Expression of microbial target genes in Escherichia coli is broadly used due to its advantages namely: well established system, easy to manipulate, a huge biomass, high level productivity, safe and inexpensive to grow. Metagenomic technique has been applying in Vietnam recently for effective mining of uncultured gene resources, especially in endemic mini-ecologies such as hot springs where the cell densities are low. DNA metagenome of Binh Chau hot spring was isolated and sequenced by Illumia HiseqTM. Based on analyses of databases of cellulase-encoded genes, denovogenes 18736 gene sequence for thermal endoglucanase was selected for expression in E. coli. In this paper, some factors for expression of endoglucanase have been investigated. The results show that appropriate gene expression conditions are: Expression performed in E. coli C43 (DE3) on TB medium at 30oC with 0.25 mM of IPTG as inducer, the culture volume of 20% compared with the bottle volume and the expression time is 42–48 hours. In this condition, the biomass production and soluble enzyme activity can reached up to 5.54–5.58 g /L and 1.92–1.98 U/mL, respectively. Our results show the prospect of exploiting microbial genes without culture.
TAP CHI SINH HOC 2019, 41(2): 111–118 DOI: 10.15625/0866-7160/v41n2.13726 THE EFFECT OF SOME FACTORS ON EXPRESSION OF GENE ENCODING ENDOGLUCANASE FROM DNA METAGENOME OF BINH CHAU HOT SPRING IN Escherichia coli Tran Thanh Thuy, Lai Thi Hong Nhung, Tran Dinh Man, Le Thi Thanh Xuan, Nguyen Kim Thoa* Institute of Biotechnology, VAST, Vietnam Received April 2019, accepted 28 May 2019 ABSTRACT Expression of microbial target genes in Escherichia coli is broadly used due to its advantages namely: well established system, easy to manipulate, a huge biomass, high level productivity, safe and inexpensive to grow Metagenomic technique has been applying in Vietnam recently for effective mining of uncultured gene resources, especially in endemic mini-ecologies such as hot springs where the cell densities are low DNA metagenome of Binh Chau hot spring was isolated and sequenced by Illumia HiseqTM Based on analyses of databases of cellulase-encoded genes, denovogenes 18736 gene sequence for thermal endoglucanase was selected for expression in E coli In this paper, some factors for expression of endoglucanase have been investigated The results show that appropriate gene expression conditions are: Expression performed in E coli C43 (DE3) on TB medium at 30oC with 0.25 mM of IPTG as inducer, the culture volume of 20% compared with the bottle volume and the expression time is 42–48 hours In this condition, the biomass production and soluble enzyme activity can reached up to 5.54–5.58 g /L and 1.92–1.98 U/mL, respectively Our results show the prospect of exploiting microbial genes without culture Keywords: Binh Chau hot spring, DNA-metagenomic, E coli C43(DE3), gene expression, recombinant endoglucanase, thermostable enzyme Citation: Tran Thanh Thuy, Lai Thi Hong Nhung, Tran Dinh Man, Le Thi Thanh Xuan, Nguyen Kim Thoa, 2019 The effect of some factors on expression of gene encoding endoglucanase from DNA metagenome of Binh Chau hot spring in Escherichia coli Tap chi Sinh hoc, 41(2): 111–118 https://doi.org/10.15625/0866-7160/v41n2.13726 * Corresponding author