Khi được nuôi cấy trên các môi trường thạch khác nhau, kết quả cho thấy môi trường Gamborg’B5 thích hợp để nuôi cấy bảo quản các dòng rễ tơ từ hai giống VIN002 và VIN005 trong khi môi trường White thích hợp hơn để bảo quản các dòng rễ tơ từ hai giống VIN072 và VIN077. Tất cả các dòng rễ cần phải được bảo quản trong tối ở 25–27 o C.
SCIENCE & TECHNOLOGY DEVELOPMENT JOURNAL: NATURAL SCIENCE, VOL 1, ISSUE 6, 2017 Nghiên cứu bước đầu nuôi cấy bảo quản dòng rễ tơ từ Dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G Don) cảm ứng Agrobacterium rhizogenes phân lập Việt Nam Nguyễn Như Nhứt Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM CN Công ty TNHH Gia Tường tỉnh Bình Dương Bùi Văn Lệ Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM Email: nhunhutnguyen@yahoo.co.uk (Bài nhận ngày 03 tháng 04 năm 2017, nhận đăng ngày 16 tháng 05 năm 2017) TÓM TẮT để bảo quản dòng rễ tơ từ hai giống VIN072 Rễ tơ Dừa cạn thu từ việc chuyển VIN077 Tất dòng rễ cần phải bảo gene nhờ Agrobacterium rhizogenes ứng quản tối 25–27 oC Ở điều kiện bảo quản dụng nhiều nghiên cứu đời sống Do đó, thích hợp, tỷ lệ số dòng rễ từ giống VIN002, phương pháp bảo quản dòng rễ có giá trị VIN005, VIN072 VIN077 phát triển ổn định đạt quan tâm nghiên cứu Khi nuôi cấy 69,3; 67,0; 57,3 60,7 % Trong đó, mơi trường thạch khác nhau, kết cho thấy có 90,0; 93,3; 80,0 93,3 % bảo tồn môi trường Gamborg’B5 thích hợp để ni cấy gene rolB, gene quan trọng ảnh hưởng bảo quản dòng rễ tơ từ hai giống VIN002 lên tăng trưởng rễ tơ VIN005 mơi trường White thích hợp Từ khóa: Agrobacterium rhizogenes, bảo quản, cảm ứng, Dừa cạn, rễ tơ MỞ ĐẦU Rễ tơ sản phẩm trình chuyển gene từ plasmid Agrobacterium rhizogenes vào tế bào thực vật [18] từ lâu sử dụng công cụ để sản xuất hợp chất thứ cấp [5] Trong đó, rễ tơ từ Dừa cạn quan tâm nghiên cứu chúng có khả tổng hợp nhiều hợp chất thứ cấp có giá trị [14] Đáng kể hợp chất có tác dụng chữa trị ung thư người vinblastine vincristine [10] Ngày nay, rễ tơ Dừa cạn ngày quan tâm nhờ khả tổng hợp hợp chất khơng có bình thường lanast-5,8-dien-3βol-27-oic acid-3β-D-glucopyranosyl (4'-1'')- Trang 86 10'',11''-dimethoxy anthracene 2-methoxy-6-(nnonacontan-5'',6''-dionyl)-11-hydroxy-13-methyl11β-D-rhamnopyranoside anthracene [8] Ngoài ra, nhiều hoạt tính sinh học khác phát cao chiết từ rễ tơ Dừa cạn kháng khuẩn, kháng nấm kháng oxy hóa [14] Đa số dòng rễ tơ nói chung ni cấy bảo quản môi trường thạch môi trường lỏng [20] Việc nuôi cấy bảo quản rễ môi trường lỏng thường tốn phức tạp thiết bị Bảo quản dạng phôi soma thành công cho số dòng rễ tơ từ vài lồi thực vật định Rễ tơ Dừa cạn bảo quản thông qua phôi soma [15] Tuy nhiên, điều kiện phục hồi để tái sinh lại ban đầu phức tạp với tỷ lệ thành TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ: CHUYÊN SAN KHOA HỌC TỰ NHIÊN, TẬP 1, SỚ 6, 2017 cơng thấp Do đó, nay, rễ tơ Dừa cạn bảo quản chủ yếu phương pháp cấy chuyền môi trường thạch môi trường lỏng Tuy nhiên, nghiên cứu nuôi cấy bảo quản rễ tơ mơi trường thạch hạn chế