Expression of the recombinant single chain variable fragments recognizing blood antigen fused with thioredoxin in Escherichia Coli

The technology of recombinant single chain variable fragments (scFvs) expression has been used in research, diagnosis and treatment of diseases. In the previous study, we studied the expression of a recombinant single chain variable fragment recognizing blood A antigen (antiA-scFv) in E. coli. However, the protein was insoluble form resulting in difficulty for purification, refolding and activity assesment. Here, we present the study on fused expression of the recombinant scFv - specific blood A antigen with thioredoxin (Trx) in the expression vector pET32a(+). The results showed that the Trx/antiA-scFv fusion protein was expressed with molecular weight of 49 kDa in a soluble form reaching 40% of the total recombinant protein. This result facilitates the optimal condition of soluble protein expression, purification and bioactivity determination of the antiAscFv recombinant antibody.

TAP CHI SINH HOC 2019, 41(1): 45–52 DOI: 10.15625/0866-7160/v41n1.10924 EXPRESSION OF THE RECOMBINANT SINGLE CHAIN VARIABLE FRAGMENTS RECOGNIZING BLOOD ANTIGEN FUSED WITH THIOREDOXIN IN Escherichia coli Dang Thi Ngoc Ha, Le Thi Thu Hong*, Truong Nam Hai* Institute of Biotechnology, VAST, Vietnam Graduate University of Science and Technology, VAST, Vietnam Received December 2017, accepted February 2019 ABSTRACT The technology of recombinant single chain variable fragments (scFvs) expression has been used in research, diagnosis and treatment of diseases In the previous study, we studied the expression of a recombinant single chain variable fragment recognizing blood A antigen (antiA-scFv) in E coli However, the protein was insoluble form resulting in difficulty for purification, refolding and activity assesment Here, we present the study on fused expression of the recombinant scFv specific blood A antigen with thioredoxin (Trx) in the expression vector pET32a(+) The results showed that the Trx/antiA-scFv fusion protein was expressed with molecular weight of 49 kDa in a soluble form reaching 40% of the total recombinant protein This result facilitates the optimal condition of soluble protein expression, purification and bioactivity determination of the antiAscFv recombinant antibody Keywords: Escherichia coli, blood group A, single recombinant proteins, fusion expression, soluble protein, thioredoxin Citation: Dang Thi Ngoc Ha, Le Thi Thu Hong, Truong Nam Hai, 2019 Expression of the recombinant single chain variable fragments recognizing blood antigen fused with thioredoxin in Escherichia coli Tap chi Sinh hoc, 41(1): 45– 52 https://doi.org/10.15625/0866-7160/v41n1.10924 * Corresponding author email: lethuhong@ibt.ac.vn/tnhai@ibt.ac.vn ©2019 Vietnam Academy of Science and Technology (VAST) 45 TAP CHI SINH HOC 2019, 41(1): 45–52 DOI: 10.15625/0866-7160/v41n1.10924 BIỂU HIỆN DUNG HỢP GEN MÃ HÓA KHÁNG THỂ ĐƠN CHUỖI TÁI TỔ HỢP NHẬN BIẾT KHÁNG NGUYÊN NHÓM MÁU VỚI THIOREDOXIN TRONG TẾ BÀO Escherichia coli Đặng Thị Ngọc Hà, Lê Thị Thu Hồng*, Trƣơng Nam