email: nkthoa@ibt.ac.vn ©2019 Vietnam Academy of Science and Technology (VAST) 111 TAP CHI SINH HOC 2019, 41(2): 111–118 DOI: 10.15625/0866-7160/v41n2.13726 MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN ẢNH HƯỞNG ĐẾN Q TRÌNH BIỂU HIỆN GEN MÃ HĨA ENDOGLUCANASE TỪ DNA METAGENOME CỦA SUỐI NƯỚC NĨNG BÌNH CHÂU TRONG Escherichia coli Trần Thanh Thủy, Lại Thị Hồng Nhung, Trần Đình Mấn, Lê Thị Thanh Xuân, Nguyễn Kim Thoa* Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, Việt Nam Ngày nhận 3-4-2019, ngày chấp nhận, ngày chấp nhận 28-5-2019 TÓM TẮT Quá trình biểu gen đích vi sinh vật tế bào Escherichia coli sử dụng rộng rãi nghiên cứu giới ưu điểm hệ thống lượng sinh khối lớn, tốc độ biểu lớn, điều kiện biểu tương đối đơn giản dễ kiểm soát Trong năm gần đây, kỹ thuật metagenomic áp dụng Việt Nam để khai thác hiệu nguồn gen vi sinh vật không thông qua nuôi cấy, đặc biệt khu hệ sinh thái nhỏ suối nước nóng nơi có mật độ vi sinh vật thấp Chúng tách chiết DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu, giải trình tự tồn DNA metagenome hệ thống Illumina HiseqTM để tiếp cận nguồn gen VSV hệ sinh thái Phân tích sở liệu gen mã hố cho cellulase, trình tự gen có mã số [denovogenes]_18736 mã hố cho endoglucanase bền nhiệt lựa chọn để biểu tế bào E coli Trong khuôn khổ báo này, số điều kiện để biểu endoglucanase khảo sát kết cho thấy điều kiện biểu gen thích hợp thực dòng E coli C43(DE3), thể tích dịch ni cấy chiếm 20% so với thể tích bình, nồng độ IPTG 0,25 mM, nhiệt độ 30oC, thời gian biểu 42–48 Sinh khối khô chủng E coli C43(DE3) tái tổ hợp đạt 5,54–5,58 g/L; endoglucanase tái tổ hợp dạng tan có hoạt độ đạt 1,92–1,98 U/mL Kết nghiên cứu cho thấy triển vọng khai thác gen vi sinh vật không thơng qua ni cấy Từ khóa: Biểu gen, DNA-Metagenomic, E coli C43(DE3), Endoglucanase tái tổ hợp, enzyme bền nhiệt, suối nước nóng Bình Châu *Địa liên hệ email: hautd@hnue.edu.vn MỞ ĐẦU Bản thân tế bào Escherichia coli coi nhà máy có thiết kế hồn chỉnh sử dụng rộng rãi hệ thống biểu protein tái tổ hợp Bởi vậy, có nhiều kỹ thuật phân tử phương pháp để nâng cao hiệu suất biểu protein dung hợp hệ thống vector biểu hiện, dòng tế bào kiến tạo định hướng nuôi cấy (Rosano & Ceccarelli, 2014) Khơng nghi ngờ trình sản xuất protein tái tổ hợp hệ thống tế bào vi sinh 112 vật bước tiến lớn ngành hoá sinh Ưu điểm việc sử dụng E coli làm vật chủ biết đến, bao gồm (i) Tốc độ sinh trưởng nhanh Khi nuôi môi trường chứa glucose muối, thời gian nhân đôi hệ khoảng 20 phút (Sezonov et al., 2007); (ii) Mật độ tế bào lớn Theo lý thuyết, mật độ tế bào đạt đến 200 g sinh khối khơ/L 1×1013 CFU/mL (Shiloach & Fass, 2005) Tuy nhiên, tăng trưởng theo cấp số nhân môi trường giàu dinh dưỡng không đạt đến mật độ theo lý thuyết Một số điều kiện ảnh hưởng Thông thường, mật độ đạt giới hạn < 1×1010 CFU/mL ni cấy môi trường LB 37oC (Sezonov et al., 2007); (iii) Thành phần môi trường nuôi cấy thường hóa chất sẵn có, khơng đắt tiền; (iv) Q trình biến nạp DNA ngoại lai vào tế bào thường nhanh hiệu Cho đến nay, kỹ thuật phương pháp nhằm tiếp tục nâng cao hiệu suất biểu protein dung hợp tế bào E coli ngày hoàn thiện, từ việc cải tiến plasmid mang vùng chép đa sao, vùng promoter mạnh, gắn đuôi lực để thuận tiện cho việc tinh chế protein đến việc lựa chọn dòng E coli phù hợp làm vật chủ cho