Trong nghiên cứu này, rễ tơ Dừa cạn nuôi cấy môi trường thạch điều kiện khác môi trường để nuôi cấy, ánh sáng nhiệt độ để chọn lọc điều kiện bảo quản thích hợp VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu Bốn nhóm dòng rễ tơ thu từ bốn giống Dừa cạn khác cảm ứng chủng A rhizogenes phân lập từ đất vùng rễ trồng Việt Nam Ba giống Dừa cạn VIN002, VIN005 VIN072 cảm ứng tạo rễ tơ chủng A rhizogenes C18 giống Dừa cạn VIN077 cảm ứng chủng A rhizogenes C26 Phương pháp Chuẩn bị dòng rễ Rễ tơ sau thu từ chuyển gene A rhizogenessẽ loại nhiễm cách ni cấy mơi trường có cefotaxime 500 mg/L Sau đó, rễ cắt tạo dòng theo định nghĩa dòng rễ Chilton cộng (1982) [7] Theo đó, dòng rễ rễ sơ cấp hình thành từ vị trí vết thương bị xâm nhiễm Việc cắt tạo dòng rễ tơ chiều dài rễ khoảng 2–3 cm Đánh giá ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy bảo quản Để đánh giá ảnh hưởng loại mơi trường khống bản, dòng rễ tơ khác có chiều dài 2–3 cm (có trọng lượng khoảng 0,1–0,2 g) cấy vào môi trường thạch đĩa petri [2] Các môi trường sử dụng gồm Gamborg’B5 (B5), Murashige Skoog (MS), Schenk Hildebrandt (SH) White (W) bốn mơi trường có thành phần khoáng bán đậm đặc (1/2B5, 1/2MS, 1/2SH 1/2W) Ủ đĩa nhiệt độ 25 oC tối Rễ cấy chuyền sang đĩa petri chứa môi trường tương tự sau 3–4 tuần Sự ảnh hưởng cường độ ánh sáng thực cách nuôi cấy dòng rễ tơ mơi trường khống thích hợp tương ứng cho bốn nhóm dòng rễ tơ từ bốn giống Dừa cạnđược chọn 25 oC Các đĩa ủ chế độ chiếu sáng liên tục với cường độ chiếu sáng thay đổi từ 500 đến 1000 lux Đối chứng ủ tối Rễ cấy chuyền sang đĩa petri chứa môi trường tương tự sau 3–4 tuần Để xác định nhiệt độ bảo quản, dòng rễ tơ từ bốn giống Dừa cạn ni cấy mơi trường khống điều kiện chiếu sáng thích hợp tương ứng chọn Nhiệt độ nuôi cấy điều chỉnh khoảng 8–10 oC, 18–20 oC, 25–27 o C 32–34 oC Rễ cấy chuyền sang đĩa petri chứa môi trường tương tự sau 3–4 tuần Mỗi nghiệm thức cấy 100 dòng rễ khác Thí nghiệm lặp lại lần thực tương tự cho bốn nhóm dòng rễ tơ thu từ bốn giống Dừa cạnVIN002, VIN005, VIN072 VIN077 Sau nuôi cấy tháng, dựa vào tỷ lệ số dòng rễ tơ phát triển tạo rễ HRd (Công thức 1) để chọn lọc điều kiện thích hợp cho ni cấy bảo quản rễ tơ [1, 20] HRd (%)= số dòng rễ phát triển bình thường Tổng số dòng rễ thí nghiệm x100 Công thức Đánh giá ổn định di truyền rễ tơ sau bảo quản Tiến hành ni cấy bảo quản dòng rễ tơ điều kiện thích hợp xác định cho nhóm dòng rễ tơ Sau 12 tháng ni cấy bảo quản, dòng rễ phát triển bình thường tách chiết DNA để xác định diện gene rolB gene Dựa vào kết phân tích để đánh giá ổn định rễ tơ Dừa cạn sau thời gian bảo quản Phân tích thực ngẫu nhiên 30 dòng rễ tơ cho nhóm rễ tơ từ bốn giống Dừa cạn Gene rolB xác định cách cắt lấy rễ tơ để xác định diện gene rolB (có nguồn gốc từ plasmid Ri vi khuẩn) cách khuếch Trang 87 SCIENCE & TECHNOLOGY DEVELOPMENT JOURNAL: NATURAL SCIENCE, VOL 1, ISSUE 6, 2017 đại trình tự với cặp mồi gene rolB 430 bp có trình tự 5’-GCTCTTGACGTGCTAGATTT-3’ 5’-GAAGGTGCAAGCTACCTCTC-3’ [9] Sử dụng