Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu này trình bày sự loại bỏ túm lông kích thích sự tạo chồi từ khúc cắt mang mô phân sinh ngọn chồi cây xương rồng lê gai Opuntia ficus-indica trên môi trường Murashige và Skoog (MS) có bổ sung 6-benzylaminopurine (BA) 5 mg/L. Các bi´en đổi hình thái và sinh lý trong quá trình phát sinh chồi được phân tích.
Tạp chí Phát triển Khoa học Cơng nghệ – Khoa học Tự nhiên, 3(1):18- 28 Nghiên cứu Tìm hiểu phát sinh chồi in vitro xương rồng lê gai Opuntia ficus – indica (L.) Mill Nguyễn Thị Cẩm Duyên1,∗ , Bùi Trang Việt2 , Trần Thanh Hương2 TÓM TẮT Nghiên cứu trình bày loại bỏ túm lơng kích thích tạo chồi từ khúc cắt mang mô phân sinh chồi xương rồng lê gai Opuntia ficus-indica mơi trường Murashige Skoog (MS) có bổ sung 6-benzylaminopurine (BA) mg/L Các bie´ˆ n đổi hình thái sinh lý trình phát sinh chồi phân tích Sự phát sinh chồi từ khúc cắt mang mô phân sinh chồi xương rồng lê gai qua giai đoạn: hoạt hóa phân chia te´ˆ bào, tạo vùng phát sinh hình thái chồi, hình thành mơ phân sinh chồi cuối chồi với phác thể Vị trí mang mơ phân sinh chồi mặt diện thuộc phần nhánh cho hiệu tạo chồi cao Vị trí có cường độ quang hợp, hơ hấp, hoạt tính indol acetic acid (IAA), zeatin nội sinh cao vị trí lại Auxin nồng độ khác ke´ˆ t hợp với BA mg/L thúc đẩy tạo chồi gia tăng chiều cao chồi Sự phát sinh chồi đạt cao mơi trường MS có bổ sung BA mg/L 1-naphthalene acetic acid (NAA) 0,5 mg/L Tất xử lý tác động lên mô phân sinh chồi giúp gia tăng số lượng chồi hình thành Trong đó, số chồi hình thành cao mẫu cấy cắt bỏ phần bề mặt mô phân sinh chồi Mối liên hệ túm lơng che chở, vị trí mẫu cấy, chất điều hòa tăng trưởng thực vật, cường độ hô hấp, cường độ quang hợp phát sinh chồi thảo luận Từ khố: Opuntia ficus-indica, Sự phát sinh chồi, Túm lơng, Xương rồng GIỚI THIỆU Trường Đại học Nguyễn Tất Thành Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia Tp.HCM Liên hệ Nguyễn Thị Cẩm Duyên, Trường Đại học Nguyễn Tất Thành Email: ntcamduyen@gmail.com Lịch sử • Ngày nhận: 14-11-2018 • Ngày chấp nhận: 09-01-2019 • Ngày đăng: 31-03-2019 DOI : https://doi.org/10.32508/stdjns.v3i1.714 Bản quyền © ĐHQG Tp.HCM Đây báo công bố mở phát hành theo điều khoản the Creative Commons Attribution 4.0 International license Xương rồng lê gai Opuntia ficus-indica (Hình 1) bie´ˆ t đe´ˆ n đa chức năng, sử dụng làm cảnh thuốc, cành dùng làm thức ăn cho người gia súc Cây trồng làm hàng rào, giúp chống xâm lấn cát khu vực hoang mạc bán hoang mạc Opuntia ficus-indica chứa lượng lớn ascorbic acid, vitamin E, carotenoid, chất xơ, amino acid hợp chất chống oxy hóa (phenol, flavonoid, betaxanthin betacyanin) Đây hợp chất có lợi cho sức khỏe, thể khả làm hạ đường huye´ˆ t, hạ lipid máu chống oxy hóa Đáng kể chứa nhiều vitamin khoáng chất, đặc biệt chất chống viêm loét dày, chống oxy hóa, chống ung thư, bảo vệ thần kinh, bảo vệ gan Opuntia ficus-indica nhập từ Mexico trồng thử nghiệm vùng sa mạc Ninh Thuận Bình Thuận, Việt Nam Đây lồi sinh trưởng nhanh, thích hợp với điều kiện đất khơ hạn, dinh dưỡng, lại có độ che phủ cao, góp phần cải tạo đất, chống xói mòn Tuy nhiên, phương pháp nhân giống xương rồng lê gai thơng thường chie´ˆ m nhiều diện tích hiệu suất nhân giống khơng cao Chính vậy, vi nhân giống nhằm tạo số lượng lớn giống có chất lượng (sạch bệnh, suất cao, phẩm chất tốt…) Các nghiên cứu gần cho thấy đối tượng xương rồng lê gai, thời gian cần cho tạo chồi lâu Trong nghiên cứu này, chúng tơi tie´ˆ n hành phân tích thay đổi hình thái sinh lý trình phát sinh chồi từ khúc cắt mang mô phân sinh chồi Opuntia ficus-indica PHƯƠNG PHÁP Vật liệu Nhánh Opuntia ficus-indica giống không gai, năm tuổi cung cấp Trung tâm Ứng dụng Tie´ˆ n Khoa học Công nghệ tỉnh Ninh Thuận Sau tháng trồng vườn thực nghiệm, nhánh non phát triển từ chồi vùng đỉnh nhánh này, có chiều cao 20 ± cm sử dụng làm vật liệu thí nghiệm Phương pháp Ni cấy khúc cắt mang mô phân sinh chồi để khảo sát ảnh hưởng túm lông phát sinh chồi in vitro Nhánh mang mô phân sinh chồi vườn rửa với nước xà phòng (10 phút), Trích dẫn báo này: Thị Cẩm Duyên N, Trang Việt B, Thanh Hương T Tìm hiểu