Khảo sát hoạt tính β-glucosidase từ cổ khuẩn siêu chịu nhiệt Pyrococcus furiosus để ứng dụng trong sản xuất isoflavone từ đậu nành

Isoflavone là một nhóm hợp chất polyphenol được tìm thấy với nồng độ cao trong đậu nành và các sản phẩm từ đậu nành. Tuy nhiên, hầu hết trong số chúng được hấp thụ thấp trong dạ dày vì ở dạng glycosyl hóa, một hoặc nhiều phân tử đường gắn với vòng thơm hoặc nhóm hydroxyl của isoflavone. Việc giải phóng các phân tử đường này từ dạng glycoside sang dạng aglycone sẽ giúp isoflavone được hấp thụ tốt và tăng các hoạt tính sinh học tiềm năng như: khả năng chống oxy hóa, giảm cholesterol và hoạt tính tương tự như hoocmon estrogen. Quá trình này cần sự xúc tác của enzyme β-glucosidase. Trong bài viết này, các tác giả khảo sát hoạt tính và khả năng chịu nhiệt của enzyme β-glucosidase từ cổ khuẩn Pyrococcus furiosus. Gen celB mã hóa β-glucosidase được biểu hiện dưới dạng hòa tan trong tế bào chủ E. coli nhờ dung hợp với đuôi Glutathione-S-tranferase (GST), chiếm 17,05% tổng protein tan nội bào trước tinh chế và đạt 57,5% sau tinh chế. Hoạt tính của enzyme đối với cơ chất 4-nitrophenylβ-D-glucopyranoside (pNPG) được tối ưu ở 100o C, pH 5,0; hoạt tính riêng 164,44 U.mg-1; giá trị Km, Vmax, Kcat lần lượt ghi nhận là 0,088 mM, 332,27 U.mg-1.min-1 và 446,9 s-1.Việc dung hợp GST không ảnh hưởng đến khả năng chịu nhiệt. Khảo sát thành công hoạt tính enzyme đối với các hợp chất glycoside từ đậu nành, hầu hết genistin và daidzin chuyển đổi thành các dạng aglycone tương ứng là genistein và daidzein.

Khoa học Kỹ thuật Công nghệ Khảo sát hoạt tính β-glucosidase từ cổ khuẩn siêu chịu nhiệt Pyrococcus furiosus để ứng dụng sản xuất isoflavone từ đậu nành Đinh Nguyễn Tấn Hòa1, Hồng Trọng Minh Qn1, Phan Hồng Mỹ Linh2, Nguyễn Thị Bạch Huệ1, 2* Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học phân tử, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh Trung tâm Nghiên cứu hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh Ngày nhận 20/12/2018; ngày gửi phản biện 31/12/2018; ngày nhận phản biện 29/3/2019; ngày chấp nhận đăng 19/4/2019 Tóm tắt: Isoflavone nhóm hợp chất polyphenol tìm thấy với nồng độ cao đậu nành sản phẩm từ đậu nành Tuy nhiên, hầu hết số chúng hấp thụ thấp dày dạng glycosyl hóa, nhiều phân tử đường gắn với vòng thơm nhóm hydroxyl isoflavone Việc giải phóng phân tử đường từ dạng glycoside sang dạng aglycone giúp isoflavone hấp thụ tốt tăng hoạt tính sinh học tiềm như: khả chống oxy hóa, giảm cholesterol hoạt tính tương tự hoocmon estrogen Q trình cần xúc tác enzyme β-glucosidase Trong viết này, tác giả khảo sát hoạt tính khả chịu nhiệt enzyme β-glucosidase từ cổ khuẩn Pyrococcus furiosus Gen celB mã hóa β-glucosidase biểu dạng hòa tan tế bào chủ E coli nhờ dung hợp với đuôi Glutathione-S-tranferase (GST), chiếm 17,05% tổng protein tan nội bào trước tinh chế đạt 57,5% sau tinh chế Hoạt tính enzyme chất 4-nitrophenylβ-D-glucopyranoside (pNPG) tối ưu 100oC, pH 5,0; hoạt tính riêng 164,44 U.mg-1; giá trị Km, Vmax, Kcat ghi nhận 0,088 mM, 332,27 U.mg-1.min-1 446,9 s-1 Việc dung hợp GST không ảnh hưởng đến khả chịu nhiệt Khảo sát thành cơng hoạt tính enzyme hợp chất glycoside từ đậu nành, hầu hết genistin daidzin chuyển đổi thành dạng aglycone tương ứng genistein daidzein Từ khóa: chịu nhiệt, đậu nành, Pyrococcus furiosus, thủy phân isoflavone, β-glucosidase Chỉ số phân loại: 2.10 Đặt vấn đề Isoflavone polyphenol dị vòng có cấu trúc tương đồng với hợp chất 17 β-estrogen người, có nhiều họ đậu, đặc biệt đậu nành [1] Các nghiên cứu cho thấy, nhóm hợp chất có tác dụng trình chống oxy hóa, bổ sung nội tiết tố, đặc biệt ngăn chặn q trình lão hóa da; giúp phòng ngừa điều trị nhiều loại bệnh tim mạch, loãng xương, ung thư, tiểu