Nhân giống cây hoa hồng Vân Khôi (Rosa “Souvenir de la malmaison) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô

Trong nghiên cứu này, giống hoa hồng Vân Khôi (Rosa “Souvenir de la malmaison) được sử dụng làm vật liệu cho kĩ thuật nuôi cấy mô.

HNUE JOURNAL OF SCIENCE Natural Sciences 2019, Volume 64, Issue 3, pp 133-140 This paper is available online at http://stdb.hnue.edu.vn DOI: 10.18173/2354-1059.2019-0016 NHÂN GIỐNG CÂY HOA HỒNG VÂN KHÔI (Rosa “Souvenir de la malmaison”) BẰNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY MÔ La Việt Hồng1, Chu Đức Hà2, Trần Thị Thanh Huyền3, Lê Thị Lâm1 Mai Thị Hồng1 Khoa Sinh - Kĩ thuật Nông nghiệp, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Tóm tắt Trong nghiên cứu này, gi ng hoa hồng Vân Khôi (Rosa “Souvenir de la malmaison ợc sử dụng làm vật liệu cho kĩ thuật nu i c y m ết cho th y, t thân hoa hồng Vân h i ợc khử trùng bề mặt cồn 70% 10 phút, xử lí tiếp dung dịch Gia-ven 5% 10 phút cho tỉ lệ mẫu s ng ạt , Đ c ịnh ợc c ng thức m i tr ờng MS, 30 g/L saccarozơ, g/L agar, có bổ sung 1,0 mg/L BAP phù hợp nh t ể bật chồi từ mắt ngủ hoa hồng M i tr ờng t ơng tự nh ng bổ sung BAP 2,0 mg/L thích hợp cho nhân nhanh chồi in vitro, s chồi trung bình/mẫu ạt , v i chiều cao trung bình chồi 4,7 (cm) sau tuần nuôi c y Tiếp theo, c ịnh ợc c ng thức m i tr ờng M c bổ sung NAA 0,75 mg/L thích hợp cho tạo rễ in vitro v i tỉ lệ hình thành rễ cao nh t ạt 75,0% Cây ợc trồng giá thể hỗn hợp TS cho tỉ lệ s ng sót cao nh t ạt , sau tuần rèn luyện Từ khóa: C y m , hoa hồng, ĩ thuật, nhân gi ng, Vân h i Mở đầu Hoa hồng loại hoa th ơng mại quan trọng ngành công nghiệp hoa gi i [1] Hoa hồng ợc u thích có nhiều hình d ng, ích th c, màu sắc h c Đặc biệt hoa c mùi thơm, nên hoa hồng ợc trồng ể sản xu t loại tinh dầu, vitamin C, ây lí mà hoa hồng ợc mệnh danh “nữ hoàng loài hoa [2] Trong s , hoa hồng Vân Khôi (Rosa “Souvenir De la Malmaison” gi ng hồng cổ h p, c ặc iểm to màu hồng ph n, mùi thơm dễ chịu Đây ợc em dòng hồng bụi hiếm, ợc r t nhiều ng ời yêu chuộng Cây hoa hồng th ờng ợc nhân gi ng vơ tính c c ph ơng ph p nh giâm hom, chiết gh p Tuy nhiên, c c ph ơng ph p th ờng òi h i thời gian c ng ao ộng hi hiệu thành c ng h ng cao, ặc biệt i v i gi ng hồng ngoại nhập Hơn nữa, gi ng ợc nhân lên ph ơng ph p truyền th ng th ờng xuyên bị nhiễm bệnh, từ ảnh h ởng t i sản ợng ch t ợng hoa [3] Nuôi c y mô thực vật ĩ thuật ợc sử dụng r t rộng rãi nông nghiệp ại, công cụ tiềm giúp nhân nhanh hiệu i v i nhiều loại thực vật Ở Việt Nam, c s công b nhân gi ng thành công hoa hồng cổ Sa Pa ph ơng ph p nu i c y mô [4], nhân gi ng cảm ứng hoa ng nghiệm hồng cơm [5], hồng tỉ muội [6] Đến ch a c b