phát sinh chồi in vitro xương rồng lê gai Opuntia ficus – indica (L.) Mill Sci Tech Dev J - Nat Sci.; 3(1):18-28 18 Tạp chí Phát triển Khoa học Cơng nghệ – Khoa học Tự nhiên, 3(1):18-28 Hình 1: Cây xương rồng lê gai Opuntia ficus-indica (L.) Mill mang nhánh có nguồn gốc từ chồi nách sau lắc với cồn 70% (1 phút), dung dịch HgCl2 0,1% (5 phút) rửa với nước cất vô trùng Các khúc cắt mang mô phân sinh chồi lập từ nhánh, có kích thước 1x1 cm, lấy ngẫu nhiên để loại bỏ túm lông giữ nguyên Sự loại bỏ túm lông thực kính hiển vi soi kẹp cấy Sau đó, khúc cắt mang mơ phân sinh chồi cấy vào erlen 100 mL chứa 25 mL môi trường MS (Murashige Skoog, 1962) bổ sung BA mg/L Sự phát sinh chồi từ khúc cắt mang mô phân sinh chồi theo dõi theo thời gian Tỉ lệ mẫu cấy có chồi phát triển (chồi có chiều cao ≥ mm) chiều cao chồi xác định sau tuần nuôi cấy Phân tích bie´ˆ n đổi hình thái, giải phẫu trình phát triển chồi Các bie´ˆ n đổi hình thái giải phẫu trình phát triển chồi quan sát kính hiển vi quang học sau cắt tay Mẫu cắt dọc cắt ngang, sau nhuộm hai màu (đỏ carmine, xanh iodine) Khảo sát ảnh hưởng vị trí mẫu cấy lên khả tạo chồi Nhánh mang mô phân sinh chồi xương rồng lê gaiOpuntia ficus-indica chia làm phần, phần mặt hông phần mặt diện (Hình 2) Các khúc cắt mang mơ phân sinh chồi vị trí khác khử trùng, loại bỏ túm lông cấy vào erlen 100 mL chứa 25 mL môi trường MS bổ sung BA mg/L Thí nghiệm bố trí theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên với bốn nghiệm thức khúc cắt mang mô phân sinh chồi vị trí 1.1; 19 1.2; 2.1; 2.2 Tỉ lệ mẫu cấy có chồi phát triển (chồi có chiều cao ≥ mm) chiều cao chồi xác định sau tuần nuôi cấy Đo cường độ quang hợp cường độ hô hấp Để khảo sát ảnh hưởng túm lông lên tạo chồi, khúc cắt mang mô phân sinh chồi đo cường độ hô hấp sau thực khúc cắt sau 10 ngày nuôi cấy môi trường MS bổ sung BA mg/L Để khảo sát ảnh hưởng vị trí mẫu cấy lên tạo chồi, khúc cắt mang mô phân sinh chồi vườn vị trí theo hình đo cường độ quang hợp cường độ hô hấp sau thực khúc cắt Cường độ quang hợp khúc cắt mang mô phân sinh chồi đo máy Hansatech thông qua trao đổi khí điện cực oxygen nhiệt độ 27o C, ánh sáng 3000 lux Cường độ hô hấp khúc cắt mang mô phân sinh chồi đo điều kiện đo cường độ quang hợp tắt ánh sáng Vận tốc O2 khơng che tối che tối mẫu đo biểu thị giá trị cường độ quang hợp cường độ hô hấp khúc cắt mang mô phân sinh chồi (μL O2 /g TLT/ giờ) Ly trích đo hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật Tie´ˆ n hành ly trích đo hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh khúc cắt mang mô phân sinh chồi từ hai vị trí phần nhánh tháng tuổi vườn (vị trí 2.1 2.2) (Hình 2) có loại bỏ túm lơng Các chất điều hòa Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ – Khoa học Tự nhiên, 3(1):18-28 Hình 2: Nhánh tháng tuổi mang mô phân sinh chồi xương rồng lê gai Opuntia ficus-indica Thanh ngang cm 1.1: Phần chứa mô phân sinh chồi thuộc mặt hông phần gốc 1.2: Phần chứa mô phân sinh chồi thuộc mặt diện phần gốc 2.1: Phần chứa cácmô phân sinh chồi thuộc mặt hông phần 2.2: Phần chứa mô phân sinh chồi thuộc mặt diện phần tăng trưởng thực vật nội sinh gồm auxin (indole-3acetic acid) (IAA), cytokinin (zeatin), gibberellin abcisic acid (ABA) có mẫu cấy ly trích lập cách dùng dung mơi thích hợp thực sắc ký mỏng silica gel F254 (Merck), nhiệt độ 30o C với hệ dung môi isopropanol: amonium hydroxyde: H2 O (10:1:1 v/v) Vị trí chất điều hòa tăng trưởng thực vật phát trực tie´ˆ p tia UV 254 nm Hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật đo sinh trắc nghiệm: diệp tiêu lúa (Oryza sativa L.) cho auxin abcisic acid, tử diệp dưa leo (Cucumis sativus L.) cho cytokinin mầm xà lách (Lactuca sativa L.) cho gibberellin Khảo sát ảnh hưởng phối hợp cytokinin auxin lên phát triển chồi in vitro Các chồi in vitro tuần tuổi có chiều cao mm, bề rộng 2-3 mm tăng trưởng môi trường MS bổ sung BA mg/L có nguồn gốc từ khúc cắt mang mơ phân sinh chồi vị trí thích hợp cấy chuyền vào mơi trường MS bổ sung BA mg/L NAA (0,5; 1,5 mg/L) IAA (0,5 mg/L) Thí nghiệm bố trí theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên với sáu nghiệm