đường… [1, 2] Isoflavone dạng glycoside chiếm hàm lượng cao đậu nành, nhiên, hoạt tính sinh học thấp khó hấp thụ vào thể Trong đó, isoflavone dạng aglycone có hoạt tính sinh học cao, dễ hấp thu chiếm hàm lượng thấp đậu nành [3] Isoflavone aglycone thu nhận từ dạng isoflavone glycoside tương ứng thơng qua việc loại bỏ gốc đường nhờ hoạt tính xúc tác enzyme β-glucosidase [EC 3.2.1.21] Đây enzyme xúc tác phản ứng thủy phân liên kết glycosidic để giải phóng phân tử β-D-glucose từ đầu khơng khử hợp chất glycoside oligosaccharide [4] β-glucosidase thu nhận từ số loài vi sinh vật thông thường phương pháp lên men [5-7] Tuy nhiên, phương pháp gặp nhiều khó khăn, chủ yếu hoạt tính enzyme vi sinh thu nhận thấp nên thời gian thủy phân lâu, dễ tạp nhiễm [3]; dễ bị ức chế độ nhớt, nồng độ glucose cao [8] Cách đơn giản để giải vấn đề tăng nhiệt độ, vừa tiêu diệt vi khuẩn, làm giảm độ nhớt dung dịch, vừa làm tăng tốc độ phản ứng Vì vậy, nghiên cứu hướng tới việc thu nhận enzyme β-glucosidase từ cổ khuẩn Pyrococcus furiosus Đây cổ khuẩn siêu chịu nhiệt, có nhiệt độ tối thích lên tới 100oC với hệ enzyme protein có khả kháng nhiệt xạ [9] Các nghiên cứu cho thấy, P furiosus β-glucosidase (BGLPf) có nhiệt độ tối ưu 102-105oC; khơng bị ức chế HgCl2 (1 mM), N-ethylmaleimide (5 mM), iodoacetamide (2 mM); enzyme có tính bền nhiệt cao với thời gian bán rã 85 100oC 13 110oC [10] Trong nghiên cứu này, tiến hành khảo sát điều kiện tối ưu thông số động học cho hoạt tính enzyme BGLPf chất nhân tạo pNPG bước đầu thử nghiệm hoạt tính hợp chất isoflavone glycoside đậu nành Tác giả liên hệ: Email: ntbhue@hcmus.edu.vn * 61(8) 8.2019 60 Khoa học Kỹ thuật Công nghệ Study on β-glucosidase activity from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus for application in the hydrolysis of soy isoflavone glycosides Nguyen Tan Hoa Dinh1, Trong Minh Quan Hoang1, Hoang My Linh Phan2, Thi Bach Hue Nguyen1, 2* Lab of Molecular and Environmental Biotechnology, University of Science, Vietnam National University, Ho Chi Minh city Research Center for Bioactive Natural Products, University of Science, Vietnam National University, Ho Chi Minh city Received 20 December 2018; accepted 19 April 2019 Abstract: Isoflavones  are a class of polyphenolic compounds found with the high concentration in soybeans and soy products However, most of them are low absorbed in the human stomach as glycosylated forms, one or more sugar molecule(s) conjugated to the aromatic ring or a hydroxyl group The release of the sugar molecule(s) from the isoflavone  glycoside results in an isoflavone  aglycone, one of the best-absorbed polyphenols with the high potential of estrogenic, cholesterol-lowering and  antioxidation improvement To convert these glycosides into the corresponding aglycone forms, the β-glucosidase enzyme is required In this article, the authors investigate the thermophilic ability and catalytic activity of β-glucosidase enzyme from the archaeon Pyrococcus furiosus The celB gene encoding the β-glucosidase is expressed as the soluble form in E coli host cells by binding to the GlutathioneS-tranferase (GST) tag with 17.05% and 57.5% yields of total intracellular soluble before and after purification, respectively Enzymatic activity using 4-nitrophenylβ-D-glucopyranoside (pNPG) as a substrate has been optimised at 100°C, pH 5.0; specific activity is 164.44 U.mg-1; the values ​​of Km, Vmax and Kcat are respectively 0.088 mM, 332.27 U.mg-1.min-1 and 446.9 s-1 The enzyme shows the catalytic activity on soybean glycoside compounds, most genistin and daidzin are converted into the corresponding aglycone forms, genistein and daidzein, respectively Keywords: isoflavone hydrolysis, Pyrococcus