Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm men để ứng dụng trong sản xuất whisky từ malt đại mạch và ngô

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI NGUYỄN VĂN QUYÊN NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN CHỦNG NẤM MEN ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT WHISKY TỪ MALT ĐẠI MẠCH VÀ NGÔ LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI - 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI NGUYỄN VĂN QUYÊN NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN CHỦNG NẤM MEN ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT WHISKY TỪ MALT ĐẠI MẠCH VÀ NGÔ Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 9.42.01.07 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Quang Thảo GS.TS Nguyễn Thành Đạt HÀ NỢI - 2020 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan Luận án tiến sĩ “Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm men để ứng dụng sản xuất whisky từ malt đại mạch ngơ” cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu tài liệu luận án trung thực chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu Số liệu công bố có cộng tác nghiên cứu, đã được đồng ý các cộng sự Tất tham khảo kế thừa trích dẫn tham chiếu đầy đủ Hà Nội, ngày 25 tháng 05 năm 2020 Nghiên cứu sinh Nguyễn Văn Quyên LỜI CẢM ƠN Để hồn thành Luận án tiến sĩ, Tơi nhận hướng dẫn chuyên môn, giúp đỡ tận tình đơn vị, thầy, bạn bè gia đình Nhân dịp Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc trân trọng cảm ơn: GS.TS Nguyễn Thành Đạt, TS Nguyễn Quang Thảo, tận tâm hướng dẫn suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án khoa học này Tôi xin chân thành cảm ơn: Bộ môn Công nghệ sinh học Công nghệ vi sinh; Trường đại học Sư phạm Hà Nội; Trường Cao đẳng Hải Dương; Bộ môn Vi sinh, Bộ môn Đồ uống, Trung tâm bảo tồn Vi sinh vật công nghiệp (Viện Công nghiệp Thực phẩm); Công ty cổ phần Bia-Rượu ERESSON Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi sở vật chất, trang thiết bị, nhân lực giúp Tôi thực tốt nghiên cứu khoa học, triển khai thực nghiệm và các công việc có liên quan tới nội dung luận án Tôi xin cảm ơn giúp đỡ của: TS Nguyễn Quang Hào; PGS.TS Dương Minh Lam -Trưởng phòng Khoa học công nghệ, TS Trần Thị Thúy -Trưởng Bộ môn CNSH CNVS (Trường Đại học Sư phạm Hà Nội); PGS.TS Nguyễn Thị Minh Tú, Viện Công nghệ sinh học và Công nghiệp thực phẩm (Trường Đại học Bách khoa Hà Nội) đã chia sẻ kinh nghiệm, kiến thức học thuật, hỗ trợ quá trình nghiên cứu Cảm ơn gia đình bạn bè ln đồng hành, chia sẻ tạo điều kiện tốt để Tơi hồn thành luận án Xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày 25 tháng 05 năm 2020 Nghiên cứu sinh Nguyễn Văn Quyên MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU .5 1.1 Nấm men 1.1.1 Đại cương nấm men 1.1.2 Đặc điểm sinh học nấm men .6 1.1.3 Nhu cầu dinh dưỡng nấm men 1.1.4 Lên men rượu etylic .12 1.1.5 Nấm men công nghệ sản xuất rượu 15 1.1.6 Những yếu tố ảnh hưởng tới trình lên men rượu nấm men .17 1.2 Rượu whisky 22 1.2.1 Khái niệm phân loại whisky 22 1.2.2 Tình hình sản xuất tiêu thụ rượu whisky giới 23 1.2.3 Tình hình sản xuất tiêu thụ rượu whisky Việt Nam 26 1.3 Công nghệ sản xuất rượu whisky 27 1.3.1 Nguyên liệu sản xuất rượu whisky 27 1.3.2 Enzyme bổ sung sản xuất whisky .33 1.3.3 Enzyme Protease 35 1.3.4 Công nghệ sản xuất rượu whisky 35 CHƯƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 43 2.1 Nguyên liệu, hoá chất, thiết bị 43 2.1.1 Nguyên liệu 43 2.1.2 Hoá chất 44 2.1.3 Thiết bị 44 2.2 Môi trường 44 2.3 Phương pháp nghiên cứu .44 2.3.1 Phương pháp vi sinh vật sinh học phân tử 44 2.3.2 Phương pháp hoá - lý 46 2.3.3 Phương pháp hóa sinh 57 2.3.4 Một số kỹ thuật sử dụng trình nghiên cứu 60 2.3.5 Phương pháp cảm quan 62 2.3.6 Phương pháp toán học 64 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 65 3.1 Tuyển chọn nấm men 65 3.1.1 Mục đích tuyển chọn nấm men 65 3.1.2 Tiêu chuẩn tuyển chọn nấm men 65 3.1.3 Tuyển chọn chủng nấm men 65 3.1.4 Đánh giá khả lên men rượu chủng MS42 71 3.2 Nghiên cứu số đặc điểm sinh học định danh chủng MS42 72 3.2.1 Đặc điểm hình thái chủng nấm men MS42 72 3.2.2 Khả đồng hóa đường chủng nấm men MS42 .73 3.2.3 Định danh khoa học chủng MS42 .74 3.3 Nghiên cứu số yếu tố ảnh hưởng tới sinh trưởng Saccharomyces cerevisiae MS42 nuôi cấy mẻ .75 3.3.1 Ảnh