Xây dựng quy trình nhân nhanh giống hồng vân khôi (rosa “souvenir de la malmaison”) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH-KTNN *** LÊ THỊ LÂM XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG HOA HỒNG VÂN KHÔI (Rosa “Souvenir de la malmaison”) BẰNG KỸ THUẬT NI CẤY MƠ KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật HÀ NỘI, 2019 TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH-KTNN *** LÊ THỊ LÂM XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG HOA HỒNG VÂN KHƠI (Rosa “Souvenir de la malmaison”) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật Ngƣời hƣớng dẫn TS LA VIỆT HỒNG HÀ NỘI, 2019 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS La Việt Hồng-Khoa Sinh KTNN, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội tận tình hướng dẫn, động viên giúp đỡ tơi suốt q trình thực đề tài Tơi xin cảm ơn ban giám hiệu Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, ban chủ nhiệm Khoa Sinh-KTNN, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành khóa luận Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ môn Thực vật, Khoa sinh-KTNN, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi thiết bị, phương tiện để tơi hồn thành khóa luận Trong thời gian thực đề tài, nhận giúp đỡ tận tình Mai Thị Hồng-Phịng thí nghiệm Sinh lý học thực vật giúp đỡ, góp ý để tơi hồn thành đề tài khóa luận, nhân tơi xin gửi lời cảm ơn Cảm ơn gia đình bạn bè ln động viên góp ý cho tơi q trình học tập hồn thành đề tài Hà Nội , ngày 14 tháng 05 năm 2019 Sinh viên Lê Thị Lâm LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng số cộng khác Các số liệu, kết nghiên cứu khóa luận trung thực nghiên cứu Hà Nội, ngày 14 tháng 05 năm 2019 Sinh viên Lê Thị Lâm MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỞ ĐẦU 1 Lí chọn đề tài Mục đích nhiệm vụ nghiên cứu Phạm vi nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nguồn gốc phân bố hoa hồng 1.2 Vị trí phân loại hoa hồng 1.3 Đặc điểm hình thái giống hồng Vân Khôi 1.4 Điều kiện sinh thái 1.5 Giá trị hoa hồng 1.5.1 Giá trị sử dụng hoa hồng Vân Khôi 1.5.2 Giá trị kinh tế hoa hồng 1.5.3 Giá trị sinh thái hoa hồng .9 1.6 Tình hình sản xuất hoa hồng giới Việt Nam 1.6.1 Tình hình sản xuất hoa hồng giới 1.6.2 Tình hình sản xuất hoa hồng Việt Nam 10 1.7 Tình hình nghiên cứu giới Việt Nam 11 1.7.1 Tình hình nghiên cứu giới 11 1.7.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 13 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 15 2.1.1 Vật liệu thực vật 15 2.1.2 Vật liệu nghiên cứu 15 2.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 15 2.3 Dụng cụ thiết bị thí nghiệm 15 2.3.1 Dụng cụ .15 2.3.2 Thiết bị 15 2.4 Môi trƣờng nuôi cấy 15 2.5 Điều kiện phòng nuôi cấy 16 2.6 Phƣơng pháp nghiên cứu 16 2.6.