furiosus, soybean, thermophilic, β-glucosidase Classification number: 2.10 61(8) 8.2019 Vật liệu phương pháp nghiên cứu Chủng, môi trường Tế bào chủ biểu E coli BL21/pGEX-2TK-celB cung cấp Phòng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học phân tử, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh Mơi trường LB (g.l-1): trypton 10 g, cao nấm men g, NaCl g, agar 20 g môi trường LB ampicilin 100 g.ml-1; tất môi trường hấp vô trùng 121oC, 20 phút, làm nguội bổ sung ampicilin (nếu có) trước thao tác Cảm ứng thu nhận β-glucosidase Hoạt hóa qua đêm (14-16 giờ) khuẩn lạc E coli/BL21pGEX-2TK-celB ống nghiệm ml LB ampicillin 37oC, 250 vòng/phút Cấy truyền tỷ lệ 1:20 sang ống nghiệm ml LB ampicillin nuôi lắc 37oC, 250 vòng/phút đến OD đạt 0,8-1,0 Bổ sung 0,1 mM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) (Bio-basic) nồng độ cuối vào dịch nuôi, tiếp tục nuôi lắc 37oC, 250 vòng/phút [11] Thu nhận 1,5 ml dịch ni cấy, ly tâm 5.000 vòng/phút phút loại dịch, hòa sinh khối lại 400 μl nước cất vơ trùng Phá tế bào sóng siêu âm 50 Hz, chu kỳ, chu kỳ 15-20 giây; hút 50 ul làm pha tổng Phần lại ly tâm 13.000 vòng/phút phút 4oC, thu 50 μl dịch làm pha tan Hòa tủa 350 μl nước cất vô trùng, hút 50 μl làm pha tủa Bổ sung pha tổng, tan, tủa 10 μl Sample 6X, đun 100oC 15 phút, làm lạnh nhanh Tiến hành điện di SDS-PAGE gel polyacryamide 15%; nhuộm gel, giải nhuộm xác định độ tinh phần mềm ImageJ Tiến hành định lượng protein phương pháp đo Bradford với tỷ lệ V mẫu:V thuốc thử Bradford = 1:4 Tinh β-glucosidase xác định nồng độ sau tinh chế Phần tan lọc qua lọc có kích thước lỗ lọc 0,2 μM, chuyển vào cột GraviTrap chứa sẵn ml Glutathione Sepharose 4B (GE Healthcare) Cột rửa lại hai lần với 5V PBS, pH 7,3 để loại bỏ protein không liên kết Protein ly giải nhờ 15 mM Glutathione khử (Merck-Millipore) 50 mM dung dịch TrisHCl, pH 8,0 Xác định kích thước độ tinh protein nhờ điện di SDSPAGE phần mềm ImageJ Khảo sát điều kiện tối ưu BGL chất pNPG Nhiệt độ khảo sát từ 60-100oC pH từ 4,0-6,0 Phản ứng thực 500 μl, bao gồm: 6,45 μg BGLPf, mM pNPG (Sigma), 50 mM đệm citrate phosphate pH khảo sát Tiến hành phản ứng phút nhiệt độ khảo sát Bổ sung 500 μl dung dịch M Na2CO3 dừng phản ứng Đo OD bước sóng 405 nm [3] Xác định hoạt tính hoạt tính riêng enzyme chất pNPG Đường chuẩn p-nitrophenol (pNP) (Sigma) thực dãy nồng độ từ 0-200 μM đệm citrate phostphate, pH tối ưu Kết ghi nhận OD 405 nm 61 Khoa học Kỹ thuật Công nghệ thiết đó, protein nàyở nằm Phản ứng thực 500 μl, bao gồm: 6,45Kếtμgquả ở(giếng hình 12) cho thấy,như xuấtgiả vạchBên mụccạnh tiêu khoảng 80 kDa mẫu hoàn có cảm ứng nhiệt độ khảo sát Bổ sung 500 dung dịch 1M Na CO dừng phản ứng Đo OD bước BGLPf, mM pNPG, 50 mM đệm citrate phosphate pH tối toàn pha tan chiếm 17,04% tổng protein tan E coli (giếng 3) so với mẫu không cảm ứng (giếng 2) giả thiết Bên cạnh đó, protein nhiệt độ khảo sát Bổ sung 500 dung dịch 1M Na22CO33 dừng phản ứng Đo OD bước nàysung nằm hoàn toàn pha tan chiếm 17,04% tổng protein tan E coli sóng 405 nm [3] sóng 405 nm phản [3] ứng phút nhiệt độ tối ưu Bổ ưu Tiến hành định riêng enzyme đối Xácdung định hoạt hoạt tính hoạt tính riêng enzyme đối ởvới với chất chất pNPG: pNPG: CO3tính dừng phảncủa ứng Đo OD bước 500 Xác μl dịch 1tính M Nahoạt Đường chuẩn p-nitrophenol (pNP) (Sigma) thực dãy nồng nồng độ độ từ từ 00sóngĐường 405 nm.chuẩn p-nitrophenol (pNP) (Sigma) thực dãy 200 200 M M trong đệm đệm citrate citrate phostphate, phostphate, pH pH tối tối ưu ưu Kết Kết quả ghi ghi nhận nhận ởở OD OD 405 405 nm nm Phản ứng bao gồm: gg BGLPf, Dựa pNP,hiện xáctrong định 500 lượng chất bị 6,45 phân cắt Từ 11 mM Phảnvào ứngđường thực thực 500 ,,cơ bao gồm: 6,45 BGLPf, mM pNPG, pNPG, 50 50 mM mM phosphate ởở pH Tiến