Hải* Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Học viện Khoa học Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Ngày nhận 1-12-2017, ngày chấp nhận 2-2-2019 TĨM TẮT Cơng nghệ biểu kháng thể đơn chuỗi tái tổ hợp (scFv) ứng dụng nghiên cứu, chẩn đoán điều trị bệnh Trong nghiên cứu trước, nghiên cứu biểu kháng thể đơn chuỗi nhận biết kháng nguyên nhóm máu A (antiA-scFv) tế bào Escherichia coli Tuy nhiên, phân tử kháng thể đơn chuỗi dạng đơn biểu khơng tan gây khó khăn cho q trình tinh sạch, tái cấu trúc đánh giá hoạt tính Trong nghiên cứu này, công bố kết nghiên cứu biểu kháng thể đơn chuỗi tái tổ hợp nhận biết kháng nguyên nhóm máu dạng tan dung hợp với thioredoxin vector biểu pET32a(+) Protein dung hợp Trx/antiA-scFv tổng hợp tế bào E coli với kích thước phân tử 49 kDa chiếm khoảng 40% dạng tan Kết tạo thuận lợi cho nghiên cứu tối ưu biểu dạng tan, thuận lợi cho tinh chế xác định hoạt tính antiA-scFv tái tổ hợp Từ khóa: Escherichia coli, biểu dung hợp, kháng thể đơn chuỗi tái tổ hợp, nhóm máu A, thioredoxin, protein tan *Địa liên hệ email: lethuhong@ibt.ac.vn/tnhai@ibt.ac.vn MỞ ĐẦU Sản xuất kháng thể theo công nghệ tế bào lai thu nhiều thành công ứng dụng nhiều lĩnh vực nghiên cứu, chẩn đoán điều trị bệnh bệnh tự miễn, nhiễm khuẩn bệnh ung thư Tuy nhi n, nhiều trư ng hợp, kháng nguy n tinh khiết khơng có s n để gây miễn dịch, đ c biệt kháng nguy n bề m t h y protein màng ây kháng nguy n dể cấu trúc tr nh tinh Ngoài r , công nghệ tế bào l i bộc lộ hạn chế chế dung hợp tế bào, không bền vững tế bào l i dùng để sản xuất kháng thể Hơn nữa, sản xuất kháng thể đơn dòng cơng nghệ tế bào lai có giá thành c o môi trư ng nuôi cấy tế bào động vật 46 giá c o, điều kiện nuôi cấy dự trữ tế bào nghiêm ng t Nh phát triển công nghệ sản xuất protein tái tổ hợp, n y phân đoạn kháng thể, kháng thể đơn chuỗi (scFv) tạo tế bào E coli (Ahmad et al., 2012, Spadiut et al., 2014) ây hệ biểu nghiên cứu kỹ đ c tính di truyền, thao tác đơn giản, có khả tổng hợp lượng lớn protein ngoại lai với điều kiện nuôi cấy đơn giản rẻ tiền Ngoài r , tr nh sản xuất, scFv cải biến di truyền để làm tăng số tính chất phân tử kháng thể làm tăng tính lực tính đ c hiệu (Song et al., 2014) Cho đến nay, kháng thể đơn chuỗi ứng dụng nhiều chẩn đoán (Ahmad et al., 2012) Bên cạnh đó, kháng thể đơn chuỗi Biểu dung hợp gen mã hóa kháng thể đơn chuỗi sử dụng cho mục đích điều chỉnh phát hoạt động protein tế bào, phù hợp cho việc sử dụng làm vaccine (Alvarez-Rueda et al., 2009) Ngồi ra, kháng thể đơn chuỗi ứng dụng điều trị ung thư (Chester et al., 2004) chống lại virus bệnh dại glycoprotein (Yuan et al., 2013) Tuy nhiên, bên cạnh thuận lợi, hệ biểu bộc lộ hạn chế nghi n cứu biểu scFv, phải kể đến h nh thành thể vùi củ phân tử kháng thể, tạo thành protein với hoạt tính li n kết thấp, cấu trúc không bền độc cho tế bào chủ Do đó, loại scFv cần nghiên cứu tìm kiếm thiết kế chủng biểu thích hợp Trong nghiên cứu trước, chúng tơi cơng bố kết biểu gen mã hóa kháng thể đơn chuỗi antiA-scFv vector biểu pET22b(+) Protein antiA-scFv tái tổ hợp tổng hợp tế bào E coli Tuy nhiên, antiA-scFv tồn dạng không tan ( ng Thị Ngọc Hà nnk., 2017) Trong báo này, công bố kết biểu gen dung hợp mã hóa kháng thể đơn chuỗi nhận biết kháng nguyên nhóm máu A với protein thioredoxin (Trx/antiA-scFv) Protein dung hợp biểu dạng tan, thuận lợi cho trình tinh xác định hoạt tính VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Chủng vi sinh vật Chủng vi khuẩn E coli DH10b (Invitrogen, Hoa Kỳ) sử dụng để tách dòng gen, chủng E coli JM109, BL21 (DE3), Rosseta (Invitrogen, Hoa Kỳ) sử dụng để biểu gen Plasmid pET22b+/antiA-scFv sử dụng để nhân dòng gen antiA-scFv; Plasmid pET32a+ (Novagen, Hoa Kỳ) vector biểu gen Kháng thể Kháng thể đơn dòng kháng C-myc từ huyết chuột (Sigma, Hoa Kỳ); kháng thể kháng IgG-peroxidase (Sigma, Hoa Kỳ) chuột C c rn mồ c o PC Mồi xuôi F - NcoI: 5’-TACCATGGC GCAGGTCCAAGTGCAGC-3’ Mồi ngược R - XhoI: 5’-TGCTCGAGTT ACAGGTCTTCTTCGC-3’ Hóa chất, enzyme Hóa chất, enzyme sử dụng cho nghiên cứu APS, TEMED, Chloroform, Ethidium brobmide, Glucose, Glycerol, Glycine, Isoamyl-alcohol, Ethanol, Methanol, Peptone, Yeast Extract, SDS, Tris, Acrylamid, Bis Acrylamide, Agar, Agarose, Coomassie (Merck, ức); KIT tinh DNA GFXTM (code 28-9034-70, GE Healthcare Life Science, Anh); dNTP, Taq DNA polymerase, Dnase I, T4 DNA – ligase, enzyme hạn chế (Fermentas, Hoa Kỳ); skimmilk hãng (Difco, Hoa Kỳ); kháng sinh Ampiciline, TMB hãng (Sigma, Hoa Kỳ) PCR khuếc đạ đoạn gen antiA-scFv Gen antiA-scFv nhân lên PCR từ vector pET22b+/antiA-scFv dung dịch với thành phần: 18 µl dH2O, 2,5 µl đệm 10ì2,5 àl dNTP mM, 0,5 àl mi xuụi F: NcoI 10 µM, 0,5 µl mồi ngược F: NcoI 10 µM, 0,5 µl khuôn pET22b+/antiA-scFv, 0,5 µl Taq polymerase Chương tr nh PCR: Biến tính 95oC: phút; l p lại 30 chu kỳ với bước: 94oC: 30 giây; 58oC: 30 giây; 72oC: 60 giây; bước kéo dài 72oC: 10 phút Thiết kế vector biểu pET32a+/antiAscFv Gen antiA-scFv s u nhân lên PCR cắt enzyme hạn chế XhoI NcoI ồng th i, vector pET32a+ cắt enzyme Sản phẩm gen vector tinh KIT gel củ Qi gen oạn gen antiA-scFv ghép nối với vector biểu pET32a+ enzyme T4 ligase Sản phẩm phản ứng ghép nối biến nạp vào tế bào E coli DH10b phương pháp sốc nhiệt trải tr n môi trư ng đĩ thạch LB có bổ sung 100 µg/ml ampicillin (LBA) (Sambrook & 47 Dang Thi Ngoc Ha et al W Russell, 2001) Các dòng biến nạp tách plasmid kiểm tra có m t gen antiA-scFv enzyme hạn chế XhoI, NcoI XbaI Vector biểu gen pET32/antiA-scFv chọn được biến nạp vào chủng biểu SDS-PAGE chuyển sang màng PVDF S u đó, màng ủ với Skimmilk 5% TBS 1x, kháng thể kháng C-myc, kháng thể antimouse IgGperoxidase gi Cuối phản ứng l i màu dung dịch TMB Biểu gen antiA-scFv KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Các chủng E coli BL21 (DE3), JM109, Thiết kế vector biểu pET32/antiARosetta mang vector biểu scFv pET32a(+)/antiA-scFv nuôi cấy Vector pET32a+ ngồi ưu điểm mơi trư ng LBAmp, ni lắc 200 vòng/phút o hệ vector pET chứa trình tự gen 37 C qu đ m S u đó, dịch tế bào ni qua mã hóa cho protein thioredoxin (Trx) đ m chuyển s ng môi trư ng LBA o trước vùng đ nối với trình tự mã hó với OD600 khoảng 0,1; nuôi tiếp 37 C, lắc His-tag, S-t g Khi gen gắn vào vùng đ 200 vòng/ phút đến OD600 đạt 0,3–0,5 nối vector, sản phẩm q trình dịch Dịch