thức đối chứng (môi trường MS bổ sung BA mg/L), môi trường MS bổ sung BA mg/L IAA nồng độ 0,5 mg/L, môi trường MS bổ sung BA mg/L NAA nồng độ 0,5 hoặc 1,5 mg/L Mỗi nghiệm thức lặp lại lần erlen, erlen gồm mẫu cấy Quan sát bie´ˆ n đổi hình thái chồi theo thời gian Số chồi mẫu cấy (chồi có chiều cao ≥ mm) chiều cao chồi xác định sau tuần nuôi cấy Khảo sát ảnh hưởng hủy mơ phân sinh chồi phát sinh chồi in vitro Chồi in vitro tuần tuổi có chiều cao mm ni cấy mơi trường MS bổ sung BA mg/L NAA 0,5 mg/L có nguồn gốc từ khúc cắt mang mơ phân sinh chồi vị trí thích hợp sử dụng làm vật liệu thí nghiệm Dưới kính hiển vi soi nổi, tác động lên mô phân sinh chồi thực theo hai cách sau: (1) Dùng kim có đường kính mũi 200 μm đâm vào vùng trung tâm chồi với độ sâu khoảng mm, (2) Dùng dao cắt bỏ phần bề mặt của mơ phân sinh chồi với bề dày mm Chồi sau đặt ni môi trường MS bổ sung BA mg/L NAA 0,5 mg/L Các mẫu cấy đặt nuôi nhiệt độ 27 ± 2o C, độ ẩm 55 ± 10%, ánh sáng 2000 ± 100 lux (12/24 giờ) Thí nghiệm bố trí theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên với ba nghiệm thức đối chứng (không hủy mô phân sinh chồi), hủy mô phân sinh kim cắt bỏ bề mặt mơ phân sinh chồi Mỗi nghiệm thức lặp lại 15 lần erlen, erlen gồm mẫu cấy Quan sát bie´ˆ n đổi hình thái chồi theo thời gian Số chồi mẫu cấy (chồi có chiều cao ≥ mm) chiều cao chồi xác định sau tuần nuôi cấy Xử lý thống kê Số liệu bảng ke´ˆ t phân tích thống kê phần mềm Statistical Package Social Sciences (SPSS) phiên 20.0 cho Windows Các số trung bình cột với ký tự khác kèm theo khác biệt có ý nghĩa mức P ≤ 0,05 20 Tạp chí Phát triển Khoa học Cơng nghệ – Khoa học Tự nhiên, 3(1):18-28 KẾT QUẢ Ảnh hưởng túm lông tạo chồi in vitro từ khúc cắt mang mô phân sinh chồi Sau tuần nuôi cấy môi trường MS bổ sung BA mg/L, mẫu cấy có loại bỏ túm lơng có tỉ lệ mẫu tạo chồi 53,33%, cao khác biệt có ý nghĩa so với mẫu cấy khơng loại bỏ túm lông với tỉ lệ mẫu tạo chồi 6,67% Sau tuần ni cấy, có phát triển chiều cao chồi cao mẫu cấy có loại bỏ túm lông thấp mẫu cấy không loại bỏ túm lơng Chiều cao chồi mẫu cấy có loại bỏ túm lông 6,80 mm chiều cao mẫu cấy khơng có loại bỏ túm lơng 4,60 mm (Bảng 1) Vào thời điểm ngày 0, mẫu cấy loại bỏ túm lơng có cường độ hô hấp cao so với mẫu cấy không loại bỏ túm lông Sau 10 ngày nuôi cấy môi trường MS bổ sung BA mg/L, mẫu cấy có cường độ hơ hấp gia tăng mạnh dù có loại bỏ túm lơng hay không Tuy nhiên, so với mẫu cấy không loại bỏ túm lông, cường độ hô hấp mẫu cấy loại bỏ túm lông gia tăng mạnh (Bảng 2) Các bie´ˆ n đổi hình thái, giải phẫu trình phát triển chồi Ở thời điểm bắt đầu ni cấy, vòm mơ phân sinh chồi có dạng tròn, khúc cắt có loại bỏ túm lơng có lớp cutin bong khỏi vách cellulose te´ˆ bào biểu bì (Hình 3) Khi ni cấy khúc cắt mang mơ phân sinh chồi vị trí 2.2 loại bỏ túm lông môi trường MS bổ sung BA mg/L, vùng mô phân sinh chồi có thay đổi rõ rệt theo thời gian Từ mơ phân sinh chồi ban đầu (Hình 3B), te´ˆ bào vùng nhu mơ bên biểu bì phân chia mạnh hình thành hệ thống mạch dẫn, teˆ´ bào vùng trung tâm phân chia theo hướng ngồi hình thành chồi ngày thứ (Hình 4) Sau 10 ngày ni cấy, có hình thành hai phác thể (Hình 5) Sau 14 ngày ni cấy, hai phác thể mở ra, chồi bên nối mạch với trụ trung tâm bên (Hình 6) Sau 21 ngày ni cấy, chồi hình thành với vùng mơ phân sinh chồi nhơ cao, hẹp hơn, nhiều hình thành, kéo dài nối mạch với trụ trung tâm (Hình 6B) Khi ni cấy khúc cắt mang mơ phân sinh chồi vị trí 2.2 khơng loại bỏ túm lông môi trường MS bổ sung BA mg/L, sau 10 ngày, te´ˆ bào vùng bên mô phân sinh chồi bắt đầu có phân chia te´ˆ bào, hình thành ne´ˆ p lồi tiền thân sơ khởi (Hình 5B) 21 Ảnh hưởng vị trí mẫu cấy lên khả tạo chồi Sau tuần nuôi cấy, mẫu cấy vị trí mặt diện nhánh (vị trí 1.2 2.2) có tỉ lệ mẫu tạo chồi cao so với mẫu cấy mặt hơng (vị trí 1.1 2.1) cho dù mẫu cấy cô lập từ phần hay phần gốc nhánh Ở mặt diện, mẫu cấy nhánh có tỉ lệ mẫu tạo chồi cao mẫu cấy gốc nhánh Sau tuần ni cấy, tất mẫu cấy có khả tạo chồi Chiều cao chồi đạt cao mẫu cấy vị trí mặt diện thuộc phần nhánh (vị trí 2.2) (Bảng 3) Các khúc cắt có cường độ hơ hấp cao cường độ quang hợp tất vị