cặp mồi gene virC 730 bp có trình tự 5’-ATC ATT TGT AGC GAC T-3’ 5’-AGC TCA AAC CTG CTT C-3’ [6] để dò diện A rhizogenes nhiễm rễ Chương trình khuếch đại biến tính DNA ban đầu phút 95 oC; sau 35 chu kỳ biến tính 30 giây 94 oC, bắt cặp 30 giây 54 oC kéo dài phút 72 oC; kết thúc trình với phút 72 oC Sản phẩm sau khuếch đại có kích thước 430 bp nhận diện cách điện di gel agarose 1% với đệm TAE 0,5X Phát gene gel cách ngâm dung dịch ethidium bromide quan sát đèn UV Kết điện di so sánh DNA rễ tơ, DNA rễ không chuyển gene từ in vitro, DNA plasmid Ri làm chứng dương dựa thang DNA chuẩn [18, 21] Xử lý số liệu Số liệu thu từ kết thí nghiệm xử lý thống kê phần mềm SPSS version 20 trình bày dạng số trung bình KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Ảnh hưởng mơi trường thạch Để chọn lọc môi trường nuôi cấy, bốn nhóm dòng rễ tơ từ bốn giống Dừa cạn VIN002, VIN005, VIN072 VIN077 nuôi cấy bốn loại môi trường thạch Gamborg’B5 (B5), Murashige Skoog (MS), Schenk Hildebrandt (SH) White (W) với nồng độ thành phần khoáng đậm đặc bán đậm đặc (1/2B5, 1/2MS, 1/2SH 1/2W) Sau thử nghiệm, kết phân tích thống kê cho thấy có ảnh hưởng khác biệt môi trường nuôi cấy khác lên khả phát triển nhóm dòng rễ tơ (Hình 1) Nhìn chung, mơi trường có thành phần khống đậm đặc cho tỷ lệ số dòng rễ tơ phát triển bình thường cao so với môi trường bán đậm đặc (Bảng 1) Với nhóm dòng rễ tơ từ giống VIN002 VIN005 mơi Trang 88 trường B5 thích hợp để ni cấy mơi truờng lại có tỷ lệ số dòng rễ phát triển bình thường cao đáng kể (68,7% 64,7% tương ứng) Trong đó, mơi trường W lại mơi trường thích hợp để ni cấy nhóm dòng rễ tơ giống VIN072 VIN077 với tỷ lệ số dòng rễ phát triển bình thường đạt 56,0% 55,3% tương ứng Trước đây, môi trường 1/2B5 [3] sử dụng để nuôi cấy bảo quản dòng rễ tơ Dừa cạn cảm ứng chủng A rhizogenes ATCC 15834 tỷ lệ rễ sống sót đạt 35 – 43% Trong đó, rễ tơ Coleus forskohlii Briq cảm ứng chủng A rhizogenes ATCC 15834 nuôi cấy bảo quản môi trường thạch MS [12] Qua cho thấy mơi trường khống thích hợp để ni cấy bảo quản dòng rễ tơ từ lồi thực vật khác khơng giống Dựa thành phần khoáng, diện sodium với magnesium hàm lượng cao môi trường B5 W cho thấy hai nhân tố có vai trò quan trọng cho tăng trưởng dòng rễ tơ từ Dừa cạn Ngoài ra, khác nguồn nitrogen môi trường B5 W so với MS SH có lẽ góp phần gây ảnh hưởng lên phát triển dòng rễ tơ Dừa cạn [13] Kết quan sát cho thấy tất loại mơi trường, dòng rễ khơng phát triển bình thường có xu hướng phát triển thành sẹo (Hình 2) sau hai tháng ni cấy Sự hình thành sẹo xuất vùng rễ non rễ già (Hình 3) Rất dòng rễ hóa gỗ sau thời gian cấy chuyền mơi trường thạch (Hình 4) Một số dòng rễ phát triển tạo sẹo tiếp tục hình thành chồi (Hình 5) phát triển thành sau Sự hình thành sẹo chồi nàyxảy khơng có bổ sung hormone tăng trưởng, trước đây, gọi hình thành sẹo tự phát chồi tự phát [5] Sự tạo sẹo tự phát môi trường thạch rễ tơ Dừa cạn báo cáo Brillanceau cộng (1989) [4], nhiên chưa có báo cáo hình thành chồi tự phát từ rễ tơ Dừa cạn Năm 