ni cấy cảm ứng với 0,1 mM mã protein dung hợp protein tái isopropyl β- D- thiogalactopyranoside (IPTG) tổ hợp gắn với protein Trx đoạn His(Studier et al., 1990) chuyển sang nuôi lắc o tag, S-tag vậy, thuận thiện cho việc tinh 200 vòng/ phút 20 C 16 gi Sau lên protein sau Ngồi ra, protein Trx có men, tế bào thu lại ly tâm 5000 chức việc khử gốc cysteine vòng/ phút phút hòa lại oxy hó , giúp làm giảm mật độ tế bào OD600 =10 đệm kết tụ protein dẫn đến làm tăng 20 mM Tris-HCl, pH = Kiểm tra biểu tính tan protein tái tổ tăng hợptính (Nakamura t n protein tái tổ hợp protein tái tổ hợp điện di SDS- kết tụ protein dẫn đến làm et etal., (Nakamura al.,1997) 1997) PAGE Western blot Tách chiết protein tái tổ hợp từ tế bào E coli a b Tế bào E coli tái tổ hợp sau lên men thu lại ly tâm 5000 vòng/phút phút Hòa lại tế bào đệm Tris HCl 20 mM, pH=8 để đư mẫu OD = 10 Dịch tế bào siêu âm 10 phút (3 giây/xung, nghỉ giây xung) với cư ng độ 85 Amp S u si u âm, mẫu ly tâm 8000 vòng/phút 10 phút để phân thành pha tan pha tủa Pha tủ hòa lại thể tích ể đư genHình antiA-scFv vào vectorkiểm biểu +, Kết tr pET32 gen antiA-scFv vàkhuếch đại đoạn gen từ plasmid pET22b+/antiA-scFv phẩm c p mồikhuếch đ c hiệu đại gen b n đầu đệm 20 mM Tris HCl, pH=8 vector pET32a+: a Sản Các mẫu tan tủ điện di kiểm tra antiA-scFv; b Sản phẩm cắt vector pET32a+ gel SDS-PAGE 12,6% (Laemmli, 1970) gen antiA-scFv enzyme hạn chế XhoI + NcoI ng chạy M: thang DNA chuẩn K ểm b ểu ện pro e n SDS1kb (Ferment s) ng chạy 1: Sản phẩm PAGE Western blot tinh gen antiA-scFv ng chạy 2, 3: iện di protein tr n gel SDS-PAGE Lần lượt sản phẩm cắt vector pET32a+, gen (Laemmli, 1970) thí nghiệm lai Western antiA-scFv enzyme hạn chế XhoI + NcoI blot theo phương pháp mô tả ( ng Thị Ngọc Hà nnk., 2017) Về bản, protein ể đư gen antiA-scFv vào vector biểu Trx/antiA-scFv tái tổ hợp đựợc nhận biết qua pET32 +, khuếch đại đoạn phản ứng lai Western blotting với kháng thể gen từ plasmid pET22b+/antiA-scFv kháng C-myc Protein s u điện di gel c p mồi đ c hiệu F-NcoI R-XhoI Sản 48 Biểu dung hợp gen mã hóa kháng thể đơn chuỗi phẩm khuếch đại gen antiA-scFv băng sắc nét có kích thước khoảng 882 bp (hình ) oạn gen antiA-scFv s u ghép nối với vector biểu pET32a+ ể gắn gen antiA-scFv vào vector biểu pET32a+ vector pET32a+ đoạn gen antiA-scFv xử lý enzyme hạn chế Xho I Nco I Sau xử lý enzyme hạn chế, tinh đoạn gen vector KIT tinh Qiagen (hình 1b) Kết kiểm tr sản phẩm cho thấy, sau tinh đoạn gen vector thu băng dùng để ghép nối với a b Hình Kiểm tr kết tạo pl smid tái tổ hợp pET32 +/ nti -scFv: a Kết tách dòng plasmid sản phẩm lai pET32a+ gen antiA-scFv; b Sản phẩm cắt kiểm tra plasmid enzyme hạn chế XhoI + NcoI XbaI ng chạy (-): pET32a+ không mang gen ng chạy 1, 2, 3, 4: plasmid tách từ dòng khuẩn lạc khác nh u ng chạy M: Thang DNA chuẩn Kb ng chạy 5, 6: sản phẩm cắt pET32a+/antiA-scFv enzyme XhoI + NcoI enzyme XbaI oạn gen antiA-scFv ghép nối vào vector pET32a+ Kết biến nạp sản phẩm lai cho thấy tr n đĩ LB xuất nhiều khuẩn lạc màu trắng đục, tròn bóng Lựa chọn số dòng khuẩn lạc để tách plasmid, điện di kiểm tra (hình 2a) Kết cho thấy tất mẫu pl smid tách