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm 16 2.6.2 Phương pháp xử lí số liệu thống kê 18 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19 3.1 Tạo vật liệu khởi đầu 19 3.2 Tái sinh nhân nhanh chồi in vitro 20 3.3 Ra rễ-tạo in vitro hoàn chỉnh 25 3.4 Rèn luyện in vitro thích nghi với điều kiên tự nhiên 26 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .28 KẾT LUẬN 28 KIẾN NGHỊ 28 TÀI LIỆU THAM KHẢO 29 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt ARN BAP Cm Cs CT GA3 IBA Kin KTNN LSD MS NAA NaClO NXB o C Tên tiếng anh Tên tiếng việt Acid ribonucletid Benzyl animo purin Centimet Cộng Công thức Gibberelic acid Indol butyric acid Kinetin Kĩ thuật nông nghiệp Lysergic acid diethylamide Murashige Skoog α-Napthlacetic acid Natri hypochlorite Nhà xuất Độ Celsius DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Kết ảnh hưởng thời gian khử trùng mẫu lên trình tạo vật liệu khởi đầu 19 Bảng 3.2 Ảnh hưởng nồng độ BAP lên khả tái sinh chồi in vitro từ đốt thân hoa hồng Vân Khôi (sau tuần nuôi cấy) 21 Bảng 3.3 Ảnh hưởng nồng độ BAP, BAP kết hợp NAA lên khả nhân nhanh chồi hoa hồng Vân Khôi in vitro (sau tuần nuôi cấy) 23 Bảng 3.4 Ảnh hưởng nồng độ NAA đến khả hình thành rễ-tạo in vitro hồn chỉnh (sau tuần nuôi cấy) 25 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Cây hoa hồng Vân Khôi dùng làm vật liệu nghiên cứu…………5 Hình 3.1 Chồi bật từ đốt thân hồng Vân Khôi sau ngày (a) 14 ngày (b) nuôi cấy môi trường MS 20 Hình 3.2 Ảnh hưởng nồng độ BAP lên khả tái sinh chồi in vitro từ đốt thân hoa hồng Vân Khôi (sau tuần ni cấy) 22 Hình 3.3 Ảnh hưởng nồng độ BAP, BAP kết hợp NAA lên khả nhân nhanh chồi hoa hồng Vân Khôi in vitro (sau tuần ni cấy) 24 Hình 3.4 Ảnh hưởng nồng độ NAA đến khả hình thành rễ-tạo in vitro hồn chỉnh (sau tuần nuôi cấy) a, b, c, d tương ứng với công thức bổ sung NAA từ 0,25; 0,50; 0,75 1,00 (mg/l) 26 Hình 3.5 Ảnh hưởng giá thể lên khả sống sót, hình thành rễ điều kiện tự nhiên hồng Vân Khôi 26 Hình 3.6 Cây hồng Vân Khơi phát triển ngồi tự nhiên mơi trường TS1 + phân chuồng ủ hoại (1:1) tuần (a) tháng (b) 27 Hình 3.7 A: Giá thể TS1 hãng Klasmann-Deilmann (Đức) 27 B: Cây hoa hồng Vân Khôi dùng làm vật liệu nghiên cứu MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài Trong năm gần đây, cấu ngành nông nghiệp có thay đổi quan trọng dần chuyển sang sản xuất hàng hóa Trong cấu trồng bước khẳng định vị trí sản xuất nông nghiệp hoa mang nhiều lợi [9] Hoa hồng loại hoa thương mại quan trọng ngành công nghiệp hoa giới [28] Hoa hồng khơng có nhiều hình dáng, kích thước màu sắc khác mà cịn có hương thơm dịu dàng, quyễn rũ, hoa hồng dùng để sản xuất loại tinh dầu, vitamin C từ hoa hay thuốc chữa số bệnh ho, đường ruột đường hô hấp từ lá, lý mà hoa hồng mệnh danh “nữ hoàng” loài hoa Các nước Hà Lan, Colombia, Kenya, Israel, Italy, Hoa Kỳ Nhật Bản nước sản xuất hoa hồng hàng đầu giới [16] Hoa hồng thể cho hòa bình, tươi trẻ, hoa tình yêu, tình hữu nghị, niềm vui tốt lành [4] Thực tế cho thấy, nhu cầu tiêu thụ hoa hồng ngày lớn, để đáp thực tế trên, cần có biện pháp giải vấn đề giống nuôi trồng, đem lại lơi nhuận kinh tế cao cho người trồng hoa, giảm bớt giá thành cho người tiêu thụ hoa hướng tới xuất Do đó, nhu cầu cấp thiết giống cung cấp cho sản xuất phải cải tiến, cho chất lượng giống tốt suất cao Cây hoa hồng thường nhân giống vơ tính phương