trình biểu protein tái tổ hợp yếu tố ảnh hưởng đến q trình ni cấy nồng độ chất cảm ứng, độ thơng khí, nhiệt độ biểu hiện, thời gian biểu hiện,… (Rosano & Ceccarelli, 2014) Đối với loại protein tái tổ hợp có tập hợp điều kiện phù hợp cho hiệu suất biểu cao Endoglucanase (EC 3.2.1.4) enzyme quan trọng hệ enzyme thuỷ phân cellulose Quá trình thuỷ phân cellulose thường diễn thời gian dài điều kiện đặc biệt nhiệt độ, áp suất cao, môi trường kiềm axit Chính vậy, enzyme có tính chất bền nhiệt, chịu kiềm/axit trở thành đối tượng ưu tiên tìm kiếm khu hệ vi sinh vật Các enzyme bền nhiệt thường thu nhận từ vi sinh vật ưa nhiệt, có mặt vùng địa nhiệt (suối nước nóng, miệng núi lửa, giàn khoan dầu khí ) Suối nước nóng Bình Châu suối lộ thiên có nhiệt độ nóng thứ hai Việt Nam với nhiệt độ miệng giếng phun khoảng 82oC, bao quanh khu vực rừng tràm nguyên sinh, khu hệ sinh thái có nhiều tiềm để khai thác gen mã hoá cho enzyme bền nhiệt Cũng hệ sinh thái đặc biệt khác, mật độ vi sinh vật suối nước nóng Bình Châu thấp, để tiếp cận nguồn vật liệu di truyền quý giá này, kỹ thuật metagenomic xem lựa chọn tối ưu Từ công bố giới, nhiều gen mã hố cho endoglucanase tách dòng biểu kỹ thuật metagenomic Gần đây, nhóm nghiên cứu Gupta et al (2017) tách dòng biểu endoglucanase bền nhiệt kiềm tính từ suối nước nóng Puga Ladakh thông qua thư viện DNA metagenome Liew et al (2018) tách dòng trực tiếp gen mã hố cellulase chịu nhiệt cao có chiều dài 930 bp, mã hoá cho 309 axit amin từ DNA metagenome suối nước nóng Ulu Slim Nhóm tác giả biểu thành công E coli BL21(DE3) với hệ vector pET28a(+) Ở Việt Nam, nhóm nghiên cứu Trương Nam Hải biểu thành công endoglucanase từ DNA metagenome ruột mối Coptotermes gestroi tế bào E coli BL21 (Nguyễn Thị Thảo, 2015) Ngoài ra, endoglucanase bền nhiệt chủ yếu thu nhận thông qua chủng vi khuẩn phân lập từ suối nước nóng khác (Man et al., 2012, Nguyễn Kim Thoa nnk., 2015) Với mục tiêu thu nhận endoglucanase bền nhiệt mới, chúng tơi giải trình tự phân tích sở liệu DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu Trong số gen mã hố cho nhóm enzyme cellulase, trình tự gen mã số [denovogenes]_18736 có tiềm chịu nhiệt cao (Tm > 65oC) lựa chọn tổng hợp hố học Cơng ty Phusa Biochem (Việt Nam) Trình tự khuếch đại đưa vào hệ vector biểu pET17b (Novagen), biểu dạng protein tan tế bào E coli JM109(DE3) (dữ liệu không công bố) Tuy nhiên, lượng protein biểu ban đầu thấp nên việc tiếp tục nghiên cứu thay đổi số điều kiện nhằm nâng cao hiệu suất biểu cần thiết Bài báo trình bày trình khảo sát số yếu tố như: dòng tế bào E coli, độ thơng khí, nồng độ chất cảm ứng tác động đến hiệu suất biểu endoglucanase tái tổ hợp VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu sử dụng nghiên cứu bao gồm: Vector pET17b (Novagen) mang đoạn ORF trình tự gen [denovogenes]_18736; chủng E coli JM109(DE3) (Promega), chủng E coli C43(DE3) (Lucigen) Các hoá chất cần cho trình biểu hiện: IPTG, ampicillin, Bacto Tryptone, cao nấm men, cao thịt, K2HPO4, KH2PO4, NaCl, glycerol 113 Tran Thanh Thuy et al cung cấp cơng ty hố chất quốc tế, có độ tinh khiết cao Chuẩn bị tế bào khả biến Tế bào E coli khả biến chuẩn bị theo phương pháp mô tả Sambrook & Russell (2001) Biến nạp plasmid pET17b mang ORF trình tự gen [denovogenes]_18736 (pET17b_18736) vào tế bào E Coli Trộn plasmid