hưởng độ pH 75 3.3.2 Ảnh hưởng hàm lượng ơxi hồ tan ban đầu 76 3.3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ 78 3.3.4 Ảnh hưởng hàm lượng đường tổng số 79 3.3.5 Sử dụng giá đỗ thay pepton môi trường nhân giống nấm men 81 3.3.6 Đánh giá chất lượng chủng MS42 trình bảo quản 82 3.4 Nghiên cứu động học trình lên men rượu Saccharomyces cerevisiae MS42 83 3.4.1 Nghiên cứu động học trình lên men rượu từ malt đại mạch 83 3.4.2 Nguyên cứu động học q trình lên men rượu từ ngơ 95 3.5 Nghiên cứu công nghệ sản xuất rượu whisky từ ngô malt đại mạch (quy mô PTN) .104 3.5.1 Nghiên cứu công nghệ sản xuất rượu whisky từ malt đại mạch 104 3.5.2 Nghiên cứu công nghệ sản xuất rượu whisky từ ngô 108 3.5.3 Nghiên cứu tỷ lệ phối trộn rượu malt ngô để tạo loại rượu Blend .112 3.5.4 Nghiên cứu qúa trình ủ chín tạo hương rượu whisky 113 3.5.5 Bước đầu nghiên cứu biến đổi số chất thơm trình tàng trữ rươu whisky 117 3.5.6 Quy trình công nghệ sản xuất rượu whisky từ malt đại mạch 135 3.5.7 Quy trình cơng nghệ sản xuất rượu whisky từ ngô 138 3.6 Nghiên cứu ứng dụng sản xuất thử nghiệm sản phẩm Công ty Eresson 140 3.6.1 Chế biến dịch lên men .140 3.6.2 Lên men rượu 141 3.6.3 Chưng cất 141 3.6.4 Tàng trữ, tạo hương hoàn thiện sản phẩm 142 3.6.5 Đánh giá chất lượng sản phẩm 142 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 143 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ 145 TÀI LIỆU THAM KHẢO 146 PHỤ LỤC 1PL DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nội dung AOAC Association of Official Analytical Chemists (Hội nhà hóa học phân tích chuẩn quốc tế) BH Bắc Hà EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid FAN free amino nitrogen (amino acid tự do) GC-FID Gas chromatography - Flame ionization detection (nhận biết qua sắc ký khí – sác ký ion hóa lửa) GS-MS Gas Chromatography - Mass Spectrometry (Sắc ký khí sắc ký khối phổ) KL Khối lượng KPH Không phát hiện LV Làng Vân MS Mẫu Sơn MUFA Monounsaturated fatty acid (acid béo khơng no có nối đơi) NCYC National Collection of Yeast Culture (Trung tâm sưu tập giống nấm men quốc gia) OD Optical Density (Mật độ quang) PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi Polymerase) PUFA Polyunsaturated fatty acid (Acid béo khơng no có nhiều nối đơi) QCVN Quy ch̉n Việt Nam TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam To Nhiệt độ YM Yeast extract, malt extract aga (Môi trường thạch nước chiết malt chiết xuất nấm men) w/v Đơn vị khối lượng tích (tính theo khối lượng chất tan (g) nhân với 100 chia cho thể tích dung dịch (ml)) ' phút DANH MỤC CÁC BẢNG Tran Y Bảng 1.1: Bảng 1.2: Bảng 1.3: Bảng 1.4: Bảng 1.5: Bảng 1.6: Bảng 2.1: Bảng 2.2: Bảng 2.3: Bảng 2.4: Bảng 3.1: Bảng 3.2: Bảng 3.3: Bảng 3.4: Bảng 3.5: Bảng 3.6 Bảng 3.7: Bảng 3.8: Bảng 3.9: Bảng 3.10: Bảng 3.11: Bảng 3.12: Bảng 3.13: Bảng 3.14: Bảng 3.15: Bảng 3.16: Bảng 3.17: Bảng 3.18: Một số axit amin ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng Saccharomyces cerevisiae (xếp theo thứ tự từ cao xuống thấp) 10 Thành phần tro sinh khối Saccharomyces cerevisiae 11 Đặc điểm trình thủy phân đường Candida tropicalis Saccharomyces cerevisiae 15 Các chi nấm men rượu điển hình 17 Bảng thành phần dinh dưỡng có ngô vàng hạt khô .31 Các hợp chất Polyphenolic có số loại gỗ sồi 33 Một số mẫu rượu whisky thương mại 43 Điểm tiêu chuẩn cho tiêu cảm quan 63 Hệ số quan trọng tiêu .64 Xếp hạng chất lượng sản phẩm 64 Kết phân tích đánh giá cảm quan 15 dịng nấm men (trên môi trường malt - M) 66 Kết phân tích đánh giá cảm quan 15 dòng nấm men (trên môi trường ngô - N) 67 Kết phân tích sắc ký khí rượu từ dịch malt sau chưng cất 68 Kết phân tích sắc ký khí rượu từ dịch ngô sau chưng cất .68 Kết cảm quan rượu malt chưng cất lần .69 Kết cảm quan rượu ngô chưng cất lần 70 Khả lên men tạo độ cồn cao .70 Khả lên men chủng MS42 với chủng TN2, EC1118, BDX, R2226 .71 Khả sử dụng số loại đường chủng MS42 .74 Ảnh hưởng pH tới sinh trưởng S cerevisiae MS42 75 Ảnh hưởng oxy hoà tan ban đầu đến sinh trưởng nấm men MS42 77 Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng nấm men MS42 78 Ảnh hưởng hàm lượng đường đến sinh trưởng nấm men MS42 .80 Ảnh hưởng giá đỗ đến sinh trưởng nấm men .82 Ảnh hưởng của thời gian lưu giữ giống MS42 đến lên men rượu 83 Khả lên men loại malt khác 84 Ảnh hưởng kích thước malt nguyên