Bài viết trình bày kết quả nghiên cứu về hoạt tính sinh học của các tiểu phân tách từ nọc rắn hổ đất miền Nam N. Kaouthia với mục đích tìm kiếm các hoạt tính mới để ứng dụng trong y dược.
31(2): 89-94 Tạp chí Sinh học 6-2009 Nghiên cứu thành phần nọc rắn hổ đất (Naja kaouthia) Nguyễn Hồng Thanh, Nguyễn kim tấn, Trơng Nam Hải Viện Công nghƯ sinh häc Hoµng Ngäc Anh ViƯn Khoa häc VËt liệu ứng dụng Rắn hổ mang (Cobra) phân bố nhiều địa phơng Việt Nam gồm ba giống khác [1]: Rắn hổ hai gọng kính Naja atra, gặp nhiều miền Bắc; rắn hổ mèo Naja sumatrana, gặp nhiều miền Đông Nam miền Trung; rắn hổ đất Naja kaouthia, gặp nhiều miền Tây Nam Trong số rắn hổ mang rắn hổ đất (N kaouthia) loại rắn độc, gây tử vong nhiỊu nhÊt cho ng−êi ë Nam bé ë ch©u á, rắn hổ đất phổ biến bắc ấn Độ (đông Delhi), Assam, Nepal, Bangladesh, Burma, Thái Lan, Bắc Malaya, Campuchia, miỊn Nam ViƯt Nam, nam Lµo, Trung Qc [2] Từ nọc rắn hổ đất châu (N kaouthia) ngời ta đ tách neurotoxin, muscarinic toxin cytotoxin [3, 4] Mặc dù việc nghiên cứu nọc rắn hổ đất (N kaouthia) đ đợc tiến hành nhiều nớc, nhng thành phần độc tố nọc rắn hổ đất Việt Nam cha đợc nghiên cứu, tiến hành nghiên cứu Tiếp theo nghiên cứu nọc rắn hổ mang miền Bắc N atra [5, 6], báo trình bày kết nghiên cứu hoạt tính sinh học tiểu phần tách từ nọc rắn hổ ®Êt miỊn Nam N kaouthia víi mơc ®Ých t×m kiÕm hoạt tính để ứng dụng y dợc I Phơng pháp nghiên cứu Nguyên liệu Nọc đợc thu từ rắn hổ đất (N kaouthia) nuôi trại rắn Đồng Tâm, Tiền Giang Thu nọc cách xoa bóp rắn tay, sau đem đông khô giữ 4oC đến dùng Máy FPLC h ng Amersham (Thụy Điển) máy HPLC h ng Shimazu (Nhật Bản) đợc sử dụng để phân tích nọc rắn Các hóa chất dùng phân tích đợc mua từ h ng Merck (Đức) Phơng pháp tách phân đoạn nọc rắn hổ đất (N kaouthia) a Tách phân đoạn nọc rắn N kaouthia Tách phân đoạn nọc rắn thô phơng pháp lọc qua gel máy FPLC (Amersham, Thụy Điển) với cột Sephacryl S100 (2,6 ì 60 cm) Cột sắc ký đ đợc cân đệm ammonium acetat 0,1 M (pH 6,2), lợng nọc thô chạy cột lần 50 mg, tốc độ rửa cột đạt 0,8 ml/phút Tách phân đoạn nọc rắn thô phơng pháp sắc ký lỏng cao áp tiến hành máy RP-HPLC (Shimazu, Nhật) với cột bán điều chế C18 (10 ì 250 mm; àm), tốc độ chạy cột ml/phút Cột sắc ký đợc chạy với gradient tuyến tính dung dịch sau: A 0,1% TFA nớc vµ B lµ 0,1% TFA 60% acetonitril n−íc Chơng trình chạy cột: 040% B phút 40-100% B 25 phút Lợng nọc thô đa lên cột lần mg b Khảo sát tính chất phân đoạn nọc rắn đ tách Độc tính phân đoạn tách đợc thử lên chuột C57BL/6 hai giống (18-20 g) cách tiêm bắp Tác dụng phân đoạn lên chuột đợc quan sát 24 Lợng prôtêin lần tiêm vào chuột nh đợc công bố báo [5] Tính kháng khuẩn phân đoạn tách đợc xác định vi khuẩn Gram(-) nh E coli, P aeruginosa, vµ vi khuÈn Gram(+) nh− B 89 subtilis, S aureeus Tính kháng nấm phân đoạn tách đợc xác định nấm mốc nh A niger, F oxysporum vµ nÊm men nh− C albicans, S cerevisiae Điện di đợc tiến hành gel polyacrylamid 