pET17b_18736 (10–15 ng) vào tế bào E coli khả biến chuẩn bị trước chuyển vào cuvette nhựa có chiều rộng khe 0,1 cm (Peqlab) Cuvette giữ lạnh đá trước xung điện điện 1.800 V/cm, giây Tế bào hồi phục 37oC, lắc 200 rpm, môi trường SOC Dịch tế bào cấy trải môi trường LB + ampicillin thu khuẩn lạc riêng rẽ Các khuẩn lạc sử dụng để kiểm tra đoạn gen ngoại lai kỹ thuật PCR-colony Biểu endoglucanase tái tổ hợp Các chủng E coli có mang plasmid pET17b_18736 nhân giống môi trường LB lỏng + ampicillin 37oC, 200 rpm từ 16–18 Giống chuyển sang bình tam giác 500 mL có chứa 100 mL môi trường biểu + ampicillin (100 g/mL) với tỷ lệ 1% (v/v) Lắc bình điều kiện 200 rpm, 37oC OD600 dịch nuôi cấy đạt 0,6–0,8, bổ sung mM isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) trước hạ nhiệt độ xuống 30oC Tiếp tục ni lắc 200 rpm 48 Loại bỏ dịch nổi, thu tế bào ly tâm 10.000 rpm Bảo quản sinh khối -20oC Định tính endoglucanase Chuẩn bị đĩa petri CMC (1%) có đục lỗ đường kính 10 mm Nhỏ dịch enzyme (100 μL) vào lỗ Đặt đĩa 4oC để dịch enzyme khuếch tán vào thạch trước chuyển vào tủ ấm 55oC, 16–18 Hoạt tính endoglucanase đánh giá đường kính vòng phân giải sau nhuộm dung dịch Congo red Xác định hoạt độ endoglucanase Hoạt độ endoglucanase xác định theo phương pháp Ghose (1987) Lượng đường sinh định lượng dung dịch DNS theo phương pháp Miller (1959) Một đơn vị endoglucanase (U) định nghĩa lượng enzyme cần thiết xúc tác phân giải chất để giải phóng µM đường khử thời gian phút điều kiện nhiệt độ 55oC Ảnh hưởng yếu tố đến hiệu suất biểu endoglucanase Lựa chọn chủng chủ biểu Hai dòng tế bào E coli C43(DE3) (Lucigen) E coli JM109 (DE3) (Promega) sử dụng làm chủng chủ để biểu endoglucanase tái tổ hợp Plasmid pET17b_18736 biến nạp vào dòng tế bào khả biến phương pháp xung điện Các tế bào E coli tái tổ hợp nuôi cấy xác định khối lượng sinh khối hoạt tính enzyme dung hợp Xác định khối lượng sinh khối khô Sấy khô sinh khối 105oC đến khối lượng không đổi để xác định khối lượng sinh khối khô Lựa chọn môi trường biểu Chủng E coli C43(DE3) tái tổ hợp mang vector pET17b_18736 nhân giống môi trường LB trước chuyển sang biểu loại môi trường NB, LB TB Hiệu suất biểu đánh giá thơng qua khối lượng sinh khối hoạt tính enzyme dung hợp Thu nhận enzyme thô Sinh khối tươi rửa hòa lại vào dung dịch đệm phá tế bào (50 mM Tris/HCl, pH 8,5; mM EDTA; 100 mM NaCl; 0,1 mM DTE mM PMSF) Siêu âm phá tế bào Dịch enzyme thô thu nhận ly tâm 14.000 rpm Độ thống khí Giống khởi động chủng E coli C43(DE3) tái tổ hợp chuyển vào bình tam giác (thể tích 500 mL) chứa mơi trường TB với thể tích khác 50–300 mL (tương ứng 10–60% thể tích bình) Q trình biểu thực 30oC, 200 114 Một số điều kiện ảnh hưởng Nồng độ IPTG Nuôi cấy chủng E coli C43(DE3) tái tổ hợp môi trường TB OD600 đạt 0,6–0,8, bổ sung IPTG với nồng độ 0,25– 1,5 mM Hiệu suất biểu đánh giá thông qua khối lượng sinh khối hoạt tính enzyme dung hợp BL21(DE3) chỗ hạn chế tỷ lệ chết tế bào biểu mức protein dung hợp, đột biến hai điểm vùng -10 promoter lacUV5 Trong đó, dòng tế bào E coli JM109(DE3) chủng dùng chủ yếu chiến lược tách dòng gen Từ kết này, chủng E coli C43(DE3) tái tổ hợp chọn cho nghiên cứu Động thái sinh trưởng sinh endoglucanase Chủng E coli C43(DE3) tái tổ hợp ni bình tam giác (500 mL) có chứa 100 mL mơi trường TB Q trình biểu thực sau cảm ứng 0,25 