hành ứng 55 phút đệm citrate phosphate pH tối ưu Tiến hành phản ứng trong phút ởở nhiệt nhiệt độ độ tối tối ưu ưu Bổ Bổ đó,đệm tínhcitrate tốn hoạt tính tối hoạtưu tính riêng củaphản enzyme với định sung 500 dung dịch 1M CO dừng phản ứng bước sung 500 đơn dung dịchtính 1M Na Na2unit) dừng phản ứng Đo Đo OD bước sóng sóng 405 405 nm nm nghĩa: vị hoạt (1 lượng enzyme cầnOD đểởởphân CO33 Dựa vào xác định chất bị Từ Dựa toàn vào đường đường pNP, xác định1lượng lượng cơđiều chấtkiện bị phân phân cắt Từ đó, đó, tính tính tốn tốn được hoạt hoạt cắt hoàn μM pNP, chất phút ởcơ tối ưucắt [12]; tính hoạt tính riêng enzyme với định nghĩa: đơn vị hoạt tính (1 unit) lượng -1 tính hoạt tính riêng enzyme với định nghĩa: đơn vị hoạt tính (1 unit) lượng hoạt tính riêng (U.mg ) số đơn vị hoạt tính mg protein enzyme để phân kiện tối enzyme cần phân cắt cắt hoàn hoàn toàn toàn 11 M M cơ chất chất trong 11 phút phút ởở điều tối ưu ưu [12]; [12]; hoạt hoạt mẫu Hoạtcần tínhđểriêng xác định độ tinh enzyme mục tiêuđiều kiện -1 tính tính riêng riêng (U.mg (U.mg-1)) là số số đơn đơn vị vị hoạt hoạt tính tính trên 11 mg mg protein protein mẫu mẫu Hoạt Hoạt tính tính riêng riêng xác xác định định mẫu.sạch độ độ tinh tinh enzyme enzyme mục mục tiêu tiêu trong mẫu mẫu Hoạt tính (U) ;; ; Hoạt Hoạt Hoạt Hoạttính tính(U) (U)=== Hoạt tính tính riêng riêng == :: lượng enzyme BGLPf phản ứng; :: số đó: lượng enzyme BGLPf phản ứng; số mol mol cơ chất chất pNPG pNPG bị bị đó:đó: mBGLPf : lượng enzyme BGLPf phản ứng; npNGP: số phân phân cắt Hình Kết điện di kiểm tra khả mol cắt chất pNPG bị phân cắt biểu BGLPf Động Hìnhprotein Kết điệngiếng di kiểm khả biểumơi hiệntrường BGLPf.có 0,1 mM IPTG; Động học học enzyme enzyme BGLPf BGLPf nhờ nhờ phương phương pháp pháp Lineweaver-Burk Lineweaver-Burk Giếng 1: thang LMW; 2: E.tra coli BL21 Giếngtổng, 1: thang giếng 2: E môi trường có 0,1 mM mơi Động enzymeđược BGLPf pháp Nồng độ khảo sát từ M giếng 3-5: pha tanprotein tủaLMW; tương ứng củacoli E BL21 coli BL21/pGEX-2TK-celB Nồnghọc độ pNPG pNPG khảonhờ sátphương từ 0-2000 0-2000 M.Lineweaver-Burk IPTG; 3-5:nồng pha tổng, có 0,1 mMgiếng IPTG Phản gg BGLPf, pNPG ởở độ Phản ứng ứng được thực thực hiện trong 500 500 ,, bao bao gồm: gồm: 6,45 6,45 trường BGLPf, pNPG nồng độ tan tủa tương ứng E coli BL21/pGEX-2TK-celB Nồng độ50pNPG citrate khảo sát từ 0-2000ở μM trong-glucosidase mơi trường cóvà 0,1 ởmMđịnh IPTG Tinh nồng độ sau tinh chế khảo phản khảo sát, sát, 50 mM mM đệm đệm citrate phosphate phosphate pH pH tối tối ưu ưu Tiến Tiến hành hành phản ứng ứng trong 55 phút phútxác Kết hình cho thấy, phần lớn protein tạp rửa khỏi cột sau lần rửa nhiệt độ tối ưu Bổ sung 500 dung dịch 1M Na CO dừng phản ứng Đo OD bước nhiệt độ tối ưu Bổ sung 500 dung dịch 1M Na CO dừng phản ứng Đo OD bước Phản ứng thực 500 μl, bao gồm: 6,452 μg3BGLPf, thứ nhất, hầusạch hết BGLPf giữvà lạixác (vạch 80 kDa) 57,5% Tinh β-glucosidase định nồngchiếm độ sau tinh chế sóng vào pNP, xác lượng bị Vẽ sóng ở405 405 nm Dựa vào đường đường chuẩn pNP,citrate xác định định lượng ởlượng lượng chất bị phân phân cắt cắt Vẽ pNPG cácnm nồngDựa độ khảo sát, 50chuẩn mM đệm phosphate pH chất đồ thị Lineweaver-Burk, tính tốn giá trị K , V K thịTiến Lineweaver-Burk, tính giá trị Kđộ Vmax Kcat m m , tối max cat Kết hình cho thấy, phần lớn protein tạp rửa tốiđồưu hành phản ứng trongtoán phút nhiệt ưu.vàBổ sung đậu nành Thử Thử nghiệm nghiệm hoạt hoạt tính tính enzyme enzyme trên hợp hợp chất chất isoflavone isoflavone từ từ đậu nành bằng phương phương khỏi cột sau lần rửa thứ nhất, hầu hết BGLPf 500 μl dung dịch M Na CO dừng phản ứng Đo OD bước pháp sắc ký lỏng hiệu cao pháp sắc ký lỏng hiệu cao giữ lại (vạch 80 kDa) sóngHòa 405 nm Dựa vào đường