t kì cơng b ợc thực i t ợng hoa hồng Vân Khôi Ngày nhận bài: 11/1/2019 Ngày sửa bài: 19/3/2019 Ngày nhận ăng: 6/3/2019 Tác giả liên hệ: Trần Thị Thanh Huyền Địa e-mail: tranthanhhuyen@hnue.edu.vn 133 La Việt Hồng, Chu Đức Hà, Trần Thị Thanh Huyền, Lê Thị Lâm Mai Thị Hồng Nội dung nghiên cứu 2.1 Vật liệu phương pháp nghiên cứu * Vật liệu Cây hoa hồng Vân h i năm tuổi thu thập huyện Mộc Châu, tỉnh ơn La ợc trồng V ờn Thực nghiệm Sinh học, Khoa Sinh - Kĩ thuật N ng nghiệp, Đại học phạm Hà Nội Giá thể t ợc cung c p hãng Klasmann-Dei mann (Đức) * Phương pháp nghiên cứu - Tạo vật liệu khởi đầu in vitro: Sử dụng t thân (dài 2-3 cm chứa mắt ngủ ể khử trùng bề mặt cách rửa d i vòi n c chảy, sau ắc cồn 70% 2,5 - 5,0 - 10 phút kết hợp v i xử lí dung dịch Gia-ven 5% - 10 - 15 phút Rửa lại n c c t khử trùng - lần Mẫu ợc c y lên m i tr ờng Murashige Skoog (MS) có bổ sung 30 g/L saccarozơ, g/L agar Theo dõi tỉ lệ mẫu sạch, mẫu nhiễm sau tuần nuôi c y - Tái sinh nhân nhanh chồi in vitro: Tái sinh chồi in vitro: nuôi c y t thân (dài - cm chứa mắt ngủ ợc khử trùng bề mặt m i tr ờng MS [7] có bổ sung 30 g/L saccarozơ, g/L agar, bổ sung 6-benzylaminopurine (BAP) nồng ộ khác nhau, kí hiệu SI ÷ ; t ơng ứng v i nồng ộ 0,25 - 0,5 - 0,75 - 1,0 1,25 - 1,5 - 1,75 - 2,0 mg/L Theo d i c ịnh tiêu, bao gồm s chồi trung bình mẫu, chiều cao chồi trung bình (cm s trung bình/chồi sau tuần ni c y Nhân nhanh chồi in vitro: Sử dụng chồi m i tái sinh cắt thành c c oạn dài cm (chứa mắt ngủ ặt m i tr ờng M chứa g/L saccarozơ, , g/L agar, bổ sung BAP riêng lẻ (0,5 - 1,0 - 1,5 - 2,0 g/L) kết hợp v i α-naphthalene acetic acid (NAA) 0,25 - 0,5 (mg/L), kí hiệu c c c ng thức từ M1-1 Theo d i c ịnh tiêu bao gồm s chồi trung bình mẫu, chiều cao chồi trung bình (cm s trung bình chồi sau tuần nuôi c y - Tạo in vitro hồn chỉnh: Chồi in vitro có chiều cao - cm ợc nuôi c y m i tr ờng ½ MS, 30 g/L saccarozơ, g/L agar N c c nồng ộ - 0,25 - 0,5 - 0,75 - 1,0 (mg/L) X c ịnh tiêu: tỉ lệ rễ trung bình ( , s rễ trung bình chồi, chiều dài rễ trung bình (cm sau tuần nuôi c y - Rèn luyện in vitro thích nghi mơi trường tự nhiên: Cây in vitro có chiều cao - cm, có - rễ ợc sử dụng ể ơm vào gi thể bên gồm: T 1+ t (1:1), TS1, TS1 + phân chuồng ủ hoại (1:1) Theo d i c ịnh tỉ lệ s ng sót (%) sau tuần thí nghiệm - Phân tích thống kê: S liệu thực nghiệm ợc xử lí theo tham s th ng kê kiểm tra sai khác giá trị trung bình ph ơng ph p L D Fisher phần mềm Excel 2010 [8] S liệu thể bảng giá trị trung bình ± ộ lệch chuẩn, cột, chữ theo sau khác a, b, c… thể sai h c c ý nghĩa th ng kê v i α = 0,05 2.2 Kết thảo luận ế uả nguồn vật liệu khởi đầu Kết cho th y khử trùng bề mặt cồn 70% dung dịch