mM IPTG, 30oC, 200 rpm Mẫu lấy sau 48 để xác định khối lượng sinh khối hoạt tính enzyme dung hợp 4 E c SKK (g/L KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Hình Khả phân giải CMC Hình 1.táiKhả CMC cảm Hình Ảnh chủng tổ hợp 1: phân E coligiải C43(DE3) ứng IPTG; 2: E coli C43(DE3) không cảm chủng tái tổ hợp 1: E coli C43(DE3) cảm trình sinh ứng IPTG; 3: E coli JM109 cảm ứng IPTG; E coli 2: JM109 không cảm ứng IPTG ứng4:IPTG; E coli C43(DE3) không cảm E coli JM109 không cảm ứng IPTG0.8 0.6 0.4 0.2 0 E coli JM109 SKK (g/L) E coli C43(DE3) Hoạt tính endoglucanase (U/mL) ứng IPTG; 3: E coli JM109 cảm ứng IPTG; 4: Sinh khối khô (g/L) Lựa chọn chủng chủ biểu endoglucanase tái tổ hợp Plasmid pET17b_18736 biến nạp vào hai dòng tế bào E coli C43(DE3) E coli JM109(DE3) để đánh giá mức độ biểu endoglucanase chủng chủ khác Sau 48 cảm2 ứng mM IPTG, khối lượng sinh khối khơ hoạt tính enzyme xác định cho thấy khả sinh trưởng hai chủng tái tổ hợp tương đương (khối lượng sinh khối khô chủng tái tổ hợp E coli C43(DE3) JM109(DE3) đạt 4,431g/L 4,36 g/L) nhưng4 hoạt tính endoglucanase chủng E coli C43(DE3) tái tổ hợp cao hơn, đạt 0,79 U/mL enzyme chủng E coli JM109(DE3) tái tổ hợp đạt có 0,56 U/mL (hình 1–2) Tất cácHình mẫu 1.đối (khơng ứng Khảchứng phân giảicảm CMC củavới IPTG) hoạt tính Như thấy, endoglucanase biểu chủng tái tổ hợp.tái1: tổE hợp coli C43(DE3) cảm dạng tan Chủng E coli C43(DE3) ứngMiroux IPTG; & 2: Walker E coli (1996) C43(DE3) phátkhông triển cảm từ quáứng trình sàng3:lọc chủng E.4: IPTG; E.các colibiến JM109 cảmcủa ứngdòng IPTG; coli BL21(DE3) để biểu vượt ngưỡng E colimàng JM109Ưu không cảmcủa ứng IPTG protein điểm dòng E coli C43(DE3) so với dòng gốc E coli Sinh khối khô (g/L) rpm 48 Hiệu suất biểu đánh giá thông qua khối lượng sinh khối hoạt tính enzyme dung hợp Hoạt tính endoglucanase (U/mL) Hình Ảnh hưởng chủng chủ lên Hình Ảnh chủng trìnhhưởng sinh trưởng biểuchủ hiệnlên endoglucanase tổ hợpbiểu trình sinh trưởng táivà endoglucanase tái tổ hợp Lựa chọn môi trường biểu endoglucanase tái tổ hợp Chủng E coli C43(DE3) tái tổ hợp mang vector pET17b_18736 nuôi môi trường NB, LB TB để biểu 115 endoglucana Tran Thanh Thuy et al endoglucanase Sau 48 biểu 30oC, môi trường TB môi trường cho sinh trưởng biểu hoạt tính enzyme tốt (đạt 4,42 g/L 0,79 U/mL), sau môi trường LB cuối môi trường NB (hình 3) Mơi trường NB LB mơi trường sử dụng phổ biến để nuôi cấy E coli chứa thành phần dinh dưỡng dễ hấp thụ giai đoạn tăng sinh sớm Tuy nhiên, môi trường lựa chọn tốt để biểu protein dung hợp chứa carbohydrate ion kim loại hóa trị II (Sezonov et al., 2007) Trong đó, thành phần mơi trường TB có hàm lượng cao nấm men gấp đơi so với thành phần mơi trường LB NB, nuôi cấy E coli môi trường TB cho mật độ tế bào cao (Studier, 2005) Mặt khác, chủng E coli tái tổ hợp biểu protein dung hợp cần lượng phosphate lớn, điều có mơi trường TB đáp ứng Hơn nữa, mơi trường TB có chứa glycerol đóng vai trò cảm ứng biểu protein điều khiển lac promoter (Studier, 2014) cách tăng tốc độ lắc giảm thể tích dịch ni bình Trong nghiên cứu này, khảo sát ảnh hưởng thể tích dịch ni loại bình tam giác (500 mL) Kết nghiên cứu hình cho thấy: thể tích dịch ni cấy có ảnh hưởng đến q trình sinh trưởng biểu enzyme dung hợp Mật độ tế bào chủng tái tổ hợp tỉ lệ nghịch với thể tích ni cấy