chuẩn pNP, xác định lượng chất tan 20 g bột đậu nành nghiền mịn vào 100 ml ether dầu hỏa Phá tế bào Hòa tan 20 g bột đậu nành nghiền mịn vào 100 ml ether dầu hỏa Phá tế bào chiếm 57,5% bịUltra phân turax cắt Vẽ đồ thị Lineweaver-Burk, giá từ trị , độ 33 phút; khuấy máy khuấy Ultra turax phút; khuấy đều dịch dịchtính bằngtốn máycác khuấy từ ởK mnhiệt nhiệt độ phòng phòng trong vòng vòng phút; ly tâm 10.000 vòng/phút, 15 phút, thu tủa Lặp lại bước hai lần Bột sau V30 K 30 phút; ly tâm 10.000 vòng/phút, 15 phút, thu tủa Lặp lại bước hai lần Bột sau max cat khi đã ủủ khơ khơ tự tự nhiên nhiên được hòa hòa lại lại trong 100 100 ml ml methanol methanol 80% 80% (v/v); (v/v); phá phá tế tế bào bào bằng o Thửturax nghiệm tínhkhuấy enzyme chất từ80 Ultra 33 phút; dịch khuấy Ultra turax tronghoạt phút; khuấy đềutrên dịchhợp mấyisoflavone khuấy từ từ ởở 80oC C trong 22 giờ; giờ; ly ly tâm tâm đậu nành phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao 10.000 10.000 vòng/phút, vòng/phút, 15 15 phút, phút, thu thu dịch; dịch; cô cô quay quay thu thu nhận nhận cao cao tổng tổng [13] [13] Tiến hành thủy phân 0,15g cao tổng ởở nhiệt độ tối ưu 11 ml Tiếntan hành 0,15gđã cao tổng mịn nhiệt ml dung dung dịch dịch đệm đệm citrate citrate Hòa 20 thủy g bộtphân đậu nành nghiền vàođộ 100tốimlưuether dầu Kết tiến hành tinh chế BGLPf phosphate đủ ly thu phosphate pH pH tối tối ưu, ưu, 21,5 21,5 gg BGLPf, BGLPf, bổ bổ sung sung nước nước cất cấtHình đủ 222.ml; ml; tiến hành ly tâm tâm thu hỏa Phá tế bào Ultra turax phút; khuấy dịch Giếng 1: protein tổng; giếng dịch qua cột; giếng 3, 4: dịch sau rửa cột lần 2; giếng dịch, thu nhận dung dịch, cô cô quay quay thu thu cao, cao, cân cân khối khối lượng lượng Hòa Hòa tan tan cao cao thu nhận trong dung 2:môi môi máy khuấy từ nhiệt độ phòng vòng 30 phút; ly tâm 10.000 5: thang protein LMW; giếng 6, 7: dịch dung ly lần MeOH:DMSO = 4:1 nồng độ 10.000 ppm; tiến hành chạy HPLC pha đảo, sử dụng MeOH:DMSO = 4:1 nồng độ 10.000 ppm; tiến hành chạy HPLC pha đảo, sử dụng vòng/phút, 15 phút, thu tủa Lặp lại bước hai lần Bột sau cột Macherey Nagel, CC Kromasil, 125x4 mm, m 100A, C18 với quy trình: 0-100% cột Macherey Nagel, CC Kromasil, 125x4 mm, m 100A, C18 với quy trình: 0-100% ủ0,5 khơ tự nhiên hòa 100AcN, ml methanol 80% AcN, ml/phút 15 100-100% 0,5 phút; 100-0% AcN, AcN, 0,5 ml/phút 15 phút; phút;lại 100-100% AcN, 0,5 ml/phút ml/phút phút; 100-0% Khảo sát4điều kiện tối ưu AcN, BGL chất pNPG 0,5 11 phút; 0-0% 0,5 thời 25 phút Đối (v/v); phá tế bào Ultra turaxAcN, phút; khuấy dịch Hìnhlưu: Kết 0,5 ml/phút ml/phút phút; 0-0% AcN, 0,53ml/phút ml/phút 5đều phút; phút; thời gian gian lưu: 25 phút.tinh Đốichế BGLPf o với profile chất chuẩn thương mại:Giếng 1: protein tổng; giếng 2: dịch qua cột; giếng 3, 4: dịch sau rửa cột lần chiếu kết thu genistein chiếu kếtkhuấy từ thuở nhận nhận 2với chuẩn thương mại: daidzein, daidzein, genistein C giờ;profile ly tâm chất 10.000 vòng/phút, 80 2; giếng 5: thang protein LMW; giếng 6, 7: dịch dung ly lần (Sigma) 15(Sigma) phút, thu dịch; cô quay thu nhận cao tổng [13] Kết Kết quả và bàn bàn luận luận Tiến hành thủy phân 0,15g cao tổng nhiệt độ tối ưu Cảm ứng nhận -glucosidase Cảmdịch ứngđệm thu thu nhậnphosphate -glucosidase ml dung citrate pH tối ưu, 21,5 μg BGLPf, bổ sung nước cất đủ ml; tiến hành ly tâm thu dịch, cô quay thu cao, cân khối lượng Hòa tan cao thu nhận dung môi MeOH:DMSO = 4:1 nồng độ 10.000 ppm; tiến hành chạy HPLC pha đảo, sử dụng cột  Macherey Nagel, CC Kromasil, 125x4 mm, μm 100A, C18 với quy trình: 0-100% AcN, 0,5 ml/phút 15 phút; 100-100% AcN, 0,5 ml/phút phút; 100-0% AcN, 0,5 ml/phút phút; 0-0% AcN, 0,5 ml/phút phút; thời gian lưu: 25 phút Đối chiếu kết thu nhận với profile