javel 5% có hiệu quả, phụ thuộc vào thời gian xử lí Trong c ng thức cho hiệu khử trùng t t nh t xử lí cồn phút, sau ó xử lí dung dịch Ja-ven 5% 10 phút cho tỉ lệ mẫu s ng cao nh t ạt 79,0% (kết thể Bảng 1) 134 Nhân giống hoa hồng vân khôi (Rosa “Souvenir de la malmaison”) kĩ thuật nuôi cấy mô Bảng Kết tạo vật liệu khởi đầu từ đốt thân cho nuôi cấy in vitro Thời gian xử lí (phút) Cơng thức Cồn 70% Gia-ven 5% Tỉ lệ mẫu không nhiễm (%) Tỉ lệ mẫu nhiễm (%) Mẫu chết Mẫu sống 75,0a 0,0b 21,0e 10 67,0ab 11,0ab 32,0de I3 15 53,0bc 8,0ab 46,0cd I4 77,0a 17,0ab 22,0e 10 33,0cde 26,0ab 66,0abc I6 15 24,0de 22,0ab 75,0ab I7 45,0cd 22,0ab 54,0ab 10 20,0e 22,0ab 79,0a 15 28,0de 41,0a 71,0ab 19,0 30,0 19,0 I1 I2 2,5 I5 5,0 I8 10,0 I9 LSD0,05 ế uả inh nh n nh nh chồi in vitro * ế q ả sinh chồi in vitro BAP loại cytokinin thích hợp nh t ể kích thích hình thành chồi [9], vậy, nghiên cứu này, mẫu chứa mắt ngủ ợc ni c y ên m i tr ờng MS có bổ sung nhằm thúc ẩy qu trình ph t sinh chồi ết cho th y bổ sung BAP giúp kéo dài chồi, anh non (Hình Đ ng ý, m i tr ờng chứa , c c tiêu s chồi trung bình mẫu, chiều cao trung bình chồi s trung bình/chồi ợc cải thiện c ch c ý nghĩa, m i tr ờng chứa BAP 1,0 mg/L thích hợp nh t so v i c c c ng thức ại, cụ thể tiêu s chồi trung bình/mẫu, chiều cao chồi trung bình s trung bình/chồi lần ợt 2,75; 2,32 3,50 Bảng Tái sinh chồi in vitro từ đốt thân hoa hồng Vân Khôi sau tuần nuôi cấy Công thức BAP (mg/L) Số chồi/mẫu Chiều cao chồi trung bình (cm) Số trung bình/chồi SI1 0,25 1,50b 1,45c 3,75ab SI2 0,5 2,25ab 1,37c 2,62b SI3 0,75 2,50ab 2,60ab 3,50ab SI4 1,0 2,75a 2,32b 3,37ab SI5 1,25 1,75ab 2,82a 4,00a SI6 1,5 1,50b 2,70a 4,00a SI7 1,75 1,75ab 1,27c 4,25a SI8 2,0 1,50b 1,25c 2,75b 0,98 0,33 1,11 LSD0.05 * Môi trường MS, 30 g/L saccarozơ, 7,0 g/L agar (pH 5,8) 135 La Việt Hồng, Chu Đức Hà, Trần Thị Thanh Huyền, Lê Thị Lâm Mai Thị Hồng Hình Tái sinh chồi in vitro từ đốt thân hoa hồng Vân Khôi sau tuần nuôi cấy a Hoa hồng Vân Khôi, b-i: Tương ứng với công thức bổ sung BAP từ 0,25-2,00 (mg/L) với bước nhảy nồng độ 0,25 * ế q ả nhân nhanh chồi in vitro Bảng Nhân nhanh chồi hoa hồng Vân Khôi in vitro sau tuần nuôi cấy Thành phần bổ sung Số chồi/mẫu Chiều cao chồi (cm) Số lá/chồi Công thức BAP (mg/L) NAA (mg/L) SM1 0,5 1,80c 2,94c 6,00a SM2 1,0 1,80c 2,76c 3,40bc SM3 1,5 3,80b 3,58b 3,80b SM4 2,0 6,00a 4,70a 3,60b SM5 0,5 0,025 4,40b 1,76d 2,00de SM6 1,0 0,025 1,00c 1,60de 2,20cde SM7 1,5 0,025 1,00c 1,38ef 2,20cde SM8 2,0 0,025 1,60c 0,92g 3,00bcd SM9 0,5 0,05 1,20c 1,44ef 1,80de SM10 1,0 0,05 2,00c 1,26f 1,80de SM11 1,5 0,05 1,40c 0,94g 1,60e SM12 2,0 0,05 1,40c 0,44h 2,00de 1,05 0,26 1,16 LSD0,05 * 136 Môi trường