từ dòng 1, 2, 3, c o dòng đối chứng pET32a+ khơng m ng gen Như vậy, có khả đoạn gen antiA-scFv chèn vào vector pET32a+ ể kết luận xác tạo vector tái tổ hợp pET32 +/ nti -scFv, chọn dòng pl smid để cắt kiểm tra enzyme hạn chế Xba I, Xho I Nco I Theo lý thuyết, vector pET32a+ có chứa điểm cắt enzyme Xba I, trình tự gen antiA-scFv khơng điểm cắt enzyme nên cắt pET32a+/antiA-scFv Xba I vector cắt mở vòng Ngồi r , tr n vector pET32 + có điểm cắt Xho I điểm cắt Nco I vị trí chèn gen antiA-scFv nên cắt hai enzyme tạo r đoạn gen có kích thước khoảng 884 nucleotide Kết điện di hình 2b cho thấy, cắt pl smid tái tổ hợp enzyme Xho I + Nco I, tr n đư ng chạy xuất băng DN có băng có kích thước khoảng 884 bp Trên đư ng chạy xuất băng có kích thước khoảng gần 7.000 bp, chứng tỏ plasmid cắt mở vòng Với kết kiểm tra trên, chúng tơi khẳng định gen antiA-scFv ch n vào vector pET32 + (được đ t t n pET32 +/ nti -scFv) Biểu protein dung hợp Trx/antiA-scFv Sau thiết kế vector biểu mang gen antiA-scFv biến nạp plasmid tái tổ hợp vào chủng biểu E coli BL21 (DE3), JM109, Rossetta Gen antiA-scFv plasmid tái tổ hợp hoạt động điều khiển promoter T7 Promoter kiểm soát ch t chẽ chất cảm ứng IPTG (Studier, 2005) Theo lý thuyết, protein Trx/antiA-scFv (dạng dung hợp với Trx biểu pET32a+) có kích thước khoảng 49 kDa Với điều kiện môi trư ng LBA, cảm ứng 0,1 mM IPTG OD600 đạt khoảng 0,4, s u ni cảm ứng 20oC, thu mẫu sau 16 gi nuôi cấy, kết biểu Trx/antiA-scFv chủng JM109 thể hình 3a cho thấy protein biểu tổng số dòng tái tổ hợp xuất băng protein đậm nét có kích thước dự đốn Trong đư ng chạy đối chứng âm mẫu biểu protein tổng số chứa vector không mang gen không xuất băng đậm nét có kích thước Bên cạnh đó, chúng tơi kiểm tra biểu antiA-scFv chủng BL21(DE3) 49 Dang Thi Ngoc Ha et al Rosett điều kiện JM109 Kết biểu Trx/antiA-scFv chủng BL21 (DE3) cho thấy protein Trx/antiA-scFv biểu Trong chủng Rosseta 2, Trx/antiA-scFv biểu tương đối tốt (kết không tr nh bày) Như vậy, chủng biểu đóng v i trò qu n trọng việc tăng suất protein tái tổ hợp mong muốn Kết phù hợp với kết luận Joseph et al (2015) ồng th i, a nhận thấy trình biểu dung hợp củ protein ngoại lai với yếu tố Trx, SUMO E coli giúp cải thiện đáng kể xuất protein Nhận định tương đồng với kết nghi n cứu biểu kháng thể đơn chuỗi nhận biết VEGF 165 dung hợp với SUMO (Ye et al., 2008) nghiên cứu biểu kháng thể đơn chuỗi dung hợp với thioredoxin tế bào chất E coli (Jurado et al., 2006) b M (-) TS c M TS ( -) kDa 116 66 45 35 25 18 14 Hình Kiểm tra biểu protein Trx/antiA-scFv chủng E coli: a SDS-PAGE, b Western blot với c-myc, c Kiểm tra mẫu protein pha tan không tan; ng chạy M: Thang protein chuẩn (Fermentas); (-): ối chứng âm, vector không mang gen; TS: Mẫu tổng số; S: Pha tan; P: Pha tủa ể khẳng định chắn protein protein tái tổ hợp mong muốn, việc xác định protein biểu qu băng điện di gel SDS-P GE tiến hành kiểm tra kỹ thuật lai miễn dịch Western blot Dựa thiết kế gen antiA-scFv có chứa vùng trình tự mã hó C-myc để hỗ trợ xác định biểu protein tái tổ hợp Các mẫu biểu protein tái tổ hợp dạng dung hợp Trx/antiA-scFv lai với kháng thể C-myc sản xuất từ chuột