chất chuẩn thương mại: daidzein, genistein (Sigma) Kết bàn luận Khảo sát điều kiện tối ưu BGL chất pNPG Kết khảo sát cho thấy enzyme hoạt động tối ưu điều kiện (hình nhiệt độkhảo 100sátoC, 44enzyme Kết chopH thấy5,0 hoạt3) động tối ưu điều kiện nhiệt độ 100o C, pH 5,0 (hình 3) 0,800-1,000 0,600-0,800 0,400-0,600 0,200-0,400 0,000-0,200 1,000 0,800 0,600 0,400 Nhiệt độ 100 0,200 Nhiệt độ 80 0,000 Cảm ứng thu nhận β-glucosidase Kết hình cho thấy, xuất vạch mục tiêu khoảng 80 kDa mẫu có cảm ứng (giếng 3) so với mẫu không cảm ứng 61(8) 8.2019 4,0 4,5 5,0 pH 5,5 6,0 Nhiệt độ 60 Hình Kết quả khảo khảo sát ều tối kiện ưu chotối ho ạt BGLPf Hình Kết sátkiện điều ưutính chocủa hoạt tính BGLPf Nhiệt độ tối ưu cho hoạt tính tính enzyme BGLPf 100oC, cao hẳn nhiều loài vi khuẩn, nấm men, nấm mốc khác [14] Một số kết khảo sát nhiệt độ tối ưu khoảng 90-110oC ghi nhận số enzyme khác Pyrococcus furiosus [15-17] hay số enzyme thuộc nhóm hydrolase lồi chịu nhiệt khác [18] Ngồi ra, việc dung hợp GST khơng làm ảnh hưởng tới hoạt tính chịu nhiệt 62 enzyme Đối với thông số pH, kết thu nhận phù hợp với số nghiên cứu khác chủng tái tổ hợp lẫn chủng tự nhiên [10, 19, 20] Các nghiên cứu khác số enzyme thủy phân P furiosus -mannosidase, -galactosidase chất khác Khoa học Kỹ thuật Công nghệ Nhiệt độ tối ưu cho hoạt tính tính enzyme BGLPf 100oC, cao hẳn nhiều loài vi khuẩn, nấm men, nấm mốc khác [14] Một số kết khảo sát nhiệt độ tối ưu khoảng 90-110oC ghi nhận số enzyme khác Pyrococcus furiosus [15-17] hay số enzyme thuộc nhóm hydrolase loài chịu nhiệt khác [18] Ngoài ra, việc dung hợp đuôi GST không làm ảnh hưởng tới hoạt tính chịu nhiệt enzyme So với số nghiên cứu khác BGL từ cổ khuẩn P furiosus giá trị Km Vmax thấp nửa, cụ thể giá trị ghi nhận Km = 0,15 mM Vmax = 700 U.mg-1 [10, 15, 20, 21] Dự đốn, enzyme đề tài có khả bị ức chế nồng độ glucose cao Lập luận dựa sở hàm lượng glucose, tức sản phẩm q trình thủy phân, có nồng độ cao gây ức chế ngược lại hoạt động enzyme β-glucosidase [8, 24] Đối với thông số pH, kết thu nhận phù hợp với số nghiên cứu khác chủng tái tổ hợp lẫn chủng tự nhiên [10, 19, 20] Các nghiên cứu khác số enzyme thủy phân P furiosus β-mannosidase, β-galactosidase chất khác [15-17] lồi có enzyme thuộc nhóm glycosyl hydrolase [14, 18] có khoảng pH tối ưu từ 5,0-7,5 Khoảng pH phù hợp với loại carbohydrate tự nhiên, nhờ có tiềm ứng dụng rộng rãi sản xuất cơng nghiệp thực phẩm Thử nghiệm hoạt tính enzyme hợp chất glycoside từ đậu nành phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Dựa vào profile chất chuẩn, hai hợp chất có thời gian lưu 13,85 phút 15,03 phút daidzein genistein Ở mẫu chưa xử lý enzyme, hai peak có thời gian lưu ngắn daidzin 11,25 phút genistin 12,15 phút (hình 5) 15,03 Xác định hoạt tính hoạt tính riêng enzyme chất pNPG Đơn vị hoạt tính hoạt tính riêng enzyme BGLPf 6,018 mg 164,44 U.mg-1, tương đương so với nghiên cứu Voorhorst cs [21] cao nhiều so với nhiều loài nấm mốc (bảng 1) Genistein Thời gian Bảng Hoạt tính riêng enzyme chất pNPG Tài liệu tham khảo 200 [21] 164 Nghiên cứu Penicillium pinophillum 83 Penicillium citrinum 0,159 Fomitopsissp 53 Aspergillus niger 1,9 124 Humicola grisea 26,1 Trichoderma reesei 23,9 13,85 B D Độ hấp thu (AU) Hoạt tính riêng (U.mg-1) Độ hấp thu (AU) Pyrococcus furiosus lưu (phút) Daidzein [8] Thời gian [22] 15,03 A C Độ hấp thu (AU) [23] Genistein Động học enzyme BGLPf nhờ phương pháp LineweaverBurk (hình 4) Kết ghi nhận giá trị động học tính tốn Km = 0,088 mM, Vmax = 332,27 U.mg-1.min-1 Kcat = 446,9 s-1 lưu (phút) D Độ hấp thu (AU) Độ hấp thu (AU) 13,84 13,85 Daidzein Hình Profile kết HPLC 61(8) 8.2019 Daidzein 15,03 Genistein Thời gian Thời gian Hình Đồ thị Lineweaver-Burk enzyme BGLPf Genistin Thời