liệu tới dịch đường hóa .84 Ảnh hưởng tỉ lệ phối trộn malt với nước dịch malt 85 Bảng 3.19: Ảnh hưởng tỉ lệ Termamyl® SC bổ sung đến đường hóa dịch malt 86 Bảng 3.20: Ảnh hưởng tỉ lệ Dextrozyme® GA bở sung đường hóa dịch malt .87 Bảng 3.21: Ảnh hưởng hàm lượng đường đến trình lên men dịch malt 88 Bảng 3.22 Ảnh hưởng pH đến trình lên men dịch malt 89 Bảng 3.23: Ảnh hưởng nhiệt độ đến trình lên men dịch malt 90 Bảng 3.24: Ảnh hưởng SO2 đến trình lên men rượu từ dịch malt 91 Bảng 3.25: Ảnh hưởng số lượng tế bào nấm men đến trình lên men rượu 92 Bảng 3.26: Sự biến đổi đường, cồn, axit và số lượng tế bào nấm men trình lên men rượu .93 Bảng 3.27: Bảng thành phần dinh dưỡng có ngơ vàng hạt khô .95 Bảng 3.28: Ảnh hưởng tỉ lệ phối trộn với nước dịch ngô .96 Bảng 3.29: Ảnh hưởng tỉ lệ Termamyl® SC thời gian thủy phân đến độ nhớt khối dịch thu 96 Bảng 3.30: Ảnh hưởng nồng độ Dextrozyme® GA thời gian thủy phân đến hàm lượng đường thu (g/l) 97 Bảng 3.31: Ảnh hưởng hàm hượng Neutrase thời gian thủy phân đến hàm axit amin (mg/l) 98 Bảng 3.32: Ảnh hưởng hàm lượng đường lên men dịch ngô 99 Bảng 3.33: Ảnh hưởng pH đến q trình lên men rượu từ dịch ngơ .100 Bảng 3.34: Ảnh hưởng nhiệt độ đến trình lên men rượu dịch ngơ 101 Bảng 3.35: Ảnh hưởng số lượng nấm men đến trình lên men rượu ngô 102 Bảng 3.36: Sự biến đổi đường, cồn, axit và số lượng tế bào nấm men q trình lên men rượu từ dịch ngơ 103 Bảng 3.37 Thành phần dịch malt sau đường hóa 105 Bảng 3.38: Sự biến đởi q trình lên men rượu từ dịch malt (M) 105 Bảng 3.39: Kết phân tích rượu chưng cất lần 107 Bảng 3.40 Tỷ lệ tách rượu đầu cuối giai đoạn chưng cất lần 107 Bảng 3.41: Kết phân tích mẫu rượu malt chưng cất lần 107 Bảng 3.42 Thành phần dịch ngô lên men rượu sản xuất whisky 108 Bảng 3.43: Sự biến đởi q trình lên men rượu từ dịch ngơ (N) 109 Bảng 3.44: Kết phân tích rượu ngô chưng cất lần .110 Bảng 3.45 Tách mẫu rượu phân tích chưng cất lần .111 Bảng 3.46: Kết phân tích mẫu rượu ngơ chưng cất lần .111 Bảng 3.47 Đánh giá cảm quan tỉ lệ rượu phối trộn malt ngô 112 Bảng 3.48: Đánh giá cảm quan 24 mẫu gỗ sồi ngâm rượu (Thời gian ngâm 03 tháng) 114 Bảng 3.49: Kết cảm quan lần 04 mẫu gỗ sồi sau 180 ngày ủ với rượu 115 Bảng 3.50: Giá trị OD mẫu ngâm sồi với lượng gỗ sồi khác theo thời gian 116 Bảng 3.51: Giá trị OD420nm mẫu ngâm sồi hàm lượng cồn khác 117 Bảng 3.52: Thành phần số chất tạo hương whisky Jack Danies (Mỹ) sản xuất từ 100% ngô .118 Bảng 3.53: Thành phần số chất tạo hương whisky Singleton (Scotchland) sản xuất từ 100% malt 120 Bảng 3.54: Thành phần một số chất tạo hương KNOB CREEK (Mỹ) whisky phối trộn (80% ngô; 20% malt) 121 Bảng 3.55: Thành phần số chất tạo hương rượu trước ngâm sồi 123 Bảng 3.56: Thành phần số chất tạo hương rượu whisky sau 06 tháng tàng trữ 125 Bảng 3.57: Thành phần số chất tạo hương rượu whisky sau 12 tháng tàng trữ 127 Bảng 3.58: Thành phần số chất tạo hương rượu whisky sau 18 tháng tàng trữ 129 Bảng 3.59: Thành phần số chất tạo hương rượu whisky sau 24 tháng tàng trữ 131 Bảng 3.60: Kết cảm quan sau 24 tháng tàng trữ 134 DANH MỤC CÁC HÌNH Tran Hình 1.1: Hình 1.2: Hình 1.3: Hình 1.4: Hình 1.5: Hình 1.6: Hình 1.7: Hình 1.8: Hình 1.9: Hình 1.10: Hình 1.11: Hình 1.12: Hình 2.1: Hình 2.2: Hình 2.3: Hình 2.4 Hình 2.5: Hình 2.6: Hình 3.1: Hình 3.2: Hình 3.3: Hình 3.4: Hình 3.5: Hình 3.6: Hình 3.7 Hình 3.8: Hình 3.9: Hình 3.10 Hình 3.11 Hình 3.12: Hình 3.13: Hình 3.14: Hình 3.15: Hình 3.16 YY Bào tử túi bảo tử nấm men Chu kì sinh sản nấm men S cerevisiae Các pha nguyên phân nấm men S cerevisiae Sơ đồ tóm tắt kiểm sốt dị hóa glucose 14 Sản lượng rượu whisky tiêu thụ số nước năm 2014 25 Doanh số lợi nhuận năm 2016 dự đoán thị trường rượu whisky đến năm 2025 25 Một số sản phẩm thủy phân tannin 32 Sơ đồ đường hoá dịch malt 35 Thiết bị chưng cất gián đoạn 38 Quy trình chưng cất rượu whisky Scotland 39 Quy trình chưng cất rượu whisky Ireland 39 Thiết bị chưng cất liên tục theo thiết kế Coffey 40 Một số loại rượu mẫu thương mại sử dụng phân tích đối chứng 44 Đường chuẩn maltose 48 Đường chuẩn D-glucose .49 Đồ thị đường chuẩn Albumintheo phương pháp Lowry .52 Sơ đồ đường hoá dịch malt 61 Sơ đồ đường hóa dịch ngô 62 Sắc kí đồ sản phẩm rượu dịng MS42 mơi trường malt (M) .68 Sắc kí đồ sản phẩm rượu dịng MS42 mơi trường ngơ (N) 68 Khuẩn lạc chủng MS42 môi trường Hansen 73 