kháng thể hai kháng thể kháng IgG-peroxidase chuột Như vậy, có protein có C-myc bắt đ c hiệu với kháng thể C-myc xuất màng lai Kết Western blot hình 3b cho thấy, tr n đư ng chạy protein từ chủng tái tổ hợp có xuất băng protein có kích thước khoảng 49 kD ó vị trí băng tương 50 ứng protein dạng dung hợp Trx/antiAscFv Tr n đư ng chạy mẫu đối chứng âm không mang gen antiA-scFv không thấy băng xuất Như vậy, thiết kế biểu thành công protein antiA-scFv dạng dung hợp Trx vector pET32a+ Các protein thể hoạt tính tồn dạng tan Tuy nhiên, protein có nguồn gốc từ tế bào nhân chuẩn tổng hợp hệ biểu E coli thư ng tồn dạng không tan Trong nghiên cứu trước, chúng tơi kiểm tra tính tan protein antiA-scFv biểu dạng đơn chủng Rosetta2 JM109 Kết kiểm tra cho thấy, Trx/antiA-scFv biểu dạng đơn chủng Rosetta2 hồn tồn trạng thái khơng tan ( ng Thị Ngọc Hà nnk., 2017) Có thể biểu mức protein Biểu dung hợp gen mã hóa kháng thể đơn chuỗi chủng dẫn đến hình thành khơng cầu nối disulfide protein tái tổ hợp (Joseph et al., 2015) Ở đây, dựa vào mức độ đậm củ băng protein quan sát SDS-PAGE mẫu sau phân tách pha tan pha tủa cho thấy protein dung hợp Trx/antiA-scFv tái tổ hợp dạng tan chiếm tỷ lệ khoảng 40 tổng số Trx/antiA-scFv tạo (hình 3c) Kết sở cho nghiên cứu tối ưu biểu protein dạng tan Theo nghiên cứu, hạn chế trình biểu kháng thể tái tổ hợp E coli cấu trúc phân tử kháng thể có cầu nối disulfide Sự hình thành khơng cấu trúc disunfide dẫn đến biểu protein dạng thể vùi làm hoạt tính sinh học củ protein Trong đó, phân tử kháng thể cần q trình gấp xác hai cầu disunfide để thực chức li n kết kháng nguyên (Glockshuber et al., 1992) Vì vậy, biểu dung hợp Trx, MBP, GST… giúp cải thiện khả t n xuất protein ngoại lai sản xuất tế bào E coli (LaVallie & McCoy, 1995) Paola Jurado et al (2006) nghi n cứu cho thấy vai trò cải thiện khả t n kháng thể tái tổ hợp sản xuất tế bào chất E coli dung hợp Trx (Jurado et al., 2006) KẾT LUẬN Protein antiA-scFv thiết kế dung hợp Trx/antiA-scFv biểu thành công dạng tan chủng JM109 môi trư ng LBA, cảm ứng 0,1 mM IPTG OD600 đạt khoảng 0,4 nuôi cảm ứng 20oC, thu mẫu sau 16 gi nuôi cấy Kết sở cho nghiên cứu tối ưu biểu protein dung hợp cho tinh chế xác định hoạt tính kháng thể đơn chuỗi tái tổ hợp antiA-scFv Lời cảm ơn: Công trình hỗ trợ kinh phí củ đề tài cấp Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt N m “Nghi n cứu tạo kháng thể đơn chuỗi tái tổ hợp nhận biết đ c hiệu kháng nguy n nhóm máu”, mã số VAST02.03/15-16 trang thiết bị Phòng thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ Gen TÀI LIỆU THAM KHẢO Ahmad Z A., Yeap S K., Ali A M., Ho W Y., Alitheen N B M, Hamid M., 2012 ScFv antibody: Principles and clinical application Clin Dev Immunol., 2012: 1–15 Alvarez-Rueda N., Ladjemi M Z., Behar G., Corgnac S., Pugniere M., Roquet F., Bascoul-Mollevi C., Baty D., Pelegrin A., Navarro-Teulon I., 2009 A llama single domain anti-idiotypic antibody mimicking HER2 as a vaccine: Immunogenicity and efficacy Vaccine, 27(35): 4826–4833 Chester K., Pedley B., Tolner B., Violet J., Mayer A., Sharma S., Boxer G., Green A., Nagl S., Begent R., 2004 Engineering Antibodies