pháp giâm hom, chiết ghép Các phương pháp tốn công sức, thời gian hiệu thành công không cao, đặc biệt giống hồng ngoại Hơn nữa, giống nhân lên phương pháp truyền thống thường xuyên bị nhiễm bệnh, từ ảnh hưởng tới sản lượng chất lượng hoa [25] Hiện nay, phương pháp nhân giống kĩ thuật nuôi cấy mô đáp ứng nhu cầu trên, giúp cung cấp số lượng lớn bệnh, đồng đều, đặc biệt sản xuất số lượng lớn thời gian ngắn sản xuất quanh năm Việc áp dụng kĩ thuật nuôi cấy mô thúc đẩy nhanh việc đưa giống hồng Vân Khôi vào sản xuất đại trà, 1 b a Hình 3.6 Cây hồng Vân Khơi phát triển ngồi tự nhiên mơi trường TS1 tuần (a) tháng (b) Hình 3.7 Giá thể TS1 hãng Klasmann-Deilmann (Đức) 27 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN 1) Tạo vật liệu in vitro cho nuôi cấy mô: Đốt thân hoa hồng Vân Khôi khử trùng bề mặt Ethanol 70% 10 phút, xử lý tiếp dung dịch javel 5% 10 phút cho tỷ lệ mẫu sống đạt cao 2) Tái sinh nhân nhanh chồi in vitro: Môi trường MS, 30 g/l saccharose, g/l agar, có bổ sung BAP phù hợp để bật chồi từ mắt ngủ hoa hồng, nồng độ BAP thích hợp 1,0 mg/l Mơi trường MS, 30 g/l saccharose, g/l agar, có bổ sung BAP 2,0 (mg/l) mơi trường thích hợp cho nhân nhanh chồi in vitro, cho số chồi/mẫu đạt 6,00; chiều cao chồi 4,70 (cm) sau tuần nuôi cấy 3) Ra rễ-tạo in vitro hồn chỉnh: Mơi trường ½ MS, 30 g/l saccharose, g/l agar, bổ sung NAA (0,75 mg/l) thích hợp cho tạo rễ in vitro, tỷ lệ hình thành rễ cao nhất, đạt 75,0% 4) Rèn luyện in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên: Cây trồng giá thể hỗn hợp TS1 cho tỷ lệ sống sót cao 68,4% sau tuần rèn luyện KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu để tìm giá thể phù hợp cho tỷ lệ sống cao Đưa quy trình vào sản xuất tạo hoa hồng in vitro 28 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Đặng Quang Bích, Nguyễn Thị Lâm Hải, Nguyễn Thanh Hải, Phạm Thị Thu Hằng, Nguyễn Thị Thuỳ Linh, Đặng Thị Thanh Tâm, Ninh Thị Thảo, Nguyễn Thị Phương Thảo, Nguyễn Thị Thuỷ (2015), “Nhân nhanh cảm ứng hoa hoa hồng cơm (Rosa sericea lindl)”, Tạp chí khoa học phát triển, 13(4), 606-613 Lê Kim Cương, Nguyễn Phúc Huy, Nguyễn Thị Nhật Linh, Nguyễn Bá Nam, Dương Tấn Nhựt, Nguyễn Thị Kim Yến (2012), “Ảnh hưởng than hoạt tính lên khả định hướng rễ hồng môn cúc ni cấy in vitro”, Tạp chí Sinh học, 34(3), 377-388 Việt Chương, Lâm Thị Mỹ Hương (2006), “Kỹ thuật giâm, chiết, ghép hoa hồng”, NXB Thành phố Hồ Chí Minh Đặng Văn Đơng, Đinh Thế Lộc, Nguyễn Quang Thạch (2002), “Cây hoa hồng Kĩ thuật trồng”, Nhà xuất Lao động xã hội Đồng Huy Giới, Bùi Thị Thu Hương, Nguyễn Thị Trang, Hồ Thị Quyên (2017), “Nhân nuôi hoa hồng cổ SaPa (Rosa gallica L.) kỹ thuật cấy mô in vitro”, Hội nghị Khoa học toàn quốc Sinh thái Tài nguyên sinh vật lần thứ 7, 1229-1235 Đồng Huy Giới, Dương Thị Mến (2017), “Nghiên cứu sử dụng chế phẩm nano nuôi cấy mô Hồng cổ Sapa”, Tạp chí khoa học cơng nghệ nơng nghiệp Việt Nam, 5(78), 59-65 La Việt Hồng, Nguyễn Văn Mã, Ong Xuân Phong (2013), “Phương pháp nghiên cứu sinh lý học thực vật”, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội Trịnh Thị Hương, Dương Tấn Nhựt, Nguyễn Ngọc Quỳnh Thơ, Trần Trọng Tuấn (2018), “Nghiên cứu nhân giống vô tính hoa in vitro hoa hồng tỉ muội (Rosa chinensis Jacq var Minima Redh)”, NXB Khoa học Tự nhiên Công nghệ, 1392-1397 Mai Thị Ngoan (2009), “Đánh giá đặc điểm sinh trưởng, phát triển số giống hoa hồng (Rosa indica L.) nhập nội ảnh hưởng biện pháp cắt tỉa, xử lí chế Phẩm đến suất chất lượng hoa hồng VR41 Gia LâmHà Nội”, Luận văn thạc sĩ nông nghiệp, trường Đại học Nông nghiệp Hà nội 29 10 Nguyễn Thị Kim Thanh (2005), “Nhân giống hoa hồng kỹ thuật ni cấy invitro”, Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển nông thôn, 1, 39-41 11 Cao Thị Thanh (2007), “Phân tích tình hình sản xuất tiêu thụ hoa cấp độ nông hộ thành phố Đà Lạt”, Luận văn thạc sĩ Kinh tế, Bộ giáo dục đào tạo, Trường đại học Kinh tế thành phố Hồ Chí Minh 12 Nguyễn Quang Thạch (2000), “Trồng hoa xuất miền Bắc, hội thách thức”, Tạp chí Khoa học Tổ quốc, (12) Tài liệu tiếng Anh 13 Alsemaan T (2013), “Micropropagation of Damask Rose (Rosa damascena Mill.) cv.”, Almarah, International Journal of Agricultural Research, 8(4), 172-177 14 Asad S., Hameed N., Ali A., bajwa R., Vecherko N.A., Mursalieva VK (2010), “Factors affecting the growth and development of roses in vitro”, Biotechnol Theo Prac, 1, 41-52 15 Attia O., Attia, E L., Dessoky S., Dessoky and Adel E (2012), “In vitro propagation of Rosa hybrida L cv Al-Taif Rose plant”, African Journal of Biotechnology Vol, 11(48), 10888-10893 16 Evans A (2009) “Rose imports”, Floraculture Intl, 19, 42-43 17 Hameed N., Shabbir A., Ali A., bajwa R (2006), “In vitro micropropagation of disease free rose (Rosa indica L.)”, Mycopath, 4(2), 3538 18 Hartmann H T., Kester D E., Davies J F T., Geneve R L (2007), “Plant Hormones In: Plant Propagation: Principle and Practices”, 7th edition, Prentice-Hall, New Delhi, 292-320 19 Kapchina A V., Vanntelgen H J., Yakimova E (2000), “Role of phenylurea cytokinin CPPU in apical dominance release in in vitro cultured Rosa hybrida L.”, J Plant Growth Regul, 19, 232-237 20 Kim C J U., Jee S O., Chung J D (2003), “In vitro micropropagation of Rosa hybrida L.”, J Plant Biotechnol, 5, 115-119 21 Kumud S., Hem1 P., Vijay R (2015), “Micropropagation of rose cultivars: biotechnological application to floriculture”, J Environ Res Develop, 10(1), 40-46 30 22 Messeguer J., Mele E (1986), “Acclimatization of in vitro micropropagated roses In: Somers DA, Gegenbrach BG, Biesboer DD, Hackett WP, Grenn CE, editors Abstracts of the VI international congress of plant tissue and cell culture”, Univ Minnesota, 236 23 Murashige T., Skoog F (1962) “A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures”, Physiol Plant, 15, 473-497 24 Naphaporn N U., Kantamaht K and Kamnoon K (2009), “Micropropagation from cultured nodal explants of rose (Rosa hybrida L cv Perfume Delight)”, Songklanakarin Journal of Science and Technology, 31 (6), 583-586 25 Norton M E., Boe A (1982), “In vitro propagation of ornamental Rosaceous plants”, Hort, Sci, 17, 190-191 26 Omidi