MS chứa 30 g/L saccarozơ; 7,0 g/L agar (pH 5,8) Nhân giống hoa hồng vân khôi (Rosa “Souvenir de la malmaison”) kĩ thuật nuôi cấy mô M i tr ờng chứa BAP riêng lẻ BAP kết hợp NAA ảnh h ởng rõ rệt ến trình nhân nhanh chồi in vitro hoa hồng Vân Khôi Kết cho th y c ng thức M , m i tr ờng MS chứa BAP 2,0 mg/L thích hợp nh t cho nhân nhanh chồi in vitro, s chồi trung bình mẫu ạt 6,0 (chồi) v i chiều cao chồi trung bình ạt , (cm ( ảng , Hình d Trong hi , m i tr ờng BAP 1,5 mg/L (SM3) BAP 0,5 mg/L kết hợp NAA 0,025 mg/L (SM5) cho tỉ ệ s chồi trung bình, chiều cao trung bình chồi s trung bình/chồi bình mẫu t ơng i gi ng nhau, ần ợt , , ( ảng , Hình c e Mặt h c, c ịnh ợc c ng thức M1, bổ sung BAP 0,5 (mg/L), phù hợp nh t ể tạo chồi tái sinh (s trung bình chồi ạt , ( ảng , Hình a ết ợc giải thích hình thành nhân nhanh chồi in vitro ợc chứng phụ thuộc vào m i tr ờng chứa cytokinin khác [10] Nghiên cứu tr c ây ghi nhận cyto inin giúp ph ngủ chồi bên tỉ lệ bật chồi in vitro R hybrid [11] Hình Kết nhân nhanh chồi in vitro hoa hồng Vân Khôi a-d: Mẫu nuôi cấy môi trường BAP 0,5; 1,0; 1,5 2,0 (mg/L) e-h: Mẫu nuôi cấy môi trường BAP 0,5; 1,0; 1,5 2,0 (mg/L) + NAA 0,025 (mg/L) i-l: Mẫu nuôi cấy môi trường BAP 0,5; 1,0; 1,5 2,0 (mg/L) + NAA 0,5 (mg/L) ế uả đánh giá n ng ễ - tạo in vitro hoàn chỉnh Sự rễ chồi hoa hồng in vitro th ờng ợc cảm ứng ch t iều hòa thuộc nhóm auxin Các ch t iều hòa kích hoạt hình thành phức hệ t c ộng trực tiếp lên ARN mã hóa cho enzym hình thành rễ Trong nghiên cứu này, N ợc sử dụng ể ích thích rễ, tạo in vitro hoàn chỉnh Theo d i sau tuần nu i c y qu trình rễ chồi hoa hồng Vân Khôi in vitro phụ thuộc vào nồng ộ N ợc bổ sung m i tr ờng ni c y (Bảng , Hình Cụ thể, tỉ lệ rễ dao ộng từ 0-75 (%), tỉ ệ thuận v i nồng ộ NAA, cao nh t công thức R4 (NAA 0,75 mg/L ( ảng , Hình c Tuy nhiên, hi nồng ộ NAA 1,0 mg/L gây ìm hảm rễ, ( , Theo , rễ tạo nu i c y m hoàn chỉnh ạt t t nh t c ng thức , s rễ/chồi chiều dài rễ t t so v i công thức lại, lần ợt , , (cm ( ảng , Hình c 137 La Việt Hồng, Chu Đức Hà, Trần Thị Thanh Huyền, Lê Thị Lâm Mai Thị Hồng Bảng Kết rễ - tạo in vitro hồn chỉnh sau tuần ni cấy Công thức NAA* (mg/L) Tỉ lệ rễ (%) Số rễ/chồi Chiều dài rễ (cm) R1 0,00 0,00e 0,00d 0,00d R2 0,25 46,33d 2,75bc 3,20c R3 0,50 56,66c 4,00b 3,87b R4 0,75 75,00a 8,00a 4,82a R5 1,00 64,33b 2,25c 2,85c 1,81 1,31 0,63 LSD0,05 * Mơi trường ½ MS chứa 30 g/L saccarozơ; 7,0 g/L agar (pH 5,8) Hình Kết rễ - tạo hoa hồng in vitro hoàn chỉnh 0,25; 0,50; 0,75 1,00 (mg/L) a, b, c, d t ơng ứng v i công thức bổ sung NAA ế uả n u ện in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên Việc rèn luyện hoa hồng c y m h hăn m t n c nhanh, nhạy