gian Thời gian B 12,15 11,35 Daidzin Độ hấp thu (AU) Nguồn thu nhận C Độ hấp thu (AU) Độ hấp thu (AU) A A Chất chuẩn Genistein; B Chất chuẩn Daidzein; C Mẫu cao không xử lý enzyme; D Mẫu cao có xử lý enzyme 63 D Khoa học Kỹ thuật Công nghệ Khi so sánh hai kết có xử lý khơng xử lý enzyme, có tăng cường hai peak daidzein genistein từ mẫu không xử lý enzyme sang mẫu có xử lý Cùng với đó, có chuyển đổi đáng kể hai peak có thời gian lưu ngắn (11,35 phút 12,15 phút) sang peak có thời gian lưu dài (13,85 phút 15,03 phút) phù hợp với việc hợp chất glycoside có tính phân cực cao bị chuyển đổi thành dạng aglycone có tính phân cực thấp nên thời gian lưu lâu Như vậy, enzyme BGLPf từ đề tài thu nhận cho hoạt tính chuyển đổi cao hợp chất isoflavone glycoside chất đậu nành [9] E Williams, T.M Lowe, J Savas, et al (2007), “Microarray analysis of the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus exposed to gamma irradiation”, Extremophiles, 11(1), pp.19-29 Kết luận [12] J Labuda, R.P Bowater, M Fojta, et al (2018), “Terminology of bioanalytical methods (IUPAC Recommendations 2018)”, Pure and Applied Chemistry, 90(7), pp.1121-1198 Enzyme β-glucosidase siêu chịu nhiệt từ cổ khuẩn Pyrococcus furiosus có hoạt tính tối ưu 100oC, pH tối ưu 5,0, hoạt tính enzyme 164,44 U.mg-1 cao nhiều so với loài nấm mốc khác Với điều kiện tối ưu này, BGLPf ứng viên triển vọng ứng dụng chuyển đổi isoflavone nói riêng hợp chất glycoside nói chung Bước đầu thử nghiệm hoạt tính đạt hiệu chuyển đổi cao chất isoflavone đậu nành LỜI CẢM ƠN Chúng xin chân thành cảm ơn GS Michael Thomm (Đại học Regensburg - CHLB Đức) tặng genome cổ khuẩn Pyrococcus furiosus Chương trình “Vườn ươm sáng tạo khoa học công nghệ trẻ” quản lý Trung tâm Phát triển khoa học cơng nghệ trẻ, Thành đồn TP Hồ Chí Minh hỗ trợ kinh phí để thực đề tài Tồn q trình nghiên cứu thực Trung tâm Nghiên cứu hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học Phòng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học phân tử, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] A Vincent and L.A Fitzpatrick (2000), “Soy isoflavones: are they useful in menopause?”, Mayo Clinic Proceedings, 75(11), pp.1174-1184 [2] Q Wang, X Ge, X Tian, et al (2013), “Soy isoflavone: the multipurpose phytochemical”, Biomedical Reports, 1(5), pp.697-701 [3] S.J Yeom, B.N Kim, Y.S Kim, et al (2012), “Hydrolysis of isoflavone glycosides by a thermostable β-glucosidase from Pyrococcus furiosus”, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 60(6), pp.1535-1541 [4] G Singh, A Verma, and V Kumar (2016), “Catalytic properties, functional attributes and industrial applications of β-glucosidases”, Biotech, 6(1), p.3 [5] O.N Donkor and N.P Shah (2008), “Production of β-Glucosidase and Hydrolysis of Isoflavone Phytoestrogens by Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium lactis, and Lactobacillus casei in Soymilk”, Journal of Food Science, 73(1), pp.M15-M20 [6] L.C Kuo, W.Y Cheng, R.Y Wu, et al (2006), “Hydrolysis of black soybean isoflavone glycosides by Bacillus subtilis natto”, Applied Microbiology and Biotechnology, 73(2), pp.314-320 [7] Y.H Pyo, T.C Lee, and Y.C Lee (2005), “Enrichment of bioactive isoflavones in soymilk fermented with β-glucosidase-producing lactic acid bacteria”, Food Research International, 38(5), pp.551-559 [8] R.R Singhania, A.K Patel, R.K Sukumaran, et al (2013), “Role and significance of beta-glucosidases in the hydrolysis of cellulose for bioethanol production”, Bioresource Technology, 127, pp.500-507 61(8) 8.2019 [10] S.W Kengen, E.J Luesink, A.J Stams, et al (1993), “Purification and characterization of an extremely thermostable β-glucosidase from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus”, European