12% 14% theo Laemmli [7] II Kết thảo luận Tách phân đoạn nọc rắn hổ đất (N kaouthia) Cho đến đ có số nghiên cứu chế tạo huyết kháng nọc rắn hổ đất Việt Nam [8, 9], cha có nghiên cứu tách khảo sát tính chất nơ-rô-tốcxin từ nọc rắn Vì vậy, mục tiêu nghiên cứu tách khảo sát thành phần nọc rắn hổ đất để mở rộng ứng dụng chúng y dợc Những nghiên cứu trớc cho thấy rằng: nọc rắn hổ gọng kÝnh (N atra) qua cét gel Sephacryl S-100 (2,6 × 60 cm) tách làm bảy phân đoạn khác [5] Sử dụng điều kiện nh để phân tích nọc rắn hổ đất (N kaothia) qua cột lọc gel thu đợc phân đoạn lớn Tiếp theo điện di nọc rắn hổ hai gọng kính (N atra) nọc rắn hổ đất (N kaouthia) Hình cho thấy thành phần nọc rắn hổ đất chứa chủ yếu thành phần có khối lợng phân tử thấp thành phần có khối lợng phân tử lớn lợng không đáng kể Kết khác với nọc rắn hổ hai gọng kính Nhận xét phù hợp với kết chạy cột lọc gel hai loại nọc Nh việc sử dụng cột lọc gel với điều kiện nh phân tích nọc rắn hổ hai gọng kính không phù hợp để phân tích thành phần nọc rắn hổ đất Mặt khác, sử dụng phơng pháp sắc ký lỏng cao áp để phân tích nọc rắn hổ đất cho thấy nọc thô tách làm phân đoạn khác hình Thử độc tính phân đoạn tách cho thấy sáu phân đoạn có độc tính Kết khảo sát sơ cho thấy phơng pháp sắc ký lỏng cao áp đảo pha cột bán điều chế C18 (10 ì 250 mm, àm) phù hợp với mục đích phân tích nọc rắn hổ đất (N kaouthia), đ chọn phơng pháp để phân tách phân đoạn nọc rắn hổ ®Êt kDa 116 66,2 45 35 25 18,4 14,4 Hình Kết điện di nọc thô hai giống rắn hổ mang gel polyacrylamid 14% näc r¾n hỉ hai gäng kÝnh; marker; nọc rắn hổ đất 90 Hình Sắc ký lỏng cao áp nọc rắn hổ đất Việt Nam (N kaouthia) cột C18 bán điều chế Nh vậy, nghiên cøu näc r¾n hỉ hai gäng kÝnh (N atra) [5, 6] đ tiến hành tách tốc-xin trực tiếp từ nọc rắn hổ đất (N kaouthia) phơng pháp sắc ký lỏng cao áp Thực tách tèc-xin trùc tiÕp tõ näc th«, bá b−íc läc qua gel với bớc đông khô kèm theo Vì tiết kiệm đợc thời gian, đồng thời giảm việc biến tính tốc-xin trình đông khô đỡ chất Bằng phơng pháp lợng nọc thô để tách tốc-xin cần (chỉ vài trăm miligram nọc thô tách đợc tốcxin sạch) [10] Khảo sát tính chất phân đoạn tách từ nọc rắn hổ đất (N kaouthia) Hình cho thấy nọc rắn hổ đất qua phơng pháp sắc ký lỏng cao áp cột C18 đ tách làm phân đoạn khác Thử độc tính phân đoạn tách chuột cho thấy sáu phân đoạn: 1, 2, 3, 4, có độc tính hai phân đoạn: không độc Trong phân đoạn độc kể độc phân đoạn 5, chuột bị liệt chết sau 15 phút; sau đến phân đoạn chuột bị co giật chết sau 30 phút; phân đoạn 1, độc hơn, chuột yếu chết sau từ 30 phút đến (bảng 1) Bảng Thử độc tính lên chuột phân đoạn tách từ nọc rắn hổ đất (N kaouthia) Số phân đoạn Quan sát chuột sau tiêm phân đoạn tách Nhận xét Chuột yếu chết sau 30 phút Độc gây chết Chuột yếu chết sau 30 phút Độc gây chÕt Cht co giËt vµ chÕt sau 30 Độc mạnh gây chết Chuột liệt, yếu chết sau 15 phút Độc mạnh gây chết Chuột liệt, yếu chết sau 15 phút Độc