Hình dạng tế bào chủng MS42 kính hiển vi điện tử 73 Túi bào tử chủng MS42 .73 Cây chủng loại phát sinh xây dựng phần mềm Mega .74 Ảnh hưởng pH đến sinh trưởng nấm men S cerevisiae MS42 76 Ảnh hưởng ơxi hịa tan ban đầu đến sinh trưởng nấm men S cerevisiae MS42 78 Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng S cerevisiae MS42 79 Ảnh hưởng hàm lượng đường đến sinh trưởng S cerevisiae MS42 81 Đồ thị động thái lên men rượu dịch malt 94 Đồ thị động thái lên men rượu từ dịch ngô .104 Phổ sắc ký số chất tạo hương whisky Jack Danies (Mỹ) sản xuất từ 100% ngô .118 Phổ sắc ký số chất tạo hương whisky Singleton (Scotchland) sản xuất từ 100% malt 119 Phổ sắc ký chất tạo hương KNOB CREEK (Mỹ) - whisky phối trộn (80% ngô; 20% malt) 121 Sơ đồ sản xuất rượu whisky từ malt đại mạch 135 Hình 3.17 Sơ đồ sản xuất rượu whisky từ ngô 138 MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Whisky thuộc loại rượu mạnh (độ rượu từ 40 – 50%Vol) sản xuất cách chưng cất dịch lên men số loại ngũ cốc (đại mạch, lúa mì, ngơ, lúa gạo, ), rượu sau chưng cất tàng trữ với gỗ sồi thời gian dài để hoàn thiện sản phẩm [30], [108] Mỗi mợt loại whisky có hương vị đặc trưng và khác biệt riêng khác về: loại nguyên liệu sản xuất, chủng nấm men sử dụng, khí hậu đặc trưng từng vùng, quy trình sản xuất, thời gian điều kiện tàng trữ [115] Trước đây, rượu whisky sản phẩm tiếng sản xuất Scotchland, whisky sản xuất nhiều quốc gia khác như: Anh, Pháp, Hoa Kỳ, CHLB Đức, Italia, Tây Ban Nha, Nhật Bản, Trung Quốc, [75], [108] Đối với dòng rượu mạnh, theo MarketLine [143]: Giá trị thị trường vượt mức 306 tỷ USD vào năm 2015, tốc độ tăng trưởng năm năm gần đạt 17%, sản lượng tiêu thụ tăng từ 19 tỷ lít (2010) lên 22 tỷ lít (2015), tăng 10% Dẫn đầu thị trường whisky (27% thị phần),… Châu Âu, Ấn Độ, Mỹ thị trường tiêu thụ số mặt hàng này, chiếm 48% thị trường giới [76] Quy mô thị trường rượu mạnh toàn cầu định giá 336 tỷ USD vào năm 2016 dự kiến chứng kiến mức tăng trưởng hàng năm (CAGR) 33,4% từ năm 2017 đến năm 2025 thị trường Mỹ (Theo phân tích thị trường Grand View Research - 2017) Nhu cầu sử dụng rượu cao độ nói chung whisky nói riêng Việt Nam khoảng từ 500 - 520 triệu lít/năm Rượu cao độ (chủ yếu loại rượu Whisky, Cognac Vodka,…) hàng năm nhập tiêu thụ Việt Nam chiếm khoảng 20% tổng sản lượng rượu thị trường (trong dịng rượu whisky chiếm thị phần lớn 30%) [5], [25] Việt Nam lại chưa sản xuất loại rượu nên phải nhập với số lượng lớn ngoại tệ, ảnh hưởng không nhỏ đến phát triển bền vững kinh tế Việt Nam Là quốc gia có nghề sản xuất rượu thủ công từ lâu đời, năm kỷ 20, nhiều thương hiệu rượu làng nghề Việt Nam Làng Vân, Kiên Lao, Bầu Đá, Mẫu Sơn,… nhiều sản phẩm rượu sản xuất từ ngũ cốc xuất sang thị trường châu Âu, châu Á đánh giá cao Việt Nam quốc gia hàng đầu giới đa dạng sinh học, có nguồn gen vi sinh vật có chất lượng tốt vô phong phú vi sinh vật để sản xuất loại rượu có chất lượng cao an toàn, tiềm quý để Việt nam tự sản xuất nhiều loại rượu mạnh, có rượu Whisky phục vụ đáp ứng nhu cầu thị trường nước, bước giảm nhập góp phần ổn định kinh tế Cho đến nay, Việt Nam có số nghiên cứu bước đầu sản xuất rượu whisky chủ yếu quy mơ thí nghiệm, những cơng trình nghiên cứu mang tính học thuật khoa học, có khả ứng dụng sản xuất quy mô lớn còn rất hạn chế và chưa đầy đủ Xuất phát từ nhu cầu thị trường, từ tiềm ngun liệu, để hồn thiện quy trình cơng nghệ chủ động sản xuất rượu whisky Việt Nam, chọn đề tài: “Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm men để ứng dụng sản xuất whisky từ malt đại mạch ngô” với mong muốn đóng góp phần kiến thức khoa học, cơng nghệ, bước hồn thiện nâng cao quy mơ sản xuất rượu whisky tại Việt Nam, tạo sản phẩm có chất lượng tốt, an tồn, có giá trị kinh tế cao, bước hạn chế nhập khẩu, góp phần ổn định kinh tế quốc gia Mục tiêu nghiên cứu Tuyển chọn – chủng nấm men có chất lượng tốt, đáp ứng u cầu cơng nghệ chất lượng sản phẩm Xác định một sớ đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa, di truyền và định tên khoa học chủng nấm men đã tuyển chọn Ứng dụng chủng nấm men tuyển chọn để nghiên cứu sản xuất rượu whisky từ malt đại mạch ngơ Xây dựng quy trình cơng nghệ sản xuất rượu whisky từ ngô và malt đại mạch sản phẩm đạt tiêu chuẩn chất lượng an toàn thực phẩm theo quy định Nội dung nghiên cứu 3.1 Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm men đáp ứng yêu cầu công nghệ sản xuất chất lượng sản phẩm rượu whisky; 3.2 Nghiên cứu đặc điểm sinh học (đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh trưởng) định danh tên khoa học chủng nấm men tuyển chọn 3.3 Nghiên cứu động học trình lên men rượu 3.4 Nghiên cứu xây dựng quy trình cơng nghệ sản xuất rượu whisky từ ngơ và malt đại mạch 3.5 Ứng dụng quy trình công nghệ sản xuất thử nghiệm sản phẩm sở sản xuất rượu Kết đã đạt 4.1 Tuyển chọn 01 chủng nấm men đáp ứng yêu cầu công nghệ chất lượng sản phẩm rượu whisky 4.2 Xác định đặc điểm sinh học, di truyền định tên khoa học đến loài cho chủng nấm men tuyển chọn Saccharomyces cerevisiae MS42 4.3 Xây dựng quy trình cơng nghệ sản xuất rượu whisky từ ngô và malt đại mạch 4.4 Sản xuất 10.000 lít rượu whisky từ ngơ và malt đại mạch tại Công ty cổ phần TNHH MTV Bia- Rượu Eresson Việt Nam tại Công ty cổ phần TNHH MTV BiaRượu Eresson Việt Nam (gồm sản phẩm: Whisky 100% malt; Whisky 100% ngô; Whisky 20% matl 80% ngô), sản phẩm đạt quy chuẩn kỹ thuật quốc gia An toàn thực phẩm sản phẩm đồ uống có cồn theo quy định Ý nghĩa khoa học thực tiễn - Về mặt khoa học Đề tài tuyển chọn chủng nấm men Việt Nam gỗ sồi S8 phù hợp để sản xuất whisky từ ngô malt đại mạch Chủng nấm men có khả sinh trưởng mạnh mơi trường malt, ngô, hiệu suất lên men đạt từ 89,51 – 91,40%, 25oC, pH 5,0 – 5,5, có khả lên men rượu đạt 12,3 %Vol, sản phẩm có hương, vị đặc trưng rượu whisky Cung cấp sở khoa học quy trình cơng nghệ sản xuất whisky từ ngô malt đại mạch (đặc biệt trình hình thành biến đổi số chất tạo hương đặc trưng rượu whisky trình tàng trữ) phù hợp với điều kiện thực tiễn Việt Nam - Về mặt thực tiễn Đề tài ứng dụng vào thực tiễn sản xuất doanh nghiệp tạo sản phẩm có chất lượng tốt, đạt Tiêu chuẩn chất lượng an toàn thực phẩm theo quy định, khách hàng Trung Quốc Singapore đánh giá cao Việc sản xuất whisky Việt Nam góp phần khai thác có hiệu nguồn ngun liệu (ngơ, chủng nấm men,…) có Việt Nam để chủ động sản xuất loại sản phẩm cao cấp Việt Nam bước hạn chế nhập ngoại tệ tiến tới xuất sản phẩm đặc trưng Việt Nam Những đóng góp luận án 6.1 Tuyển chọn định danh khoa học 01 chủng nấm men phân lập từ nguồn bánh men rượu truyền thớng xã Mẫu Sơn, huyện Bình Lộc, tỉnh Lạng Sơn (Saccharomyces cerevisiae MS42) đạt tiêu chí để sản xuất rượu whisky từ ngô và malt đại mạch như: Có khả lên men dịch đường hóa từ malt đại mạch ngô tạo độ rượu đạt 12,3%Vol 25oC, tạo hương, vị tốt, đặc trưng cho sản phẩm Chủng M42 có khả sinh trưởng tốt môi trường malt (M), ngô (N) sau 36 – 48 nuôi cấy đạt số lượng tế bào tối đa từ 213 x 10 – 215 x 106 tế bào/ml Lên men rượu tối ưu từ dịch lên men có hàm lượng đường:160 – 180g/l; pHopt: 5,0 – 5,5; Topt = 20 – 30oC đạt độ cồn: 9,00 – 9,91%Vol Hiệu suất lên men từ 89,52 – 91,13%, tạo độc tố methanol, acetaldehyde, fufurol 6.2 Xác định được loại nguyên liệu phù hợp để sản xuất rượu whisky gồm: Malt, ngơ có Việt Nam gỡ sời (kí hiệu S8) nhập từ Mỹ Xây dựng quy trình cơng nghệ sản xuất whisky từ ngơ malt đại mạch phù hợp với điều kiện thực tiễn Việt Nam 6.3 Bước đầu nghiên cứu hình thành biến đổi số chất tạo hương rượu whisky trình tàng trữ rượu với gỗ sồi 6.4 Cung cấp sở khoa học chủng nấm men quy trình cơng nghệ sản xuất rượu whisky từ malt đại mạch, ngô áp dụng sản xuất quy mô thực nghiệm Việt Nam tạo loại sản phẩm whisky: 100% malt; 100% ngô 20% malt + 80% ngô Sản phẩm đạt tiêu chuẩn chất lượng an toàn thực phẩm theo quy định Cấu trúc luận án Luận án cấu trúc làm phần: mở đầu, nội dung, kết luận, danh mục cơng trình khoa học đã cơng bố, tài liệu tham khảo phụ lục Phần nội dung luận án triển khai thành ba chương sau: Chương 1: Tổng quan vấn đề nghiên cứu (38 trang) Chương 2: Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu (20 trang) Chương 3: Kết thảo luận (80 trang) CHƯƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Nấm men 1.1.1 Đại cương nấm men Nấm men nhóm nấm đơn bào tập hợp đơn bào, có kích thước, đường kính tế bào từ – 10 μm Tuỳ lồi nấm men tế bào có hình cầu, hình trứng, hình ovan, hình chanh, hình elíp, hình mũ phớt, hình thổ, hình liềm, hình thoi, hình cung nhọn, hình tam giác, hình chai, hình thấu kính, hình lê, hình bán cầu có rìa hẹp, [26], [44] Thành tế bào nấm men Saccharomyces có cấu tạo chủ yếu từ mannan glucan, số