M., Yadollahi A., Eftekhari M (2016), “Comparative study of Rosa damascenes Mill And R Gallica micro-propagation”, Biological Forum-An International Journal, 8(1), 135 -145 27 Pati P K., Rath S P., Sharma M., Sood A., Ahuja P.S (2006), “In vitro propagation of rose-a review”, Biotechnology Advances, 24, 94-114 28 Rajeshbabu P M., Gopalakrishnan Janarthanan B., Sekar T (2014), “An efficient and rapid generation protocol for micropagation of rose bourboniana from nodal explants”, International Journal of Current Biotechnology, 2(1), 24-29 29 Shabbir A., Hameed N., AlI A and bajwa R (2009), “Effect of different cultural conditionson micropropagation of rose (Rose indica L.)”, Pakitans Journal of biological Sciences, 41 (6), 2877-2882 30 Vijaya N., Satyanarayana G., Prakash J., Pierik R.L.M (1991), “Effect of culture media and Growth Regulators on in vitro Propagation of rose”, Curr Plant Sci Biotechnol Agric, 12, 209-214 31 Vu N H., Anh P H., Nhut D T (2006), “The role of sucrose and different Cytokinin in the in vitro floral morphogenesis of rose (Hybrid tea) cv.”, First Prize, Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 87, 315-320 32 Wang G Y., Yuan M F., Hong Y (2002), “In vitro flower induction in roses”, In Vitro Cellular and Developmental Biology Plant, 38: 513-518 31 33 Zeng S J., Liang S., Zhang Y., Wu K L., Teixeirdasilva J A., Duan J (2013), “In vitro flowering red miniature rose”, Biologia Plantarum, 57(3), 401-409 Tài liệu Internet 34 https://www.baotintuc.vn/kinh-te/phat-trien-thuong-hieu-hoa-hong-taime-linh-ha-noi-20141115213105211.htm 35 https://vuonhoaviet.vn/mua-ban-hoa-hong-co-bach-van-khoi-o-dau-uytin-chat-luong 36 https://vi.wikipedia.org/wiki/hoa_h%E1%BB%93ng 37 http://www.thv.vn/ha-noi-phat-trien-thuong-hieu-hoa-hong-gan-voi-vungdat-me-linh-e3987.html 38 http://ceford.vn/tin-tuc/tinh-hinh-san-xuat-hoa-cay-canh-the-gioi-2017 32 39 PHỤ LỤC Môi trường MS tên loại môi trường tổng hợp pha sẵn, tên viết tắt Murashige and Skoog medium, phát minh nhà khoa học thực vật Toshio Murashige Skoog Folke K vào năm 1962 Murashige tìm kiếm loại hormone Bảng thành phần mơi trường MS Khống vi lượng µM CoCl2.6H2O 0.11 CuSO4.5H2O 0.10 FeNaEDTA 100.00 H3BO3 100.27 KI 5.00 MnSO4.H2O 100.00 Na2MoO4.2H2O 1.03 ZnSO4.7H2O 29.91 Khoáng đa lượng µM CaCl2 2.99 KH2PO4 1.25 KNO3 18.79 MgSO4 1.50 NH4NO3 20.61 Vitamins µM Glycine 26.64 myo-Inositol 554.94 Nicotinic acid 4.06 Pyridoxine HCl 2.43 Thiamine HCl 0.30 HNUE JOURNAL OF SCIENCE Natural Sciences 2019, Volume 64, Issue 3, pp 133-140 This paper is available online at http://stdb.hnue.edu.vn DOI: 10.18173/2354-1059.2019-0016 NHÂN GIỐNG CÂY HOA HỒNG VÂN KHÔI (Rosa “Souvenir de la malmaison”) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ La Việt Hồng1, Chu Đức Hà2, Trần Thị Thanh Huyền3, Lê Thị Lâm1 Mai Thị Hồng1 Khoa Sinh - Kỹ thuật Nông nghiệp, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Tóm tắt Trong nghiên cứu này, gi ng hoa hồng Vân Khôi (Rosa “Souvenir de la malmaison ợc sử dụng làm vật liệu cho thuật nu i c y m ết cho th y, t