for Clinical Applications in Cancer Tumor Biol., 25(1–2): 91–98 Glockshuber R., Schmidt T., Pluckthun A., 1992 The disulfide bonds in antibody variable domains: effects on stability, folding in vitro, and functional expression in Escherichia coli Biochemistry, 31(5): 1270–1279 ng Thị Ngọc Hà, Nguyễn Thị Trung, Lê Thị Thu Hồng, ỗ Thị Huyền, Trương Nam Hải, 2017 Nghiên cứu lựa chọn điều kiện biểu kháng thể đơn chuỗi tái tổ hợp nhận biết kháng nguyên nhóm máu A chủng Escherichia coli Tạp chí Sinh học, 39(2): 191–198 Joseph B C., Pichaimuthu S., Srimeenakshi S., 2015 An overview of the parameters for recombinant protein expression in Escherichia coli Cell Sci Ther., 6(5): 1–7 Jurado P., de Lorenzo V., Fernandez L A., 2006 Thioredoxin fusions increase folding of single chain Fv antibodies in the cytoplasm of Escherichia coli: evidence that chaperone activity is the prime effect of thioredoxin J Mol Biol., 357(1): 49–61 Laemmli U K., 1970 Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 Nature, 227: 680–685 51 Dang Thi Ngoc Ha et al LaVallie E R., McCoy J M., 1995 Gene fusion expression systems in Escherichia coli Curr Opin Biotechnol., 6(5): 501–506 Nakamura H., Nakamura K., Yodoi J., 1997 Redox regulation of cellular activation Annu Rev Immunol., 15: 351–369 Sambrook J., W Russell D., 2001 Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harb Lab Press Cold Spring Harb NY 999 Song H N., Jang J H., Kim Y W., Kim D H., Park S G., Lee M K., Paek S H., Woo E J., 2014 Refolded scFv antibody fragment against myoglobin shows rapid reaction kinetics Int J Mol Sci., 15(12): 23658–23671 Spadiut O., Capone S., Krainer F., Glieder A., Herwig C., 2014 Microbials for the production of monoclonal antibodies and antibody fragments Trends Biotechnol., 32(1): 54–60 52 Studier F W., 2005 Protein production by autoinduction in high-density shaking cultures Protein Expr Purif., 41(1): 207–234 Studier F W., Rosenberg A H., Dunn J J., Dubendorff J W., 1990 Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes Methods Enzymol., 185: 60–89 Ye T., Lin Z., Lei H., 2008 High-level expression and characterization of an antiVEGF165 single-chain variable fragment (scFv) by small ubiquitin-related modifier fusion in Escherichia coli Appl Microbiol Biotechnol., 81(2): 311–317 Yuan R., Chen X., Chen Y., Gu T., Xi H., Duan Y., Sun B., Yu X., Jiang C., Liu X., Wu C., Kong W., Wu Y., 2013 Preparation and diagnostic use of a novel recombinant single-chain antibody against rabies virus glycoprotein Appl Microbiol Biotechnol., 98(4): 1547–1555  ... coli Cell Sci Ther., 6(5): 1–7 Jurado P., de Lorenzo V., Fernandez L A., 2006 Thioredoxin fusions increase folding of single chain Fv antibodies in the cytoplasm of Escherichia coli: evidence... chủng Escherichia coli Tạp chí Sinh học, 39(2): 191–198 Joseph B C., Pichaimuthu S., Srimeenakshi S., 2015 An overview of the parameters for recombinant protein expression in Escherichia coli. .. that chaperone activity is the prime effect of thioredoxin J Mol Biol., 357(1): 49–61 Laemmli U K., 1970 Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 Nature,