Journal of Biochemistry, 213(1), pp.305-312 [11] H.T.M Quan, L.V Ngo, and N.T.B Hue (2016), “Cloning and expression of recombinant hyperthermophilic β-glucosidase fused with GST, and initial testing for hydrolytic activity as applied to biofuel processing”, Asia-Pacific Journal of Food Safety and Security, 2(4), pp.10-19 [13] Y Xue, J Yu, and X Song (2009), “Hydrolysis of soy isoflavone glycosides by recombinant β-glucosidase from hyperthermophile Thermotoga maritima”, Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 36(11), pp.1401 [14] Y Bhatia, S Mishra, and V Bisaria (2002), “Microbial β-glucosidases: cloning, properties, and applications”, Critical Reviews in Biotechnology, 22(4), pp.375-407 [15] M.W Bauer, E.J Bylina, R.V Swanson, et al (1996), “Comparison of a β-Glucosidase and a β-Mannosidase from the Hyperthermophilic Archaeon Pyrococcus furiosus purification, characterization, gene cloning, and sequence analysis”, Journal of Biological Chemistry, 271(39), pp.23749-23755 [16] Q Dong, X Yan, M Zheng, et al (2014), “Characterization of an extremely thermostable but cold-adaptive β-galactosidase from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus for use as a recombinant aggregation for batch lactose degradation at high temperature”, Journal of Bioscience and Bioengineering, 117(6), pp.706-710 [17] B Li, Z Wang, S Li, et al (2013), “Preparation of lactose-free pasteurized milk with a recombinant thermostable β-glucosidase from Pyrococcus furiosus”, BMC Biotechnology, 13(1), pp.73 [18] A Sunna, M Moracci, M Rossi, et al (1997), “Glycosyl hydrolases from hyperthermophiles”, Extremophiles, 1(1), pp.2-13 [19] T Kaper, J.H Lebbink, J Pouwels, et al (2000), “Comparative structural analysis and substrate specificity engineering of the hyperthermostable β-glucosidase CelB from Pyrococcus furiosus”, Biochemistry, 39(17), pp.49634970 [20] S.W Kengen and A.J Stams (1994), “An extremely thermostable β-glucosidase from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus; a comparison with other glycosidases”, Biocatalysis, 11(2), pp.79-88 [21] W Voorhorst, R Eggen, E.J Luesink, et al (1995), “Characterization of the celB gene coding for beta-glucosidase from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus and its expression and site-directed mutation in Escherichia coli”, Journal of Bacteriology, 177(24), pp.7105-7111 [22] S Dan, I Marton, M Dekel, et al (2000), “Cloning, expression, characterization, and nucleophile identification of family 3, Aspergillus nigerβglucosidase”, Journal of Biological Chemistry, 275(7), pp.4973-4980 [23] S Takashima, A Nakamura, M Hidaka, et al (1999), “Molecular cloning and expression of the novel fungal β-glucosidase genes from Humicola grisea and Trichoderma reesei”, The Journal of Biochemistry, 125(4), pp.728-736 [24] Z Xiao, X Zhang, D.J Gregg, et al (2004), “Effects of sugar inhibition on cellulases and β-glucosidase during enzymatic hydrolysis of softwood substrates”, Proceedings of the Twenty-Fifth Symposium on Biotechnology for Fuels and Chemicals, Breckenridge, CO, pp.1115-1126 64 ... mẫu Hoạt Hoạt tính tính riêng riêng xác xác định định mẫu.sạch độ độ tinh tinh enzyme enzyme mục mục tiêu tiêu trong mẫu mẫu Hoạt tính (U) ;; ; Hoạt Hoạt Hoạt Hoạttính tính( U) (U)=== Hoạt tính tính... tốiđồưu hành phản ứng trongtoán phút nhiệt ưu.vàBổ sung đậu nành Thử Thử nghiệm nghiệm hoạt hoạt tính tính enzyme enzyme trên hợp hợp chất chất isoflavone isoflavone từ từ đậu nành bằng phương... phân cắt Từ đó, đó, tính tính tốn tốn được hoạt hoạt cắt hoàn μM pNP, chất phút ởcơ tối ưucắt [12]; tính hoạt tính riêng enzyme với định nghĩa: đơn vị hoạt tính (1 unit) lượng -1 tính hoạt tính riêng