Trong điều kiện khảo sát, mật độ tế bào đạt cao (6,42 g/L) thể tích ni cấy chiếm 10% thể tích bình giảm dần tăng thể tích dịch ni cấy Trong đó, hoạt tính endoglucanase tái tổ hợp cao bình chứa thể tích dịch ni chiếm 20% (hoạt tính đạt 1,87 U/mL) Kết nghiên cứu phù hợp với cơng bố Rosano & Ceccarelli (2014), tỷ lệ 20% lựa chọn tỷ lệ thơng khí thích hợp cho biểu enzyme dung hợp Hình Ảnh hưởng độ thống khí lên sinh trưởng sinh hoạt tính endoglucanase chủng E coli C43(DE3) tái tổ hợp Hình Ảnh hưởng mơi trường ni cấy lên sinh trưởng sinh hoạt tính endoglucanase chủng E coli C43(DE3) tái tổ hợp Ảnh hưởng độ thống khí đến biểu endoglucanase tái tổ hợp E coli vi khuẩn hiếu khí, vậy, lượng oxy hồ tan mơi trường ni cấy yếu tố quan trọng, có ảnh hưởng rõ rệt đến sinh trưởng (O'Beirne & Hamer, 2000, Losen et al., 2004) Để nâng cao hàm lượng sinh khối tế bào hoạt tính enzyme dung hợp, người ta điều chỉnh số oxy hoà tan 116 Ảnh hưởng nồng độ IPTG đến biểu endoglucanase tái tổ hợp IPTG chất cảm ứng cho T7-promoter hầu hết vector biểu thuộc hệ thống pET Trong nghiên cứu này, khảo sát ảnh hưởng nồng độ IPTG từ 0,25 –1,5 mM lên trình biểu endoglucanase tái tổ hợp Kết thu cho thấy nồng độ IPTG 0,25 mM, chủng E coli C43(DE3) tái tổ hợp biểu endoglucanase cao nhất, đạt 1,93 U/mL (hình 5), tương tự với cơng bố Aftab cộng (2012) thu nhận endoglucanase tái tổ hợp cao 1,5 U/mL cảm ứng IPTG nồng độ 0,3–0,4 mM Một số điều kiện ảnh hưởng trình biểu endoglucanase chủng E coli C43(DE3) tái tổ hợp Enzyme dung hợp biểu tốt mơi trường TB với thể tích dịch ni cấy chiếm 20% so với thể tích bình, nồng độ IPTG cảm ứng 0,25 mM Hoạt tính enzyme đạt 1,92–1,98 U/mL sau 42–48 với mật độ sinh khối khơ đạt 5,54–5,58 g/L Hình Ảnh hưởng nồng độ IPTG cảm ứng lên sinh trưởng biểu endoglucanase_18736 chủng tái tổ hợp Động thái sinh trưởng biểu endoglucanase dung hợp chủng E coli C43(DE3) tái tổ hợp Dưới điều kiện nuôi cấy lựa chọn trên, trình sinh trưởng biểu endoglucanase tái tổ hợp chủng E coli C43(DE3) mang plasmid pET17b_18736 vào pha cân sau 42–48 nuôi cấy, phù hợp với điều kiện sinh lý vi khuẩn nói chung lồi E coli nói riêng (Ryan et al., 1996) Trong khoảng thời gian này, sinh khối khô đạt giá trị dao động khoảng 5,54–5,58 g/L; sinh tổng hợp endoglucanase đạt 1,92– 1,98 U/mL (hình 6) Hình Động thái sinh trưởng sinh endoglucanase chủng E coli C43(DE3) tái tổ hợp KẾT LUẬN Endoglucanase tái tổ hợp biểu tốt dòng E coli C43(DE3) Đã xác định số yếu tố ảnh hưởng đến Lời cảm ơn: Cơng trình thực với hỗ trợ kinh phí đề tài “Nghiên cứu metagenome số hệ sinh thái mini tiềm nhằm khai thác gen mã hóa hệ enzyme chuyển hóa hiệu lignocellulose”, mã số ĐTĐLCN.15/14, Bộ Khoa học Công nghệ TÀI LIỆU THAM KHẢO Aftab S., Aftab N., Javed M M., 2012 Cloning and expression of endo-1,4–βglucanase gene from Bacillus licheniformis ATCC 14580 into Escherichia coli BL21 (DE 3) African Journal of Biotechnology, 11(12): 2846–2854 Ghose T K., 1987 Measurement of cellulase activities Pure and Applied Chemistry, 59(2): 257 Gupta P., Mishra A K., Vakhlu J., 2017 Cloning and characterization of thermoalkalistable and surfactant stable endoglucanase from Puga hot spring metagenome of Ladakh (J&K) Int J Biol Macromol., 103: 870–877 Liew K., Lim C., Chan C., Wei K., Salleh M., Sani R., Chan K.