chi có thêm kitin Màng tế bào chất gồm lớp phân tử phospholipid với mối liên kết este đặc trưng cho màng vi sinh vật nhân thực Trong tế bào chất có bào quan như: nhân, ti thể, riboxôm, không bào, thể Golgi,… Nhân tế bào Saccharomyces cerevisiae có 16 nhiễm sắc thể (đơn bội – 1n) 16 cặp nhiễm sắc thể (lưỡng bội – 2n) Ngồi nhân cịn có nhiều yếu tố di truyền khác plasmid, yếu tố di truyền vận động (Transposon) Khối lượng riêng tế bào nấm men 1,055 - 1,060 KDa, không khác biệt nhiều so với tế bào vi khuẩn (1,050 - 1,112 KDa) Nấm men đóng vai trò quan trọng đời sống người, chúng sử dụng rộng rãi ngành công nghiệp, điển hình cơng nghiệp sản xuất rượu, cồn, rượu vang, bia, thực phẩm hoạt chất sinh học, [8], [132] Việc phân loại nấm men nói chung phức tạp thường dựa tiêu chủ yếu sau: - Đặc điểm tế bào sinh dưỡng (hình dạng, cấu tạo, kích thước ) - Đặc điểm sinh sản hữu tính đặc điểm sinh lý, ni cấy (khả đồng hố carbon, đồng hố nitrat, phản ứng DBB (phản ứng với Diazonium Blue B) Cho đến có nhiều khố phân loại nấm men tác giả: Lodder.J 1970), Kudriavtsev (1954), Tâm Tâm Phương (1954), Barnett.J.A, Payne.R.W Yarrow.D (1983), Kreger-Van Rij N.J.W (1984) Một số kỹ thuật điển hình phân loại học phân tử: Phân tích trình tự DNA, Kỹ thuật PCR, Lai phân tử, Điện di izozym Cách phân loại nấm men dựa vào tiêu chí [8], [47], [76]: 1- Các đặc điểm hình thái tế bào khuẩn lạc 2- Các đặc điểm sinh sản vơ tính (nảy chồi, phân đơi), hữu tính (hình thành túi, nang bào tử hữu tính) 3- Các đặc điểm sinh hóa (thành tế bào, coenzyme Q10, ), đặc điểm sinh lí (nguồn dinh dưỡng C, N, , pH, To tối ưu, ) 4- Các đặc điểm sinh học phân tử (trình tự D1, D2 gen 28S; ITS1, ITS2 bên gen 5,8S trình tự RNA – ribôxôm 18S, ) Hiện nay, nấm men xác định được: 1110 loài/ 58 chi/ 17 họ / Bộ Saccharomycetales/ Lớp Saccharomycetes/ Ngành Ascomycota [139] 1.1.2 Đặc điểm sinh học nấm men 1.1.2.1 Sinh sản nấm men Nấm men trì nịi giống hai hình thức sinh sản vơ tính sinh sản hữu tính Tuy nhiên, có ln phiên sinh sản vơ tính hữu tính với giai đoạn đơn bội, lưỡng bội khác vòng đời nấm men hoặc tùy theo mơi trường - Sinh sản vơ tính: Nấm men sinh sản vơ tính chủ yếu hình thức nảy chồi Đây hình thức sinh sản vơ tính phổ biến nấm men thể qua xuất chồi từ vị trí sẹo chời [76] Ngồi nấm men cịn có hình thức sinh sản vơ tính bào tử như: bào tử đốt (ở chi Geotrichum), bào tử bắn (ở chi Sporobolomyces), bào tử áo (ở nấm Candida albicans) [56], [100] Sinh sản vô tính có ưu điểm: tốc độ sinh sản nhanh, chiếm lĩnh mơi trường, đột biến, ổn định di truyền - Sinh sản hữu tính: Sinh sản hữu tính nấm men xuất chi Saccharomyces, Zygosaccharomyces nhiều chi nấm men khác thuộc Endomycetales Quá trình sinh sản liên quan tới tạo thành bào tử túi từ tế bào sinh dưỡng kèm theo trình giảm phân gồm giảm phân giảm phân 2, có lần nhân đơi nhiễm sắc thể giảm phân 1, từ tế bào lưỡng bội (2n) tạo thành bào tử đơn bội (n) Khi gặp điều kiện thuận lợi cho sinh sản vơ tính mơi trường mới, bào tử nảy mầm thành tế bào nảy chồi trở sinh sản vơ tính [8], [44] Các nấm men lớp Ascomycetes có dạng sinh sản hữu tính hình thành túi bảo tử chứa bào tử túi (Ascospores) kết q trình giảm phân Ví dụ túi bào tử bào tử túi loài nấm men phổ biến sau [100]: S cerevisiae Pichia farinosa Schizosaccharomyces octosporus Hình 1.1: Bào tử túi bảo tử nấm men [84] Sinh sản hữu tính: thường xảy điều kiện môi trường khắc nghiệt Thế hệ có đặc điểm khác biệt vật chất di truyền, tạo nguồn nguyên liệu cho chọn lọc tự nhiên, có ý nghĩa sinh tồn, tiến hóa - Chu kì sống nấm men Sau trình giảm phân, bào tử túi sinh (thường bào tử túi) Khi khơng có sinh sản hữu tính chúng liên tục nẩy chồi để sinh sản Chu kì thấy nấm men rượu S cerevisiae [56], [8] Hình 1.2: Chu kì sinh sản nấm men S cerevisiae [56] Yếu tố định quan trọng đặc tính di truyền tế bào qua sinh sản vơ tính nảy chồi truyền lại cho hệ sau Đặc tính thể rõ nấm men S cerevisiae Hình 1.3: Các pha nguyên phân nấm men S cerevisiae [56] Chu kỳ sinh sản vơ tính tế bào chia làm pha: G1, S (giai đoạn tổng hợp DNA), G2 M (các kì nguyên phân), pha G2 ngắn có sẹo chồi 1.1.2.2 Đặc điểm sinh lí – sinh hóa nấm men a/ Đồng hóa hợp chất carbon Chuyển hóa carbon tảng cho sản xuất thành phần tế bào cung cấp chuyển hóa lượng Để thử nghiệm khả đồng hóa hợp chất carbon chủng nấm men S cerevisiae, 20 