trí nhánh thời điểm bắt đầu nuôi cấy Tuy nhiên, khúc cắt vị trí mang mơ phân sinh chồi mặt diện thuộc phần nhánh (vị trí 2.2) có cường độ quang hợp hơ hấp cao so với vị trí lại sau thực khúc cắt vườn (Bảng 4) Như vậy, tương ứng với tỉ lệ tạo chồi sau tuần nuôi cấy chiều cao chồi sau tuần nuôi cấy môi trường MS bổ sung BA mg/L cao nhất, mẫu cấy từ vị trí 2.2 có cường độ quang hợp cường độ hơ hấp cao Hai vị trí thuộc phần nhánh có chênh lệch lớn tỉ lệ mẫu tạo chồi sau tuần chiều cao chồi sau tuần nuôi cấy môi trường MS bổ sung BA mg/L (Bảng 4) Đối với vườn tháng tuổi, hoạt tính IAA, zeatin, gibberellin (dạng tự do) cao vị trí thuộc mặt diện (vị trí 2.2) Ngược lại, tỉ lệ auxin/cytokinin mặt hơng (vị trí 2.1) cao so với vị trí mặt diện (Bảng 5) Chồi sau tuần nuôi cấy môi trường MS bổ sung BA mg/L từ khúc cắt mang mô phân sinh chồi vị trí 2.2 có loại bỏ túm lơng làm vật liệu cho thí nghiệm tie´ˆ p theo Ảnh hưởng phối hợp cytokinin auxin lên phát triển chồi in vitro Tất phương thức tạo chồi (môi trường bổ sung BA IAA hay NAA nồng độ khác nhau) làm tăng chiều cao chồi so với đối chứng Ne´ˆ u cố định nồng độ BA mg/L đồng thời gia tăng nồng độ IAA (0,5; mg/L) số chồi tăng lên so với mơi trường chứa BA mg/L, nhiên khơng có khác biệt số chồi tạo thành chiều cao chồi hai nồng độ IAA khảo sát 0,5 mg/L (Bảng 6) Mặt khác, ne´ˆ u cố định nồng độ BA mg/L đồng thời gia tăng nồng độ NAA (0,5; 1; 1,5 mg/L) số chồi chiều cao chồi tăng so với môi trường chứa BA mg/L, nhiên gia tăng nồng độ NAA, số chồi chiều cao chồi giảm (Bảng 6) Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ – Khoa học Tự nhiên, 3(1):18-28 Bảng 1: Sự hình thành chồi từ khúc cắt mang mơ phân sinh chồi Opuntia ficus-indica vườn môi trường MS bổ sung BA mg/L Khúc cắt mang mô phân sinh chồi Tỉ lệ mẫu tạo chồi (%) Chiều cao chồi sau tuần (mm) Tuần Tuần Không loại bỏ túm lông 6,67 ± 6,67 100 4,60 ± 0,45 Loại bỏ túm lông 53,33 ± 6,67 100 6,80 ± 0,63 T-test * * (*) Các số trung bình cột khác biệt có ý nghĩa thống kê mức P ≤ 0,05 (T-test) Bảng 2: Ảnh hưởng loại bỏ túm lông lên hoạt động hô hấp khúc cắt mang mô phân sinh chồi Opuntia ficus-indica Khúc cắt mang mô phân sinh chồi Cường độ hô hấp (μL O2 /g TLT/giờ) Ngày Ngày 10 Không loại bỏ túm lông 128,12 ± 14,32 209,07 ± 7,68 Có loại bỏ túm lông 187,69 ± 17,88 289,33 ± 9,45 T-test * * (*) Các số trung bình cột khác biệt có ý nghĩa thống kê mức P ≤ 0,05 (T-test) Hình 3: Lát cắt dọc qua khúc cắt mang mơ phân sinh chồi vị trí 2.2 với túm lông bao phủ mô phân sinh chồi (A) loại bỏ túm lông (B) lúc bắt đầu ni cấy Bảng 3: Ảnh hưởng vị trí mẫu cấy lên hình thành chồi Opuntia ficus-indica Vị trí mẫu cấy Ký hiệu Tỉ lệ mẫu tạo chồi (%) Tuần Ngọn Gốc Chính diện 2.2 66,67 ± Hơng 2.1 Chính diện Hơng Chiều cao chồi sau tuần (mm) Tuần 100 7,30 ± 0,47a 0d 100 2,10 ± 0,68d 1.2 33,33 ± 0,7b 100 5,80 ± 0,35b 1.1 13,33 ± 0,55c 100 3,90 ± 0,45c 0,7a Ghi chú: Các số trung bình cột khác biệt có ý nghĩa thống kê mức P ≤ 0,05 22 Tạp chí Phát triển Khoa học Cơng nghệ – Khoa học Tự nhiên, 3(1):18-28 Hình 4: Lát cắt dọc qua khúc cắt mang mô phân sinh chồi vị trí 2.2 loại bỏ túm lơng sau ngày nuôi cấy môi trường MS bổ sung BA mg/L Hình 5: Lát cắt dọc qua khúc cắt mang mô phân sinh chồi vị trí 2.2 loại bỏ túm lơng (A) khơng loại bỏ túm lông (B) sau 10 ngày nuôi cấy môi trường MS bổ sung BA mg/L Mũi tên sơ khởi Bảng 4: Sự khác biệt cường độ quang hợp hô hấp khúc cắt mang mô phân sinh chồi vị trí khác từ vườn (đo sau thực khúc cắt) Vị trí Phần Ngọn Phần Gốc Ký hiệu Cường độ quang hợp (μL O2 /g TLT/giờ) Cường độ hơ hấp (μL O2 /g TLT/giờ) Chính diện 2.2 112,11 ± 16,02a 239,24 ± 5,07a Hông 2.1 95,36 ± 12,66bc 149,58 ± 13,34b Chính diện 1.2 101,68 ± 9,84ab 105,37 ± 14,17c Hông 1.1 78,85 ±11,89c 130,36 ± 10,48b Ghi chú: Các số trung bình cột khác biệt có ý nghĩa thống kê mức P ≤ 0,05 23 Tạp chí Phát triển Khoa học Cơng nghệ – Khoa học Tự nhiên, 3(1):18-28 Hình 6: Lát cắt dọc qua khúc cắt mang mô phân sinh chồi vị trí 2.2 loại bỏ túm lông sau 14 ngày (A) sau 21 ngày (B) nuôi cấy môi trường MS bổ sung BA mg/L Bảng 5: Hoạt tính chất điều hòa thực vật dạng tự khúc cắt