mạnh gây chết Chuột bình thờng sau tiêm Không độc Chuột yếu chết sau Độc gây chết Chuột bình thờng sau tiêm Không độc Để khảo sát thành phần prôtêin phân đoạn tách phơng pháp điện di cho thấy phân đoạn độc 4, chứa chủ yếu prôtêin nằm vùng 6-8 kDa tơng ứng với khối lợng phân tử nơ-rô-tốc-xin nọc rắn (hình 3) Trong phân đoạn độc hàm lợng prôtêin phân đoạn 1, 2, ít, điện di không hiện, nhng 91 điện di khác tăng hàm lợng phân đoạn lên 20 lần nhìn thấy đợc vết phân đoạn điện di, vết có khối lợng phân tử khoảng 13-14 kDa tơng đơng với khối lợng phân tử phospholipaza (kết không trình bày đây) Nh vậy, kết khảo sát cho thấy số phân đoạn có độc tính tách từ nọc rắn hổ đất phân đoạn 4, chứa nơ-rô-tốc-xin, vậy, sử dụng chúng để tách nơ-rôtốc-xin khảo sát tính chất chúng Tiếp theo đ khảo sát tính kháng khuẩn kháng nấm phân đoạn tách từ nọc rắn hổ đất (bảng 2) kDa 116 66,2 45 35 25 18,4 14,4 6,0 kDa 10 Hình Kết điện di phân đoạn tách từ nọc rắn hổ ®Êt (N kaouthia) näc th«; pic No 1; pic No 2; pic No 3; marker; pic No 4; pic No 5; pic No 6; pic No 7; 10 pic No Bảng Thử hoạt tính phân đoạn tách từ nọc rắn hổ đất (N kaouthia) vi khuẩn vµ nÊm mèc S aureus Asp niger F oxysporum C albicans S cerevisiae (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) NÊm men B subtilis Nång ®é øc chÕ tèi thiĨu ( MIC: µg/ml) Vi khn Gram(+) NÊm mèc P aeruginosa S TT E coli Vi khuÈn Gram(-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) Ghi chú: 1-8 phân đoạn tách HPLC 92 Kết thử tính kháng khuẩn kháng nấm phân đoạn tách từ nọc rắn hổ đất cho thấy khác với thành phần nọc răn hổ hai gọng kính, thành phần tách từ nọc rắn hổ đất hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm Nh phân đoạn tách từ nọc rắn hổ đất có độc tính với động vật độc tính các vi sinh vật kiểm định III Kết luận Bằng phơng pháp sắc ký lỏng cao áp nọc rắn hổ đất (N kaouthia) đợc phân tách thành tám phân đoạn prôtêin có tính chất khác Trong số phân đoạn tách có sáu phân đoạn có độc tính độc phân đoạn Các phân đoạn có khối lợng phân tử tơng đơng khối lợng phân tử nơ-rô-tốcxin nọc rắn chúng đợc sử dụng nghiên cứu để tách nơ-rô-tốc-xin Khảo sát tính kháng khuẩn kháng nấm phân đoạn tách từ nọc rắn hổ đất cho thấy chúng tính kháng vi sinh vật kiểm định Điều cho thấy nọc rắn hổ đất Miền Nam (N kaouthia) khác nọc rắn hổ hai gọng kính Miền Bắc (N atra) mà trớc đ khảo sát Tài liệu tham khảo Trần Kiên, Nguyễn Quốc Thắng, 1995: Các loài rắn độc Việt Nam Nxb Khoa học Kỹ thụât, Hà Nội Cox M J., 1995: Herpetological Review, 26(3): 156-157 Meng Q X et al., 2002: Com Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol., 132(1): 113121 Osipov A V et al., 2004: Eur J Biochem., 271: 2018-2027 Hoàng Ngọc Anh, Bùi Thanh Xuân, Trơng Nam Hải, 2006: Tạp chí Hóa học, 44(1): 57-61 Hoàng Ngọc Anh, Bùi Thanh Xuân, Đặng Trần Hoàng, Trơng Nam Hải, 2006: Tạp chí Hóa học, 44(4): 449-453 Laemmli U K., 1970: Nature, 227: 680-685 TrÞnh Xuân