loại hợp chất sử dụng giai đoạn đầu [8], [44], [81]: - Các hexose: glucose, galactose, sorbose, methuyl-D-glucoside salicine, arbutine - Các pentose: D - xylose, L - arabinose, D L – ribose, L – rhamnose - Các disaccharide: saccharose, lactose, maltose, melibiose, trehalose, cellobiose - Trisaccharide: rafinose, melezitose - Polysaccharide: tinh bột, inuline Sau đó, nhóm hợp chất gồm [81]: - Rượu: methanol, ethanol, glyxerol, ribitol, galactiol, erythritol, mannitol, sorbitol, inositol - Các axit hữu cơ: lactic, succinic, citric, pyruvic, malic, glucuronic, 2xetogluconic Phương pháp để thử loại đường tương đối đơn giản cho nguồn đường hợp chất cần nghiên cứu vào môi trường thạch Difco 2% có nitơ nấm men Phương pháp có thuận lợi nhanh chóng có kết Khi nấm men có sinh trưởng xác định chủng nấm men nghiên cứu sử dụng nguồn đường bổ sung Thử nghiệm thủy phân arbutine thực mơi trường có arbutine (5%), thạch % ống nghiệm đặt nghiêng Nếu arbutine thủy phân màu nâu xuất mơi trường sau – ngày 25oC [6], [84] Hiện nay, phương pháp phổ biến sử dụng để xác định khả đồng hóa hợp chất carbon dùng kit thử Nguyên tắc chung dựa phát enzyme, nhóm enzyme tham gia chuyển hóa hợp chất carbon có vi sinh vật Ví dụ: sử dụng kit ID 32C, có khả phát 32 loại hợp chất carbon dùng cho chuyển hóa vật chất lượng tế bào b/ Đồng hóa hợp chất nitơ Nguồn nitơ cần thiết cho sống trình trao đổi chất chúng điều hịa xác Hiện nay, nghiên cứu khả đồng hóa hợp chất nitơ chủ yếu sử dụng nguồn là: nitrat kali chlorhydrat ethylamin, thí nghiệm thực theo phương pháp auxanographic (khuyết dưỡng tự ghi) môi trường nước chiết nấm men (Difco) hay môi trường tổng hợp khơng có nitơ [44] [56] Ở S cerevisiae vật liệu nitơ cho sinh tổng hợp axit amin chủ yếu chuyển đổi từ glutamate glutamine Nitơ amin từ glutamate nhóm amin từ glutamine chiếm 85% 15% tổng số nitơ tế bào [86] Trong đó, glutamate glutamine hoạt động với α-ketoglutarate để kết nối chu trình TCA chuyển hóa nitơ thông qua glutamate dehydrogenase, phụ thuộc NADPH (GDH1), glutamine synthetase (GLN1), glutamate synthase phụ thuộc NADH (GLT1) glutamate dehydrogenase liên kết với NAD (GDH2) [138] Chuyển hóa nitơ chứng minh quan trọng trình dị hóa đồng hóa protein, axit amin hợp chất nitơ khác Do đó, nitơ đóng vai trị chi phối nói chung trao đổi chất Điều hịa chuyển hóa nitơ bao gồm tập hợp trình liên kết với nhau, chẳng hạn hệ thống cảm biến báo hiệu Ssy1-Ptr3-Ssy5 (hệ thống cảm biến SPS) [58] 1.1.3 Nhu cầu dinh dưỡng nấm men Nấm men có khả sinh trưởng điều kiện hiếu khí kị khí Các trình trao đổi chất khác nhau, nhu cầu dinh dưỡng khác Trong môi trường nuôi cấy cung cấp đầy đủ nhân tố cần thiết để tế bào nấm men sinh trưởng Tỉ lệ nguyên tố sinh khối tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae C: 1,72; O: 0,44; N: 0,15 nuôi nấm men điều kiện hiếu khí môi trường chứa glucose khoảng 10% chất tro [100] Môi trường cần cung cấp đầy đủ tỉ lệ nguyên tố cho nấm men sinh trưởng Các hợp chất carbon (đường, rượu, axit hữu cơ, ) cung cấp nguồn lượng cho nấm men, đồng thời cung cấp hydro cần thiết để tổng hợp sinh khối tế bào - Nhu cầu nitơ: Nitơ đứng thứ số lượng cho cấu trúc tế bào cần phải bổ sung vào môi trường nuôi cấy Nitơ cần dùng cho tế bào tổng hợp axit amin, nucleotid số vitamin Rất nhiều nguồn nitơ sử dụng Tất nấm men có khả sử dụng nitơ dạng anion Các anion đưa vào môi trường dạng clorua amon, nitrat amon, phosphat amon sulfat amon Trong đó, sulfat amon có ưu điểm đồng thời cung cấp lưu huỳnh cần thiết để tổng hợp vài loại axit amin có lưu huỳnh [6], [44] Vài loại nấm men có khả sử dụng nitrit nitrat như: Hansenula, Pachysolen, Citeromyces Candida Trichosporon Khả cịn sử dụng khóa phân loại học nấm men [84] Trong môi trường nuôi cấy, nitrit tạo pH 6, axit nitrit chất độc tế bào Phần lớn axit amin nấm men sử dụng nguồn nitơ Tuy nhiên, tùy theo loại axit amin môi trường tốc độ sinh trưởng nấm men khác Dưới liệt kê axit amin theo tốc độ sinh trưởng từ cao xuống thấp theo thứ tự (Bảng 1.1): Bảng 1.1: Một số axit amin ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng Saccharomyces cerevisiae (xếp theo thứ tự từ cao xuống thấp) [40] STT Tên chất STT Tên chất STT Tên chất Glutamine Phenylalanine 17 Iso leucine Ammonium 10 Ornithine 18 Threonine Asparagine 11 Citrulline 19 Tryptophane Axit glutamic 