cảm v i ộ ẩm chúng Trong nghiên cứu này, in vitro hoàn chỉnh ợc rửa thạch ơm vào c c gi thể T 1+ t (1:1), TS1 + phân chuồng ủ hoại (1:1), TS Tỉ lệ s ng ( nu i c y m ý c ng thức sau tuần thí nghiệm t ơng i th p, lần ợt 35,5; 68,4 43,2 (%) (Hình 4) Hình Kết rèn luyện hoa hồng in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên a, b, c tương ứng với giá thể: TS1+đất (1:1), TS1, TS1 + phân chuồng ủ hoại (1:1) 138 Nhân giống hoa hồng vân khôi (Rosa “Souvenir de la malmaison”) kĩ thuật nuôi cấy mô Kết luận Đ t thân hoa hồng Vân h i ợc khử trùng bề mặt cồn 70% 10 phút, xử lí tiếp dung dịch javel 5% 10 phút cho tỉ lệ mẫu s ng ạt 79,0 ( M i tr ờng MS, 30 g/L saccarozơ, g/L agar, có bổ sung BAP phù hợp ể bật chồi từ mắt ngủ hoa hồng, nồng ộ BAP thích hợp nh t 1,0 mg/L nh t M i tr ờng t ơng tự nh ng bổ sung BAP 2,0 mg/L thích hợp cho nhân nhanh chồi in vitro, cho s chồi trung bình/mẫu ạt 6,0; chiều cao chồi trung bình 4,70 (cm) sau tuần nuôi c y M i tr ờng ½ MS, 30 g/L saccarozơ, g/L agar, bổ sung NAA (0,75 mg/L) thích hợp cho tạo rễ in vitro, tỉ lệ hình thành rễ cao nh t, ạt 75,0% Cây ợc trồng giá thể hỗn hợp TS1 cho tỉ lệ s ng sót cao nh t 68,4 (%) sau tuần rèn luyện TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] Rajeshbabu P., Gopalakrishnan M., Janarthanan B., Sekar T., 2001 An efficient and rapid regeneration protocol for micropropagation of Rosa bourboniana from nodal explants Int J Curr Biotechnol, 2, pp 24-29 Ali J., Chaudhry N.Y., Aftab F., 2014 In vitro development and improvement of chromium (VI)-affected adventitious roots of Solanum tuberosum L with GA3 and IAA application Pakistan J Bot, 46, 2, pp 687-692 Pati P.K., Kaur N., Sharma M., Ahuja P.S., 2010 In vitro propagation of rose Methods Mol Biol, 589, pp.163-176 Bùi Thị Thu H ơng, Đồng Huy Gi i, Nguyễn Thị Trang, Hồ Thị Quyên, 2017 Nhân nuôi hoa hồng cổ SaPa (Rosa gallica L.) kĩ thuật cấy mô in vitro Hội nghị Khoa học toàn qu c Sinh thái Tài nguyên sinh vật lần thứ tr.1229-1235 Nguyễn Thị h ơng Thảo, Đặng Quang Bích, Nguyễn Thị Thủy, Nguyễn Thị Thùy Linh, Phạm Thị Thu Hằng, Đặng Thị Thanh Tâm, Ninh Thị Thảo, Nguyễn Thị Lâm Hải, Nguyễn Thanh Hải, 2015 Nhân nhanh cảm ứng hoa in vitro hoa hồng cơm (Rosa sericea Lindl) Tạp chí Khoa học Phát triển, 13, 4, tr 606 - 613 Trịnh Thị H ơng, Nguyễn Ngọc Quỳnh Thơ, Trần Trọng Tu n, D ơng T n Nhựt, 2018 Nghiên cứu nhân giống vơ tính hoa in vitro hoa hồng tỉ muội (Rosa chinensis Jacq var Minima Redh) Kỉ yếu Hội thảo Khoa học Công nghệ Sinh học toàn qu c, tr 1392-1397 Murashige T.S., Skoog F., 1962 A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures Physiol Plantarum, 15, 3, tr 473-497 Nguyễn Văn M , La Việt Hồng, Ong Xuân Phong, 2013 Phương pháp nghiên cứu sinh lí học thực vật Nhà xu t Đại học Qu c gia Hà Nội Vijaya N., Satyanarayana G., 1991 Effect of culture media and growth regulators on in vitro propagation of rose In Horticulture - New technologies and applications: Proceedings of the International Seminar on New Frontiers in Horticulture, tr 209-214 Aboelhana E., 2012 In vitro propagation of Rosa hybrida L cv Al-Taif Rose plant African J Biotechnol, 11, 48, pp 10888-10893 Kapchina-Toteva V.V., van Telgen H.J., Yakimova E., 2000 Role of phenylurea cytokinin CPPU in apical dominance release in in vitro cultured Rosa hybrida L J Plant Growth Reg, 19, 2, tr 232-237 139 La Việt Hồng, Chu Đức Hà, Trần Thị Thanh Huyền, Lê Thị Lâm Mai Thị Hồng ABSTRACT Propagation of Rosa “Souvenir de la malmaison” by tissue culture techniques La Viet Hong1, Chu Duc Ha2, Tran Thi Thanh Huyen3, Le Thi Lam1 and Mai Thi Hong1 Faculty of Biology - Agricultural Technology, Hanoi Pedagogical University 2 Agricultural Genetics Institute, Vietnam Academy of Agricultural Sciences Faculty of Biology, Hanoi National University of Education In this study, stem segments of rose were used as explants The results showed that nodal stems were surface disinfected by immersing 70% etanol in 10 minutes, then treating in 5% javel solution, the rate of living-disinfected explants reached 79.0% The medium for in vitro generating shoot from domacy buds of stem was MS, 30 g/L sucrose, g/L agar and added 1.0 mg/L BAP The same medium being added 2.0 mg/L BAP was suitable for shoot multiplication, in which the average shoot number per explant, the average length of shoot were 6.0 and 4.70 (cm), respectively The ½ MS, 30 g/L sucrose, g/L agar and supplemented 0.75 mg/L NAA was effective for in vitro root formation, the rooting percent of microshoots reached 75.0% In vitro plantlets were acclimatized by growing in TS1 mixture substrate which had the highest survival rate (68.4%) after weeks hardening Keywords: Tissue culture, rose, technique, micropropagation, Van Khoi 140 ... 79,0% (kết thể Bảng 1) 134 Nhân giống hoa hồng vân khôi (Rosa “Souvenir de la malmaison”) kĩ thuật nuôi cấy mô Bảng Kết tạo vật liệu khởi đầu từ đốt thân cho nuôi cấy in vitro Thời gian xử lí... 0,44h 2,0 0de 1,05 0,26 1,16 LSD0,05 * 136 Môi trường MS chứa 30 g/L saccarozơ; 7,0 g/L agar (pH 5,8) Nhân giống hoa hồng vân khôi (Rosa “Souvenir de la malmaison”) kĩ thuật nuôi cấy mô M i tr... chồi in vitro hoa hồng Vân Khôi a-d: Mẫu nuôi cấy môi trường BAP 0,5; 1,0; 1,5 2,0 (mg/L) e-h: Mẫu nuôi cấy môi trường BAP 0,5; 1,0; 1,5 2,0 (mg/L) + NAA 0,025 (mg/L) i-l: Mẫu nuôi cấy môi trường