1994, hình thành sẹo tự phát rễ tơ Dừa cạn Bhadra ghi nhận với tỷ lệ 57–65% tùy nhóm dòng rễ tơ từ bốn giống Dừa cạn khác [2] TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ: CHUYÊN SAN KHOA HỌC TỰ NHIÊN, TẬP 1, SỐ 6, 2017 Bảng Tỷ lệ dòng rễ tơ phát triển mơi trường khống khác Mơi trường thạch B5 1/2B5 MS 1/2MS SH 1/2SH W 1/2W HRd (%) VIN002 68,7a 58,3bc 59,3bc 62,7ab 58,0bc 47,7d 61,3bc 55,0c VIN005 64,7a 54,3c 60,3ab 57,0bc 47,0d 38,3e 57,0bc 46,7d VIN072 44,0cd 35,7e 52,3ab 50,0abc 43,3cd 38,0de 56,0a 47,3bc VIN077 44,7b 35,3c 47,7b 46,7b 32,3cd 28,3e 55,3a 49,0b Ghi chú: Các trị trung bình cột có chữ theo sau giống khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê p=0,05 cm B5 cm MS cm 1/2B5 cm SH cm 1/2MS cm White cm 1/2SH cm 1/2White Hình Minh họa phát triển rễ tơ giống VIN002 mơi trường khống khác sau tuần nuôi cấy VIN002 cm VIN005 cm VIN072 cm VIN077 cm Hình Minh họa phát triển sẹo rễ tơ từ giống Dừa cạn khác môi trường thạch 1/2MS sau tuần nuôi cấy Trang 89 SCIENCE & TECHNOLOGY DEVELOPMENT JOURNAL: NATURAL SCIENCE, VOL 1, ISSUE 6, 2017 cm cm Hình Minh họa hóa sẹo vùng rễ trưởng thành (phải) vùng rễ non (trái) rễ tơ từ giống VIN072 môi trường 1/2B5 sau tuần ni cấy cm Hình Minh họa hóa gỗ rễ tơ từ giống VIN072 môi trường thạch 1/2SH sau tuần nuôi cấy cm Hình Minh họa phát triển chồi rễ tơ giống VIN002 môi trường thạch 1/2MS sau tuần nuôi cấy Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng Điều kiện chiếu sáng có ảnh hưởng khác lên phát triển rễ tơ nói chung [2] Ánh sáng trắng có ảnh hưởng tốt lên tăng trưởng sinh khối rễ tơ từ câu đậu ma (Pueraria phaseoloides) [11] ánh sáng lại không ảnh hưởng đáng kể lên phát triển rễ tơ từ Plumbago zeylanica [16] Ở đây, phát triển rễ tơ từ bốn giống Dừa cạn bị ức chế ánh sáng trắng với cường độ khác Tỷ lệ số dòng rễ phát triển bình thường bị giảm rõ rệt rễ chiếu sáng liên tục so với nuôi cấy tối (Bảng 2) Ngoài ra, chiếu sáng cường độ khác nhau, tỷ lệ số dòng rễ tơ phát triển bình thường khác biệt khơng có ý nghĩa Bảng Tỷ lệ dòng rễ tơ phát triển môi trường thạch cường độ chiếu sáng khác Cường độ chiếu sáng (lux), 16 giờ/ngày 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 HRd (%) VIN002 69,0a 16,0b 13,0b 13,7b 15,0b 14,0b 10,3b 11,3b VIN005 64,0a 14,3b 10,0bcd 12,7b 11,3bc 12,0bc 7,3cd 5,7d VIN072 57,7a 12,7b 6,7bc 8,3bc 7,3bc 5,7c 6,0bc 7,3bc VIN077 59,0a 13,7b 10,0b 12,3b 12,7b 8,7b 12,0b 9,7b Ghi chú: Các trị trung bình cột có chữ theo sau giống khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê p=0,05 Trang 90 TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ: CHUYÊN SAN KHOA HỌC TỰ NHIÊN, TẬP 1, SỐ 6, 2017 Khi chiếu sáng, hầu hết dòng rễ tơ khơng phát triển bình thường phát triển thành sẹo tự phát Dưới ảnh hưởng ánh sáng trắng cường độ khác nhau, tỷ lệ số dòng rễ hình thành sẹo tự phát cao so với ảnh hưởng loại môi trường nuôi cấy (số liệu không trình bày đây) Vài trường hợp, ánh sáng trắng làm rễ tơ chuyển sang màu xanh (Hình 6) trước báo cáo Bhadra cộng (1998) [3] Ngoài ra, số trường hợp cho thấy chóp rễ bị thối hóa (cháy) chiếu sáng cường độ cao từ 2000 lux trở lên (Hình 7) Với dòng rễ thích nghi với ánh sáng, rễ phát triển với nhánh bên so với tối Cường độ ánh sáng cao rễ có nhánh bên (Hình 8) Trong đó, dòng rễ tơ thu từ cà phê gây nhiễm với chủng A rhizogenes A4RS phân nhánh nhiều nuôi cấy bảo quản môi trường thạch MS chiếu sáng với cường độ trung VIN002 bình so với điều kiện tối chiếu sáng cường độ cao [1] Sự khác cho thấy rễ tơ Dừa cạn thích nghi với ánh sáng Kết nghiên cứu góp phần cho thấy điều kiện chiếu sáng có ảnh hưởng không tốt lên phát triển rễ tơ Dừa cạn môi trường thạch nuôi cấy bảo quản rễ tơ từ bốn giống VIN002, VIN005, VIN072 VIN077 điều kiện tối thích hợp chiếu sáng với ánh sáng trắng cm Hình Minh họa chuyển màu xanh rễ tơ từ giống VIN005 môi trường thạch sau tuần nuôi cấy 3500 lux VIN072 cm cm Hình Minh họa chóp dòng rễ tơ từ giống VIN002 môi trường thạch B5 VIN072 mơi trường thạch W bị thối hóa chiếu sáng 3500 luxsau tuần nuôi cấy lux cm 500 lux cm 1000 lux cm 1500 lux cm 2000 lux cm 2500 lux cm 3000 lux cm 3500 lux cm Hình Minh họa ảnh hưởng cường độ ánh sáng lên phát triển dủa dòng rễ tơ từ giống VIN005 môi trường thạch B5 sau tuần nuôi cấy Trang 91 SCIENCE & TECHNOLOGY DEVELOPMENT JOURNAL: NATURAL SCIENCE, VOL 1, ISSUE 6, 2017 Ảnh hưởng nhiệt độ Khi nuôi môi trường lỏng, nhiệt độ làm thay đổi tăng trưởng rễ tơ Dừa cạn [17] Thật vậy, kết thu cho thấy môi trường thạch phát triển rễ tơ Dừa cạn chịu ảnh hưởng nhiệt độ Trên môi trường thạch, dòng rễ tơ bốn nhóm Dừa cạn phát triển sẫm màu nhiệt độ 8–10 oC nhiệt độ nuôi cấy từ 18 oC đến 34 oC không ảnh hưởng lên tỷ lệ số dòng rễ phát triển bình thường (Bảng 3, Hình 9) Tuy nhiên, 18–20 oC, dòng rễ tơ o - 10 C cm o 18 - 20 C phát triển chậm Quan sát cho thấy dòng rễ tơ phát triển mạnh, tỏa tròn với nhiều nhánh bên 25–27 oC nhánh rễ trở nên mảnh 32–34 oC sau hai tháng cấy chuyền (Hình 9) Ảnh hưởng nhiệt độ lên tăng trưởng dòng rễ tơ liên quan mật thiết với hoạt tính enzyme tổng hợp đến hợp chất sơ cấp, bao gồm hợp chất cấu tạo nên vật chất tế bào Theo đó, 25 – 27 oC có lẽ nhiệt độ thích hợp để enzyme hoạt động nên tăng trưởng rễ xảy mạnh cm o 25 - 27 C cm o 32 - 34 C cm Hình Minh họa phát triển rễ tơ từ giống VIN002 môi trường thạch B5 nhiệt độ nuôi cấy khác sau tuần nuôi cấy Bảng Tỷ lệ dòng rễ tơ phát triển môi trường thạch nhiệt độ nuôi cấy khác Nhiệt độ nuôi cấy (oC) HRd (%) VIN002 VIN005 VIN072 VIN077 8–10 0,0b 0,0b 0,0b 0,0b 18–20 65,7a 64,0a 59,3a 60,7a 25–27 69,3a 67,0a 57,3a 60,7a 32–34 67,0a 64,3a 57,3a 61,3a Ghi chú: Các trị trung bình cột có chữ theo sau giống khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê p=0,05 Sự ổn định di truyền dòng rễ tơ sau thời gian bảo quản 12 tháng Các dòng rễ tơ từ bốn giống Dừa cạn ni cấy điều kiện thích hợp chọn lọc Các dòng rễ tơ giống VIN002 VIN005 nuôi cấy môi trường thạch B5, tối 25 – 27 oC Các dòng rễ tơ giống VIN072 VIN077 nuôi cấy điều kiện tương tự môi trường thạch W Sau 12 