-G., Goh K., 2018 Chapter 16 - Direct Cellulase Gene Amplification From Hot Spring Using the Guidance of 16S rRNA Amplicon Metagenomics A2 Nagarajan, Muniyandi Metagenomics Academic Press: 309–325 Losen M., Frolich B., Pohl M., Buchs J., 2004 Effect of oxygen limitation and medium composition on Escherichia coli fermentation in shake-flask cultures Biotechnol Prog., 20(4): 1062–1068 Man T D., Thoa N K., Da N T., Viet N Q., 2012 Biologycal characteristics and classification of the thermophilic bacteria 117 Tran Thanh Thuy et al BML07 strain producing both thermostable amylase and cellulase isolated from MY LAM hot spring Vietnam Journal of Science and Technology, 50(3): 275–283 Miller G L., 1959 Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of Reducing Sugar Analytical Chemistry, 31(3): 426–428 Miroux B., Walker J E., 1996 Overproduction of proteins in Escherichia coli: Mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels Journal of Molecular Biology, 260(3): 289–298 Nguyễn Kim Thoa, Trần Thanh Thủy, Trần Thị Hoa, Mấn T Đ., 2015 Tiềm thu nhận enzyme bền nhiệt từ nhóm vi khuẩn phân lập suối nước nóng Bình Châu Báo cáo Khoa học Sinh thái Tài nguyên sinh vật Hội nghị Khoa học toàn quốc Sinh thái Tài nguyên sinh vật lần thứ 6, 1234–1238 Nguyễn Thị Thảo, 2015 Nghiên cứu gen mã hóa enzyme tham gia thủy phân cellulose từ khu hệ vi khuẩn ruột mối kỹ thuật Metagenomics Luận án Tiến sĩ, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội O'Beirne D., Hamer G., 2000 Oxygen availability and the growth of Escherichia coli W3110: A problem exacerbated by 118 scale-up Bioprocess Engineering, 23(5): 487–494 Rosano G L., Ceccarelli E A., 2014 Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges Frontiers in microbiology, 5: 172–172 Ryan W., Collier P., Loredo L., Pope J., Sachdev R., 1996 Growth kinetics of Escherichia coli and expression of a recombinant protein and its isoforms under heat shock conditions Biotechnol Prog., 12(5): 596–601 Sambrook J., Russell D W., 2001 Transformation of E coli by electroporation In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd ed Cold Spring Harbor, NY, USA: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1119–1122 Sezonov G., Joseleau-Petit D., D'Ari R., 2007 Escherichia coli physiology in LuriaBertani broth J Bacteriol., 189(23): 8746–8749 Shiloach J., Fass R., 2005 Growing E coli to high cell density a historical perspective on method development Biotechnol Adv., 23(5): 345–357 Studier F W., 2005 Protein production by autoinduction in high density shaking cultures Protein Expr Purif., 41(1): 207–234 Studier F W., 2014 Stable expression clones and auto-induction for protein production in E coli Methods Mol Biol., 1091: 17–32 ... classification of the thermophilic bacteria 117 Tran Thanh Thuy et al BML07 strain producing both thermostable amylase and cellulase isolated from MY LAM hot spring Vietnam Journal of Science... 1959 Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of Reducing Sugar Analytical Chemistry, 31(3): 426–428 Miroux B., Walker J E., 1996 Overproduction of proteins in Escherichia coli: Mutant... and the growth of Escherichia coli W3110: A problem exacerbated by 118 scale-up Bioprocess Engineering, 23(5): 487–494 Rosano G L., Ceccarelli E A., 2014 Recombinant protein expression in Escherichia