mang mô phân sinh chồi vườn tháng tuổi vị trí phần Vị trí phần Mặt hơng (2.1) Mặt (2.2) T-test diện Hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng nội sinh (μg/ gTLT) Tỉ lệ auxin/cytokinin IAA Zeatin GA3 ABA 1,19 ± 0,04 0,48 ± 0,02 1,32 ± 0,06 0,43 ± 0,03 2,48 1,37 ± 0,03 0,64 ± 0,03 1,74 ± 0,04 0,47 ± 0,04 2,14 * * * (*) Các số trung bình cột khác biệt có ý nghĩa thống kê mức P ≤ 0,05 (T-test) Bảng 6: Sự phát triển chồi từ chồi in vitro tuần tuổi sau tuần nuôi cấy môi trường MS bổ sung BA mg/L IAA NAA nồng độ khác Nghiệm thức Số chồi/Mẫu cấy Chiều cao trung bình chồi (mm) Đối chứng (MS bổ sung BA mg/L) 1,58 ± 0,25d 6,30 ± 0,26c IAA (mg/L) 0,5 3,09 ± 0,27c 7,80 ± 0,18b 3,25 ± 0,25c 6,90 ± 0,28bc 0,5 6,27 ± 0,29a 9,10 ± 0,33a 5,15 ± 0,26b 6,70 ± 0,37c 1,5 3,86 ± 0,34c 7,10 ± 0,17bc NAA (mg/L) Ghi chú: Các số trung bình cột khác biệt có ý nghĩa thống kê mức P ≤ 0,05 Ảnh hưởng hủy mơ phân sinh chồi phát sinh chồi in vitro Tất phương thức tác động lên mô phân sinh chồi thực giúp gia tăng số lượng chồi hình thành Số chồi hình thành cao mẫu cấy cắt bỏ phần bề mặt mô phân sinh chồi (2,90 chồi /mẫu cấy), thấp mẫu cấy hủy mơ phân sinh chồi kim (2,20 chồi /mẫu cấy) Sự khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng: 1,50 chồi/mẫu cấy (Bảng 7) THẢO LUẬN Đối với xương rồng lê gai Opuntia ficus-indica, túm lông bảo vệ mô phân sinh chồi lại cản phát triển chồi Điều thể qua tỉ lệ mẫu cấy tạo chồi cao mẫu cấy có loại bỏ túm lơng thấp mẫu cấy không loại bỏ túm lông sau hai tuần nuôi cấy môi trường MS bổ sung BA mg/L (Bảng 1) Tương ứng với tỉ lệ mẫu tạo chồi cao hơn, 24 Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ – Khoa học Tự nhiên, 3(1):18-28 Bảng 7: Sự phát sinh chồi từ mẫu cấy chịu ảnh hưởng hủy mô phân sinh chồi sau tuần nuôi cấy môi trường MS bổ sung BA mg/L NAA 0,5 mg/L Nghiệm thức Số chồi/mẫu cấy Đối chứng (không tác động lên mô phân sinh ngọn) 1,50 ± 0,2c Dùng kim hủy mơ phân sinh chồi 2,20 ± 0,32b Cắt bỏ phần bề mặt mô phân sinh chồi 2,90 ± 0,35a (*) Các số trung bình cột có khác biệt ý nghĩa thống kê mức P ≤ 0,05 mẫu cấy có loại bỏ túm lơng ln có cường độ hơ hấp cao so với mẫu cấy không loại bỏ túm lông hai thời điểm sau thực khúc cắt từ vườn sau nuôi cấy 10 ngày môi trường MS bổ sung BA mg/L (Bảng 2) Do khả tạo sơ khởi chồi mạnh hơn, nên tỉ lệ mẫu cấy tạo chồi từ khúc cắt có loại bỏ túm lơng sau bốn tuần nuôi cấy cao nhiều so với mẫu cấy không loại bỏ túm lông (Bảng 1) Túm lông diện núm (areole) đặc điểm độc đáo có lồi thuộc họ phụ Opuntioideace Các lồi thuộc họ xương rồng có khả bie´ˆ n đổi hình thái thích nghi phát triển điều kiện khắc nghiệt, tiêu giảm thành gai lớp cutin dày bề mặt để hạn che´ˆ nước Hầu he´ˆ t gai có kích thước lớn, số ngắn, mềm hơn, mọc thành cụm, túm lơng che chở Lơng che chở có chức tăng cường nhiệm vụ bảo vệ để giảm bớt thoát nước Sự diện túm lông phần cản tie´ˆ p xúc mơ phân sinh với khơng khí, qua làm giảm hoạt động hô hấp mô phân sinh Bên cạnh đó, việc loại bỏ túm lơng phần làm gián đoạn lớp cutin bề mặt khúc cắt mang mơ phân sinh chồi Đối với khúc cắt có loại bỏ túm lông, bề mặt mô phân sinh có gián đoạn lớp cutin (Hình B), qua đó, có cường độ hơ hấp cao so với mẫu cấy không loại bỏ túm lông (Bảng 2) Vào thời điểm trước nuôi cấy, te´ˆ bào nhu mơ biểu bì khúc cắt mang mơ phân sinh chồi có xe´ˆ p tương đối đồng (Hình 2B) Sau ngày ni cấy môi trường MS bổ sung BA mg/L, te´ˆ bào nhu mơ biểu bì hoạt hóa phân chia để hình thành vùng phát sinh hình thái (Hình 4) Các te´ˆ bào thuộc vùng bên mơ phân sinh chồi phân chia tạo ne´ˆ p lồi tiền thân sơ khởi hệ thống mạch dẫn Sau đó, vùng phát sinh hình thái tie´ˆ p tục phát triển để hình thành mô phân sinh chồi với diện phác thể vào ngày thứ 10 (Hình 5A) Như vậy, tương tự phát sinh chồi từ mơ phân sinh chồi nhiều lồi thực vật, phát sinh chồi từ khúc cắt mang mô phân sinh chồi xương rồng lê gai qua giai đoạn: hoạt hóa phân chia te´ˆ bào, tạo vùng 25 phát sinh hình thái chồi, hình thành mô phân sinh chồi cuối chồi với phác thể Tạo chồi trình cần nhiều lượng, tương tự nhu cầu lượng cho trình phát triển khác nảy mầm, hoa… Nguồn lượng lấy từ hơ hấp Cùng với q trình thối bie´ˆ n chất dự trữ, chất bie´ˆ n dưỡng trung gian sử dụng để tổng hợp chất cần thie´ˆ t cho hoạt động sống te´ˆ bào bao gồm hormone thực vật cần cho phát sinh hình thái Do đó, hoạt động hơ hấp cao chồi tương ứng với tổng hợp chất kích thích tăng trưởng nhiều hơn, giúp cho biệt hóa mơ cấy xảy dễ dàng Cường độ hô hấp cường độ quang hợp mẫu cấy vị trí 2.2 cao (Hình 4), vị trí cho tỉ lệ mẫu tạo chồi sau tuần nuôi cấy môi trường MS bổ sung BA mg/L cao (66,67%) Tương tự sau tuần ni cấy, chồi hình thành từ vị trí 2.2 có chiều cao cao (7,30 mm), chồi hình thành từ vị trí 2.1; 1.1; 1.2 có chiều cao 2,1; 3,9; 5,8 mm Trong nghiên cứu này, nuôi cấy in vitro môi trường MS bổ sung BA mg/L, khúc cắt mang mơ phân sinh phần (vị trí 2.2) nhìn chung tạo sơ khởi chồi sớm có chiều cao chồi lớn so với phần gốc có vị trí 1.2 (Bảng ) Hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật dạng tự khúc cắt mang mô phân sinh chồi vườn cho thấy có tương ứng khả phát triển chồi mạnh với hoạt tính IAA, zeatin gibberellin nội sinh khúc cắt mang mô phân sinh chồi Đối với vườn tháng tuổi, hoạt tính IAA, zeatin gibberellin khúc cắt vị trí 2.2 cao so với vị trí 2.1 (trừ ABA) Do diện hoạt động phối hợp cytokinin auxin giúp cho gia tăng kích thước te´ˆ bào, tác động lên hai bước trình phân chia te´ˆ bào (phân nhân phân bào), thúc đẩy trình phát sinh chồi phát triển chồi, ne´ˆ u auxin kích thích phân chia te´ˆ bào mô phân sinh kéo dài te´ˆ bào vùng mô phân sinh ngọn, gibberellin kích thích phân chia te´ˆ bào mơ phân sinh lóng kéo dài lóng Sự diện chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh quye´ˆ t định phát sinh hình thái, cytokinin có vai trò quan trọng Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ – Khoa học Tự nhiên, 3(1):18-28 điều chỉnh hoạt động phân chia te´ˆ bào 10 Cytokinin có vai trò đối kháng với auxin tạo chồi Hoạt tính cytokinin nội sinh (zeatin) khúc cắt mang mơ phân sinh chồi mặt diện cao mặt hơng Do đó, mơ phân sinh vị trí 2.2 khỏi trạng thái ngủ dễ hơn, the´ˆ tạo chồi mạnh Hơn nữa, nuôi cấy in vitro, phát sinh chồi hay rễ chịu ảnh hưởng tỉ lệ auxin/cytokinin Sự phát triển chồi xảy tỉ lệ thiên cytokinin (tỉ lệ auxin/cytokinin thấp) 11 Mẫu cấy vị trí 2.2 có tỉ lệ auxin/cytokinin thấp vị trí 2.1, ni cấy môi trường bổ sung BA mg/L, vị trí 2.2 khởi phát tạo chồi sớm hơn, the´ˆ tạo sơ khởi chồi nhanh chiều cao chồi sau tuần lớn chồi từ vị trí 2.1 Tất nồng độ IAA (0,5; mg/L) NAA (0,5; 1; 1,5 mg/L) ke´ˆ t hợp với BA mg/L thúc đẩy tạo chồi gia tăng chiều cao chồi Tuy nhiên sau tuần, môi trường bổ sung BA mg/L NAA 0,5 mg/L cho hiệu tăng sinh chồi cao (Bảng 6) Như vậy, nghiên cứu này, NAA 0,5 mg/L có tác động mạnh IAA 0,5 mg/L ke´ˆ t hợp với BA mg/L tăng sinh chồi Các nghiên cứu trước chứng minh auxin tác động tạo chồi phối hợp với cytokinin tác dụng phụ thuộc vào chất nồng độ auxin Escobar cộng (2002) ghi nhận phá vỡ trạng thái ngủ nụ nách nhiều lồi thuộc chi Opuntia thơng qua việc sử dụng cytokinin riêng lẻ hay phối hợp với nhân tố khác 12 Nhiều loại cytokinin thích hợp để khởi phát tăng sinh chồi xương rồng lê gai, đó, BA có hiệu kinetin 2iP4 Trong tăng sinh chồi xương rồng lê gai Opuntia ficus-indica, auxin ảnh hưởng khác lên tăng sinh chồi BA mg/L riêng lẻ cho hiệu tốt tạo chồi tốt , phối hợp BA NAA khơng có hiệu rõ rệt tăng sinh chồi Đe´ˆ n 2013, El Finti cộng ghi nhận, bổ sung BA vào môi trường nuôi cấy làm tăng số chồi, có khác biệt giống xương rồng Maroc khác 13 Tuy nhiên, Ghaffari cộng (2013) 14 chứng minh có khác biệt số chồi tạo mơi trường bổ sung chất điều hòa tăng trưởng thực vật khác nhau: giai đoạn phát triển chồi, phối hợp IAA 0,5 mg/L với BA mg/L cho hiệu nhân chồi cao nhất, phối hợp NAA 0,25 mg/L với BA mg/L cho chiều cao chồi lớn Từ tác giả ke´ˆ t luận biệt hóa chồi q trình tương tác auxin cytokinin Do đó, tùy thuộc vào giống điều kiện sinh lý mẫu cấy mà có phối hợp chất điều hòa tăng trưởng thực vật khác để tăng sinh chồi Sự phối hợp BA mg/L với IAA hai nồng độ 0,5 mg/L làm tăng số chồi chiều cao trung bình chồi so với mơi trường chứa BA mg/L (Bảng 6) Vì IAA auxin tự nhiên có tác động