Kiếm, 1992: Tạp chí Dợc học, 1: 17-19 www.vnn.vn/khoahoc/2004/06/160399 10 Hoàng Ngọc Anh, Đặng Trần Hoàng, Trơng Nam Hải, Fournier A., 2006: Tạp chí Sinh học, 28(2): 44-49 Study components of vietnamese cobra venom naja kaouthia nguyen hong thanh, nguyen kim tan, Truong nam hai, Hoang ngoc anh Summary The cobra snakes are distributed in many regions of Vietnam They contain three species: Naja atra snakes are distributed in the North of Vietnam; Naja sumatra snakes are distributed in the central part of Vietnam and in the east of Cochin; Naja kaouthia snakes are distributed in the west of Cochin Among these cobra snakes the N kaouthia are most dangerous snakes for people in the Cochin The α-neurotoxins, muscarinic toxins and cytotoxins were isolated from snake venoms of Asian N kaouthia The compositions of snake venoms depend on their geographic distribution Until now the compositions of Vietnamese N kaouthia snake venom were not studied, so we carried out this work Venom was collected from N kaouthia snakes breeding in the snake camp in Dong Tam, Tien Giang Our analysis of N kaouthia snake venom showed the method RP-HPLC on a Supelcosil C18 column is better than method FPLC on a Sephacryl S-100 for this aim By method RP-HPLC on a Supelcosil C18 column the N kaouthia snake venom separed into eight fractions Toxicity assay on mice showed that six from isolated fractions are toxic (fractions: 1, 2, 3, 4, and 7) The method electrophoresis was used to study protein 93 compositions of isolated fractions and it showed that the toxic fractions 1, 2, have molecular mass in the range of 13-14 kDa, that similar to those of phospholipase In this time the most toxic fractions and have molecular mass in the range of 6-8 kDa, that similar to neurotoxins isolated from Thai cobra N kaothia These fractions will be used for further isolation of neurotoxins Study anti-bacterium and anti-fungus activities of isolated fractions showed they have no these activities This result showed the compositions of N kaouthia snake venom distributed in the South of Vietnam were very different from the compositions of N atra snake venom distributed in the North of Vietnam The compositions of N atra snake venom have anti-bacterium and anti-fungus activities Ngày nhËn bµi: 14-11-2007 94 ... tích nọc rắn hổ đất (N kaothia) qua cột lọc gel thu đợc phân đoạn lớn Tiếp theo điện di nọc rắn hổ hai gọng kính (N atra) nọc rắn hổ đất (N kaouthia) Hình cho thấy thành phần nọc rắn hổ đất chứa... đoạn tách từ nọc rắn hổ đất cho thấy khác với thành phần nọc răn hổ hai gọng kính, thành phần tách từ nọc rắn hổ đất hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm Nh phân đoạn tách từ nọc rắn hổ đất có độc tính... nọc rắn hổ đất (N kaouthia) Cho đến đ có số nghiên cứu chế tạo huyết kháng nọc rắn hổ đất Việt Nam [8, 9], cha có nghiên cứu tách khảo sát tính chất nơ-rô-tốcxin từ nọc rắn Vì vậy, mục tiêu nghiên