tháng cấy chuyền, 30 dòng rễ phát triển tạo rễ Trang 92 nhóm kiểm tra diện gene rolABC (Hình 10) Kết phân tích cho thấy số dòng bị gene rolB Tỷ lệ số dòng rễ bị gene rolB khơng giống bốn nhóm dòng rễ tơ (Bảng 4) Nhóm dòng rễ tơ từ giống VIN072 có tỷ lệ số dòng rễ bị gene rolB cao nhất, lên đến 20% Rễ tơ từ giống VIN002 có tỷ lệ số dòng rễ tơ bị gene rolB thấp nửa so với nhóm dòng VIN072 TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ: CHUYÊN SAN KHOA HỌC TỰ NHIÊN, TẬP 1, SỐ 6, 2017 Bảng Tỷ lệ dòng rễ tơ giữ gene rolB sau 12 tháng cấy chuyền bảo quản liên tục mơi trường thạch Nhóm dòng rễ tơ Tỷ lệ dòng rễ tơ giữ gene rolB (%) VIN002 90,0 VIN005 93,3 VIN072 80,0 VIN077 93,3 Kết khảo sát 30 dòng rễ phát triển bình thường (khơng tạo sẹo, khơng tạo chồi) cho nhóm dòng rễ tơ từ bốn giống Dừa cạn Dòng Dòng Chứng dương rolA rolB rolC rolA rolB rolC rolA rolB rolC Nước Thang Dòng 18 Dòng 19 Dòng 20 rolA rolB rolC rolA rolB rolC rolA rolB rolC Nước Thang Dòng Dòng 10 Dòng 11 rolA rolB rolC rolA rolB rolC rolA rolB rolC Nước Thang Dòng 24 Dòng 25 Dòng 26 rolA rolB rolC rolA rolB rolC rolA rolB rolC Nước Thang Hình 10 Minh họa kết phân tích PCR xác nhận diện gene rolABC gene số dòng rễ tơ từ giống Dừa cạn VIN002 sau 12 tháng cấy chuyền liên tục môi trường thạch B5 25–27 oC tối Gene rolB biết gene có vai trò quan trọng định hình thành rễ tơ [18] Kết quan sát cho thấy tất dòng rễ tơ từ bốn giống Dừa cạn mà bị gene rolB có hình thái sau 12 tháng cấy chuyền liên tục phát triển với nhánh bên nhánh trở nên mảnh Điều cho thấy gene rolB đóng vai trò định đến phát triển rễ tơ Dừa cạn ảnh hưởng lên sản lượng sinh khối rễ nuôi cấy Kết khảo sát cho thấy ổn định hình thái rễ sau thời gian cấy chuyền liên tục đặc điểm hữu ích giúp chọn lọc dòng rễ cho nghiên cứu sau Ngồi ra, kết phân tích cho thấy số dòng rễ khơng có diện gene rolA và/hoặc rolC (số liệu không trình bày đây) Hiện tượng gene không chuyển đồng thời với gene rolB [19] chúng bị gene rolB trình bảo quản KẾT LUẬN Kết cho thấy rễ tơ thu từ bốn giống Dừa cạn có mơi trường thích hợp để ni cấy bảo quản khác Mơi trường thích hợp để bảo quản thay đổi tùy vào giống Dừa cạn không phụ thuộc vào chủng A rhizogenes dùng để cảm ứng Mơi trường B5 thích hợp để bảo quản dòng rễ tơ thu từ hai giống VIN002 VIN005, mơi trường W thích hợp để bảo quản dòng rễ tơ thu từ hai giống VIN072 VIN077 Các dòng rễ tơ từ bốn giống VIN002, VIN005, VIN072 VIN077 phải Trang 93 SCIENCE & TECHNOLOGY DEVELOPMENT JOURNAL: NATURAL SCIENCE, VOL 1, ISSUE 6, 2017 nuôi cấy bảo quản điều kiện tối 25– 27 oC Khi điều kiện bảo quản khơng phù hợp, rễ tơ có xu hướng phát triển phát triển thành sẹo (hoặc chồi) tự phát Tuy nhiên, điều kiện nuôi cấy bảo quản thích hợp, rễ tơ bị gene rolB dẫn đến thay đổi hình thái sau mười hai tháng cấy chuyền liên tục Preliminary study on the preservation of Catharanthus roseus (L.) G Don hairy root lines induced by Agrobacterium rhizogenes isolated in Vietnam Nguyen Nhu Nhut University of Science, VNU-HCM Giatuong Company