ye´ˆ u nên với hai nồng độ IAA sử dụng (0,5 mg/L) phối hợp với BA mg/L không làm thay đổi đáng kể số chồi chiều cao chồi Việc xử lý auxin có tác dụng kích thích tăng trưởng nồng độ tối hảo thường gặp thể thực vật, nồng độ cao trái lại ức che´ˆ tăng trưởng trở thành độc tố Do đó, auxin (NAA 0,5; 1; 1,5 mg/L) diện, phối hợp hoạt động cytokinin tổng hợp (BA mg/L) có hiệu tăng sinh chồi lẫn kéo dài chồi gia tăng nồng độ NAA, số chồi chiều cao chồi giảm rõ rệt Tất xử lý tác động lên mô phân sinh chồi giúp gia tăng số lượng chồi hình thành Số chồi hình thành cao mẫu cấy cắt bỏ phần bề mặt mơ phân sinh chồi (2,90 chồi/mẫu cấy), thấp mẫu cấy hủy mô phân sinh chồi kim (2,20 chồi/mẫu cấy) Sự khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng: 1,50 chồi/mẫu cấy (Bảng 7) Bình thường, nhu cầu đường cao chồi hạn che´ˆ đường chuyển vị tới nụ (nụ nách), đó, cản nụ nách tăng vượt Khi cắt ngọn, nụ bắt đầu ưu tính trước lượng auxin thay đổi thân cạnh nụ, đường nhanh chóng phân phối lại tích tụ nụ Sau cắt bỏ chồi chính, cạn kiệt auxin dọc theo thân không theo thời gian không gian, nên nụ phần thân thoát hiệu ứng auxin trước nụ phần Khi gia tăng mức độ tổn thương, số chồi nách giảm giới hạn mơ phân sinh chồi nách Trong đó, số chồi bất định (thường cảm ứng ve´ˆ t thương) tăng lên 15 Do đó, dùng kim hủy mơ phân sinh chồi, hình thành chồi xảy vị trí chồi nách, thay the´ˆ cho mô phân sinh chồi bị phá hủy, cắt bỏ bề mặt mô phân sinh chồi, chồi hình thành vị trí gốc ve´ˆ t cắt vị trí chồi nách KẾT LUẬN Sự phát sinh chồi từ khúc cắt mang mô phân sinh chồi xương rồng lê gai qua giai đoạn: hoạt hóa phân chia te´ˆ bào, tạo vùng phát sinh hình thái chồi, hình thành mô phân sinh chồi cuối chồi với phác thể Việc loại bỏ túm lông làm tăng tốc độ phát triển chồi, khúc cắt mang mô phân sinh loại bỏ túm lông ln có cường độ hơ hấp cao Vị trí mang mơ phân sinh chồi mặt diện thuộc phần nhánh cho hiệu tạo chồi cao Vị trí có cường độ quang hợp, hơ hấp, hoạt tính IAA, zeatin nội sinh cao vị trí lại Mơi trường MS bổ sung BA mg/L NAA 0,5 mg/L kích thích mạnh tạo cụm 26 Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ – Khoa học Tự nhiên, 3(1):18-28 chồi Việc hủy mơ phân sinh chồi cách cắt bỏ bề mặt cho số chồi tạo thành cao DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 2iP: 2-isopentyl adenine ABA: Abcisic acid BA: 6-Benzylaminopurine GA3: Gibberellic acid IAA: indol acetic acid IBA: indol butyric acid MS: Murashige Skoog NAA: 1-naphtalene acetic acid SAM: Shoot Apical Meristem TLK: Trọng lượng khơ TLT: Trọng lượng tươi XUNG ĐỘT LỢI ÍCH Tác giả khẳng định khơng có xung đột lợi ích ĐÓNG GÓP CỦA TÁC GIẢ Nguyễn Thị Cẩm Dun đóng góp trực tie´ˆ p tie´ˆ n hành thí nghiệm, thu thập xử lý số liệu, vie´ˆ t thảo Bùi Trang Việt Trần Thanh Hương đóng góp quan trọng phân tích giải thích ke´ˆ t thảo TÀI LIỆU THAM KHẢO Finti AE, Boullani RE, Ayadi FE, Aabd NA, Mousadik AE Micropropagation in vitro of Opuntia ficus-indica in south of Morocco Int J Chem Biochem Sci 2012;1:6–10 Available from: 10.17660/ActaHortic.2013.995.11 Osuna-Martínez U, Reyes-Esparza J, Rodríguez-Fragoso L Cactus (Opuntia ficus-indica): a review on its antioxidants properties and potential pharmacological use in chronic diseases Natural Products Chemistry Research 2014;2(6):153 Available from: 10.4172/2329-6836.1000153 27 Ye´ˆ n TTO Nghiên cứu tính đa dạng di truyền chi Opuntia Hylocereus ứng dụng thị phân tử chọn tạo giống Hylocereus có hàm lượng Betalain cao Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM; 2014 Khalafalla MM, Abdellatef E, Ahmed MMM, Osman MG Micropropagation of sweet potato (I batatas) grows regularly International Journal for sustainable crop production 2007;2007(2):1–8 de Arruda ECP, de Melo-de Pinna GF Anatomical characters of stem segments in species of Opuntioideae (Cactaceae) subfamily Hoehnea 2015;42(2):195–205 Available from: 10.1590/2236-8906-12/2014 Trương-Thị-Đẹp Thực vật Dược Việt Nam: NXB Giáo dục; 2016 Bùi-Trang-Việt Sinh lý Thực vật đại cương Tp Hồ Chí Minh: NXB Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh; 2016 Litwack G Plant hormones Gulf Professional Publishing; 2005 George EF Plant Tissue Culture Procedure-Background In: George EF, Hall MA, Klerk GJ, editors Plant propagation by tissue culture: The Background; 2008 10 Wang R, Estelle M Diversity and specificity: auxin perception and signaling through the TIR1/AFB pathway Current opinion in plant biology 2014;21:51–58 Available from: 10.1016/j.pbi 2014.06.006 11 Hương TT, Việt BT, Teng-Yung F Vai trò chất điều hòa tăng trưởng thực vật hình thành rễ bất định từ khúc cắt mang chồi vài giống chuối (Musa sp.) Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ 2009;12(9):23–30 12 Escobar MA, Leslie CA, McGranahan GH, Dandekar AM Silencing crown gall disease in walnut (Juglans regia L.) Plant Science 2002;163(3):591–597 13 Finti AE, Boullani RE, Naima A, Msanda F, Serghini M, Mousadik AE In vitropropagation of three moroccan prickly pear cactus Opuntiaand plant establishment in soil Not Sci Biol 2013;5(1):39–44 Available from: 10.15835/nsb518354 14 Ghaffari A, Hasanloo T, Nekouei MK Micropropagation of tuna (Opuntia ficus) and effect of medium composition on proliferation and rooting Int J Biosci 2013;3:129–39 15 Klimešová J, Malíková L, Rosenthal J, Smilauer P Potential bud bank responses to apical meristem damage and environmental variables: matching or complementing axillary meristems? PLoS One 2014;9(2):e88093 Available from: 10.1371/journal pone.0088093 Science & Technology Development Journal – Natural Sciences, 3(1):18- 28 Research Article Studying on the in vitro shoot formation of Opuntia ficus – indica (L.) Mill Nguyen Thi Cam Duyen1,∗ , Bui Trang Viet2 , Tran Thanh Huong2 ABSTRACT This study presented the elimination of the glochids in the areoles of Opuntia ficus-indica cladode induced the shoot formation from the explants containing the shoot apical meristem (SAM) on Murashige and Skoog medium (MS) supplemented with 6-benzylaminopurine (BA) mg/L Morphological and physiological changes in shoot formation process were analyzed This process involved the constant stages: activation of cell division, initiating of meristematic region; formation of shoot primordium and shoot with leaves The SAM position in the upper front of the cladode gave the highest shoot productivity This position had the photosynthesis rate, respiration rate, endogenous indole acetic acid (IAA) and zeatin activity higher than the others Difference of auxin concentrations increased the amount of shoots and shoot height The maximum number of shoots per explant was obtained on MS medium supplemented with BA mg/L and 1-naphthalene acetic acid (NAA) 0.5 mg/L The elimination of SAM by removing the surface of the shoot gave the highest number of the shoot The correlation of the glochids in the areoles, explant position, plant hormones, photosynthesis rate respiration rate and shoot formation were discussed Key words: Cactus, Glochids, Opuntia ficus-indica, Shoot formation Nguyen Tat Thanh University University of Sciences, VNUHCM Correspondence Nguyen Thi Cam Duyen, Nguyen Tat Thanh University Email: ntcamduyen@gmail.com History • Received: 14-11-2018 • Accepted: 09-01-2019 • Published: 31-03-2019 DOI : https://doi.org/10.32508/stdjns.v3i1.714 Copyright © VNU-HCM Press This is an openaccess article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution 4.0 International license Cite this article : Thi Cam Duyen N, Trang Viet B, Thanh Huong T Studying on the in vitro shoot formation of Opuntia ficus – indica (L.) Mill Sci Tech Dev J - Nat Sci.; 3(1):18-28 28 ... tự phát sinh chồi từ mô phân sinh chồi nhiều loài thực vật, phát sinh chồi từ khúc cắt mang mô phân sinh chồi xương rồng lê gai qua giai đoạn: hoạt hóa phân chia te´ˆ bào, tạo vùng 25 phát sinh. .. tăng sinh chồi xương rồng lê gai Opuntia ficus- indica, auxin ảnh hưởng khác lên tăng sinh chồi BA mg/L riêng lẻ cho hiệu tốt tạo chồi tốt , phối hợp BA NAA khơng có hiệu rõ rệt tăng sinh chồi. .. hơn, the´ˆ tạo chồi mạnh Hơn nữa, nuôi cấy in vitro, phát sinh chồi hay rễ chịu ảnh hưởng tỉ lệ auxin/cytokinin Sự phát triển chồi xảy tỉ lệ thiên cytokinin (tỉ lệ auxin/cytokinin thấp) 11 Mẫu