12 Allantoine 20 Axit allantoic Serine 13 Vanilin 21 Methionine Arginine 14 Leucine 22 Histidine Urea 15 Proline 23 Glycine Alanine 16 Tyrosine Các axit amin kiềm cung cấp khung carbon sau chuyển amin Khung carbon sử dụng hình thành sinh khối Trong đó, khung carbon axit amin có tính kị nước valine tiết sau chuyển amin Hỗn hợp axit amin tạo thành môi trường sinh trưởng tốt nấm men mơi trường có loại axit amin Vì thủy phân caseine hay nước chiết trái lên men tạo nguồn nitơ tốt Các dipeptid tripeptid nấm men sử dụng Việc sử dụng polypepetid bị giới hạn mơi trường tế bào chất, kích thước phân tử lớn Chúng thủy phân nhờ peptidase nội bào, cuối urea tổ hợp với biotine bazơ purine pyrimidine sử dụng Việc sử dụng axit amin có tốc độ khác nhau, nấm men sử dụng nguồn axit amin ưa thích, theo tiêu chí [40], [44]: + Xâm nhập vào tế bào nhanh; + Biến đổi nhanh tế bào với số giai đoạn tối thiểu để hình thành amoniac axit glutamic hai; + Không tạo hiệu ứng độc thứ cấp Đối với Saccharomyces cerevisiae điều kiện không bị giới hạn lượng, theoYaya Liu cộng sự, môi trường thiếu hụt trầm trọng N P, để tránh bị chết đói số tế bào phân giải, giải phóng hợp chất chứa N P bù lại nhu cầu tối thiểu giúp trì với tốc độ tăng trưởng gần không Từ phép đo này, tỷ lệ giải phóng N, P cụ thể 8,1 μmol N / [g sinh khối] / h 5,2 μmol P / [g sinh khối] / h tính tốn [136] - Nhu cầu photpho (P): Phospho có mặt axit nucleic nucleosides, diphosphats, triphosphats Người ta tìm thấy phospho dạng polyme mạch thẳng polyphosphate đóng vai trị quan trọng điều hịa chuyển hóa vật chất nội bào Nồng độ ion phosphate (PO4)3- điều hòa tổng hợp lipid gluxit Phospho tế bào đồng hóa dạng ion (H2PO4)- Các nguồn phospho môi trường nuôi cấy cung cấp dạng KH 2PO4 hay Na2HPO4 Nếu mơi trường có phospho, tế bào tổng hợp phosphomonoesterase khu trú thành tế bào giải phóng phospho từ este phosphoric [40], [76] - Các nhân tố vi lượng: Nầm men cần sử dụng nguyên tố kim loại mức vi lượng để sinh trưởng: K, Na, Mg, Zn, Fe,….Các ion khác có mặt thành phần tế bào nấm men với hàm lượng nhỏ Một vài loại nguyên tố Arsenic (thạch tím Asen), Chì (Pb), Aluminium (Nhơm, Al), Chrome (Cr) vannadium (vanadi, V) nguyên tố ức chế [40], [100] Một số nguyên tố khác đồng (Cu), Nickel (Ni) hay Iod (I) có bổ sung với hàm lượng (dạng vết) vào mơi trường ni cấy Nói chung ngun tố vết có thành phần tế bào lắng cặn môi trường dư thừa ion thêm vào Thành phần sở sinh khối Saccharomyces cerevisiae Bảng 1.2: Thành phần tro sinh khối Saccharomyces cerevisiae [40] Các nguyên tố Số lượng (g/100g chất khô tế bào Các nguyên tố Số lượng (g/100g chất khô tế bào Potassium (K) 2,2 Cobalt (Co) 0,5 10-3 Phosphorus (P) 1,6 Nickel (Ni) 250 10-3 Sulfur (S) 300 10-3 Arsenic (As) 180 10-6 Magnesium (Mg) 270 10-3 Lead (Pb) 150 10-6 Các nguyên tố Số lượng (g/100g chất khô tế bào -3 Các nguyên tố Số lượng (g/100g chất khô tế bào 125 10-6 Sodium (Na) 60 10 Iode (I) Calcium (Ca) 50 10-3 Molybdenum (Mo) 10-6 Barium (Ba) 15 10-3 Bore (Bo) 10-6 Zinc (Zn) 12 10-3 Aluminium (Al) 10-6 Iron (Fe) 10 10-3 Chrome (Cr) 10 10-26 Copper (Cu) 10-3 Vanadium (V) 10-26 Manganese (Mn) 10-3 Dựa giá trị tính số lượng muối bổ sung vào mơi trường nuôi cấy Trong tạo môi trường nuôi cấy hay môi trường hỗn hợp công nghiệp, cần phải tính tốn mối tương tác thành phần mơi trường khác Ví dụ: hiệu ứng tương tác nồng độ (NH4)2SO4 KH2PO4 đến tốc độ sinh trưởng Ngoài ra, với vài nguyên tố xác định nồng độ nhiều biến thành yếu tố gây độc, ví dụ Đồng (Cu) với nồng độ 1,5 μmol.l -1 kích thích sinh trưởng Saccharomyces cerevisiae 10 μmol.l -1 lại làm ức chế Tính độc Cu làm giảm bớt hấp thụ Zn [76] 1.1.4 Lên men rượu etylic Q trình chuyển hóa glucose thành ethanol gồm hai giai đoạn chính: ... nấm men đã tuyển chọn Ứng dụng chủng nấm men tuyển chọn để nghiên cứu sản xuất rượu whisky từ malt đại mạch ngô Xây dựng quy trình cơng nghệ sản xuất rượu whisky từ ngô và malt đại mạch sản. .. học Đề tài tuyển chọn chủng nấm men Việt Nam gỗ sồi S8 phù hợp để sản xuất whisky từ ngô malt đại mạch Chủng nấm men có khả sinh trưởng mạnh môi trường malt, ngô, hiệu suất lên men đạt từ 89,51... học chủng nấm men quy trình công nghệ sản xuất rượu whisky từ malt đại mạch, ngô áp dụng sản xuất quy mô thực nghiệm Việt Nam tạo loại sản phẩm whisky: 100% malt; 100% ngô 20% malt + 80% ngô Sản