Limited, Binhduong branch Bui Van Le University of Science, VNU-HCM ABSTRACT lines from VIN022 and VIN077 All hairy root lines must be preserved in the dark at 25–27 oC Under suitable conditions, the rate of lines growing normally reached 69.3, 67.0, 57.3 and 60.7 % for VIN002, VIN005, VIN072, and VIN077, respectively There were 90.0, 93.3, 80.0 and 93.3 % of lines could preserve rolB, a gene which has important effect on the growth of hairy roots Key words: Agrobacterium rhizogenes, Catharanthus roseus, hairy root, induction, preservation Agrobacterium rhizogenes-transformed hairy roots from Catharanthus roseus have been widely used in research and in life Consequently, methods for preservation are essential to maintain valuable hairy root lines Our results showed that Gamborg’B5 was the most suitable medium for hairy roots from VIN002 and VIN005 while solid White media was more comfortable for the hairy TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] E Alpizar, E Dechamp, F Lapeyre-Montes, C Guilhaumon, B Bertrand, C Jourdan, P Lashermes, H Etienne, Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Coffee (Coffea arabica): Conditions for long-term proliferation, and morphological and molecular characterization, Annals of Botany, 101, 929–940 (2008) [2] R Bhadra, Establishment, cultivation and optimization of hairy roots of Catharanthus roseus for the synthesis of indole alkaloids, Thesis for the doctor degree of philosophy, Rice University, Houston, Texas (1994) Trang 94 [3] R.Bhadra, J.A.Morgan, J.V.Shanks, Transient studies of light-adapted cultures of hairy roots of Catharanthus roseus: growth and indole alkaloid accumulation, Biotechnol Bioeng., 60 (6), 670–678 (1998) [4] M.H.Brillanceau, C.David, J.Tempé, Genetic transformation of Catharanthus roseus G Don by Agrobacterium rhizogenes, Plant Cell Rep., 8(2), 63–6 (1989) [5] S Chandra, H Lata, A Varma, Biotechnology for medicinal plants Springer, London (2013) [6] C.K Chang, K.S Chang, Y.C Lin, S.Y Liu, C.Y Chen, Hairy root cultures of TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ: CHUYÊN SAN KHOA HỌC TỰ NHIÊN, TẬP 1, SỐ 6, 2017 [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] Gynostemma pentaphyllum Thunb Makino: a promising approach for the production of gypenosides as an alternative of ginseng saponins, Biotechnology Letters, 27, 1165– 1169 (2005) M.D Chilton, A.T David, P Annik, D Chantal, C.D Francine, J Tempé, Agrobacterium rhizogenes inserts T-DNA into the genomes of the host plant root cells, Nature, 295, 432–434 (1982) I.M Chung, M Ali, Y.M Yang, C.A M Peebles,S.C Chun, S.J Lee, K.Y San, A Ahmad, Identification of new compounds from Catharanthus roseus hairy root cultures, Bull Korean Chem Soc., 28, 8, 1294–1298 (2007) S Ewa, K Agnieszka, A.O Monika, K.K Anna, W Halina, Establishment of hairy root cultures of Rhaponticum carthamoides(Willd.) Iljin for the production of biomass and caffeic acid derivatives, BioMed Research International, 2015, 1–11 (2015) M.S Hanafy, M.A Matter, M.S Asker, M.R Rady, Production of indole alkaloids in hairy root cultures of Catharanthus roseus L and their antimicrobial activity, South African Journal of Botany, 105, 9–18 (2016) H.J.He, P.Liang, H.P.Shi, Effects of sucrose and light on the growth and production of secondary metabolites in Pueraria phaseoloides hairy roots, Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao, 21, 6, 1003–1008 (2005) D.K Maheshwari, Bacteria in agrobiology: crop ecosystems, Springer (2011) Y.S.W Manuhara, A.N Kristanti, E.S.W Utami, A Yachya, Effect of sucrose and potassium nitrate on biomass and saponin content of Talinum paniculatum Gaertn hairy root in balloon-type huybubble bioreactor, Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 5, 12, 1027–1032 (2015) [14] S Mardani-Nejad, Khavari-Nejad A Ramazan, S Saadatmand, N Farzaneh, A.A Parviz, Potent antioxidant properties of rolBtransformed Catharanthus roseus (L.) G Don, Iranian Journal of Pharmaceutical Research, 15, 2, 537–550 (2016) [15] A Pietrosiuk, M Furmanowa, Preliminary results of indole alkaloids production in different roots of Catharanthus roseus cultured in vitro, Acta Soc Bot Pol., 70, 261– 265 (2001) [16] I Sivanesan, B.R Jeong, Induction and establishment of adventitious and hairy root cultures of Plumbago zeylanica L., African Journal of Biotechnology, 8, 20, 5294–5300 (2009) [17] L.Toivonen, S.Laakso, H.Rosenqvist, The effect of temperature on hairy root cultures of Catharanthus roseus: Growth, indole alkaloid accumulation and membrane lipid composition, Plant Cell Rep., 11, 8, 395–399 (1992) [18] T Tzfira, V Citovsky, Agrobacterium – From biology to biotechnology, Springer (2008) [19] P Verma, A.K Mathur, K Shanker, Growth, alkaloid production, rol genes integration, bioreactor up-scaling and plant regeneration studies in hairy root lines of Catharanthus roseus, Plant Biosystems, 146, 1, 27–40 (2012) [20] S.H Xue, X.J Luo, Z.H Wu, H.L Zhang, X.Y Wang, Cold storage and cryopreservation of hairy root cultures of medicinal plant Eruca sativa Mill., Astragalus membranaceus and Gentiana macrophylla Pall., Plant Cell Tiss Organ Cult., 92, 251– 260 (2008) [21] S Zahra, K Mehrnaz, A Gholamreza, G Mustafa, Improvement of atropine production by different biotic and abiotic elicitors in hairy root cultures of Datura metel, Turkish Journal of Biology, 39, 111–118 (2015) Trang 95 ... giống Dừa cạn khác cảm ứng chủng A rhizogenes phân lập từ đất vùng rễ trồng Việt Nam Ba giống Dừa cạn VIN002, VIN005 VIN072 cảm ứng tạo rễ tơ chủng A rhizogenes C18 giống Dừa cạn VIN077 cảm ứng. .. rễ tơ Dừa cạn bảo quản chủ yếu phương pháp cấy chuyền môi trường thạch môi trường lỏng Tuy nhiên, nghiên cứu nuôi cấy bảo quản rễ tơ mơi trường thạch hạn chế Trong nghiên cứu này, rễ tơ Dừa cạn. .. ni cấy bảo quản dòng rễ tơ Dừa cạn cảm ứng chủng A rhizogenes ATCC 15834 tỷ lệ rễ sống sót đạt 35 – 43% Trong đó, rễ tơ Coleus forskohlii Briq cảm ứng chủng A rhizogenes ATCC 15834 ni cấy bảo quản