hình thái nhân phôi apoptosis lô xử lý Mytomicyn C 10 µg/ml 0,5, vµ giê có nhiễm sắc chất trình cô đặc nhân phân mảnh (mũi tên trắng) (B, C, E) Tế bào phôi có nhân bình thờng (mũi tên đen) bên cạnh tế bào chứa nhân phân mảnh (C) Hình thái nhân phôi nang trinh sản phát triển bình thờng ë l« kh«ng xư lý Mitomycin C (F) kh«ng cã phân mảnh hay nhiễm sắc chất cô đặc Điều ®ã cho thÊy, thêi gian xư lý trøng chÝn víi Mytomicin C lâu, trình apoptosis diễn mạnh, thể apoptosis xuất nhiều Trong đó, lô phôi trinh sản không sử lý với Mitomycin C phát triển bình thờng đến giai đoạn phôi nang (hình 3F), hình thái nhiễm sắc chất nhân bình thờng III KếT LUậN Mitomycin C làm chậm trình phân chia phôi chuột trinh sản Mitomycin C làm giảm trình phát triển in vitro phôi chuột trinh sản thông qua tác động gây apoptosis sai hỏng trình phân chia nhiễm sắc thể phôi chuột 93 TàI LIệU THAM KH¶O Antti Saraste, 1999: Morphologic criteria and detection of apoptosis Herz, Urban & Voge1 Crooks S T., Bradner W.T., 1976: Cancer Treat Rev., 3: 121:139 Danshiitsoodol N., de Pinho C A., Matoba Y., Kumagai T., Sugiyama M., 2006: J Molec Biol., 360(2): 398-408 Kerr J F R., Winterford C M., Harmon B V., 1994: Cancer, 73: 2013-2026 Marta Sikora-Polaczek, Anna Hupalowska, Zbigniew Polanski, Jacek Z Kubiak and Maria A Ciemerych, 2006: Biology of Reproduction, 74: 734-743 Steve M Nguyen, Christopher J Lieven and Leonard A Levin, 2006: J Neurosci Methods, 161(2): 281-284 Taesaeng Choi, Fugaku Aoki, Makoto Mori, Masakane Yamashita, Yoshitaka Nagahama and Kaoru Kohmoto, 1991: Development, 113: 789-795 Takizawa K., Yokoo I., Shima Y., Inou Y., Sato M., Iguchi T., Takeda Y., 1989: Nippon Sanka Fujinka Gakkai Zasshi, 41(6): 715-722 Tam P P., 1988: Teratology, 37(3): 205212 10 Tetsuji Nagao, Yoshiaki Saitoh, Shinsuke Yoshimura, 2000: Teratology, 61: 248-261 11 Tomasz, Maria, 1995: Chemistry and Biology, 2(9): 575-579 MITOMYCIN C INHIBITS MOUSE PARTHENOGENIC EMBRYO DEVELOPMENT IN PREIMPLANTATION STAGE Le Thanh Long, Nguyen Van Dam, Nguyen Thi Thuy Huyen, Nguyen Thi Thuong Huyen SUMMARY To investigate effects of Mitomycin C on mouse parthenogenic embryo in vitro development, we exmanined mouse parthenogenic in vitro development treated by Mitomycin C Matured oocytes collected from oviduct were treated in KSOM medium supplemented Mitomycin C 10 µg/ml for 0.5, 1, hours and KSOM medium supplemented Mitomycin C 10, 20, 30, 40 and 50 µg/ml for hours Results demonstrated that Mitomycin C degraded parthenogenic embryo in vitro development from all groups Most of embryos could not reach to blastocyst stage and prevented by first block on developing from 2-cell embryo stage to 4cell embryo stage 4-cell embryo development rates following Mitomycin C treatment times of 0.5, 1, hours were 30.15%, 25.42% and 8.33%, all of them were lower than control group (70.96%) 4-cell embryo development rates following Mitomycin C treatment concenstrations of 10 µg/ml (8.33%), 20 µg/ml (6.56%), 30 µg/ml (6.06), 40 µg/ml (3.85) and 50 µg/ml (0%) were very low, especially no embryo could reached to 4-cell embryo stage in 50 µg/ml group In the other hand, Mitomycin C elongated the time of cell division from one-cell embryo stage to 2-cell embryo stage All most Mitomycin C treated embryos divided into 2-cell embryo after 48 hours but in control group, parthenogenic embryo divided after 24 hours This result showed that Mitomycin C not only effects on DNA but also effects on some proteins concerning to cell division Blocked embryos showed apoptotic morphologies such as cytoplasm fragment, chromatin condensation and nucleus fragment Mitomycin C also produced abnormalities of chromosome division in embryos DAPI - stained embryos showed that number of dividing chromosome were not unequal in mitosis In control group, Mitomycin C - untreated mouse parthenogenic embryos could reach to blastocyst and had normal morphologies of cytoplasm and nucleus Thus, Mitomycin C degraded mouse parthenogenic in vitro development in preimplantation, produced abnormalities and drived embryos to apoptosis Key words: Apoptosis, embryo blocking, Mitomycin C, first cell division, nucleus fragment, cytoplasmic fragment, parthenogenesis Ngµy nhËn bµi: 3-10-2010 94 ... Mitomycin C c chế phát triển phôi trinh sản nhiều nhất, không qua phôi vợt qua trình c chế phát triển phôi giai đoạn Không c phôi trinh sản phát triển đến giai đoạn phôi dâu nh phôi nang Kết cho... trứng chuột bị xử lý Mitomycin C nồng độ 50 àg/ml làm phôi bị c chế hoàn toàn trình phát triển phôi sau hoạt hóa Mitomycin C làm chậm trình phân chia tế bào phôi chuột trinh sản Mitomycin C không... nhiễm s c chất nhân bình thờng III KếT LUậN Mitomycin C làm chậm trình phân chia phôi chuột trinh sản Mitomycin C làm giảm trình phát triển in vitro phôi chuột trinh sản thông qua t c động gây