thân hoa hồng Vân h i ợc khử trùng bề mặt cồn 70% 10 phút, xử lý tiếp dung dịch javel 5% 10 phút cho tỷ lệ mẫu s ng ạt 79, Đ c ịnh ợc c ng thức m i tr ờng MS, g/l saccarozơ, g/l agar, có bổ sung 1,0 mg/l BAP phù hợp nh t ể bật chồi từ mắt ngủ hoa hồng M i tr ờng t ơng tự nh ng bổ sung BAP 2,0 mg/l thích hợp cho nhân nhanh chồi in vitro, s chồi trung bình/mẫu ạt 6, v i chiều cao trung bình chồi 4,7 (cm) sau tuần ni c y Tiếp theo, c ịnh ợc c ng thức m i tr ờng MS có bổ sung NAA 0,75 mg/l thích hợp cho tạo rễ in vitro v i tỷ lệ hình thành rễ cao nh t ạt 75, Cây ợc trồng giá thể hỗn hợp TS1 cho tỷ lệ s ng sót cao nh t ạt 68,4% sau tuần rèn luyện Từ khóa: c y m , hoa hồng, thuật, nhân gi ng, Vân h i Mở đầu Hoa hồng loại hoa th ơng mại quan trọng ngành công nghiệp hoa gi i [1] Hoa hồng ợc yêu thích có nhiều hình d ng, ích th c, màu sắc h c Đặc biệt hoa cịn có mùi thơm, nên hoa hồng ợc trồng ể sản xu t loại tinh dầu, vitamin C, ây lý mà hoa hồng ợc mệnh danh “nữ hồng lồi hoa [2] Trong s ó, hoa hồng Vân Khôi (Rosa “Souvenir De la Malmaison” gi ng hồng cổ h p, có ặc iểm bơng to màu hồng ph n, mùi thơm dễ chịu Đây ợc em dòng hồng bụi hiếm, ợc r t nhiều ng ời yêu chuộng Cây hoa hồng th ờng ợc nhân gi ng vơ tính c c ph ơng ph p nh giâm hom, chiết gh p Tuy nhiên, c c ph ơng ph p th ờng òi h i thời gian c ng lao ộng hi hiệu thành c ng h ng cao, ặc biệt i v i gi ng hồng ngoại nhập Hơn nữa, gi ng ợc nhân lên ph ơng ph p truyền th ng th ờng xuyên bị nhiễm bệnh, từ ó ảnh h ởng t i sản l ợng ch t l ợng hoa [3] Nuôi c y mô thực vật k thuật ợc sử dụng r t rộng rãi nông nghiệp ại, công cụ tiềm giúp nhân nhanh hiệu i v i nhiều loại thực vật Ở Việt Nam, có s cơng b nhân gi ng thành công hoa hồng cổ SaPa ph ơng ph p nu i c y mô [4], nhân gi ng cảm ứng hoa ng nghiệm hồng cơm [5], hồng tỉ muội [6] Đến ch a có b t kỳ công b ợc thực i t ợng hoa hồng Vân Khôi Ngày nhận bài: 27/12/2018 Ngày sửa bài: 19/3/2019 Ngày nhận ăng: 26/3/2019 Tác giả liên hệ: Trần Thị Thanh Huyền Địa e-mail: tranthanhhuyen@hnue.edu.vn 133 La Việt Hồng, Chu Đức Hà, Trần Thị Thanh Huyền, Lê Thị Lâm Mai Thị Hồng Nội dung nghiên cứu 2.1 Vật liệu phương pháp nghiên cứu 2.1.1 Vật liệu Cây hoa hồng Vân h i năm tuổi thu thập huyện Mộc Châu - tỉnh Sơn La ợc trồng v ờn thực nghiệm sinh học, hoa Sinh thuật n ng nghiệp, Đại học S phạm Hà Nội Giá thể t ợc cung c p hãng Klasmann-Deilmann (Đức) 2.1.2 Phương pháp nghiên cứu * Tạo vật liệu khởi đầu in vitro: Sử dụng t thân (dài 2-3 cm chứa mắt ngủ) ể khử trùng bề mặt cách rửa d i vòi n c chảy, sau ó lắc cồn 70% 2,5-5,0-10 phút kết hợp v i xử lý dung dịch javel 5% 5-10-15 phút Rửa lại n c c t khử trùng 2-3 lần Mẫu ợc c y lên m i tr ờng Murashige Skoog (MS) có bổ sung g/l saccarozơ, g/l agar Theo dõi tỷ lệ mẫu sạch, mẫu nhiễm sau tuần nuôi c y * Tái sinh nhân nhanh chồi in vitro: Tái sinh chồi in vitro: nuôi c y t thân (dài 2-3 cm chứa mắt ngủ ợc khử trùng bề mặt m i tr ờng MS [7] có bổ sung g/l saccarozơ, g/l agar, bổ sung 6-benzylaminopurine (BAP) nồng ộ khác nhau, kí hiệu SI 1÷8; t ơng ứng v i nồng ộ ,25- ,5- ,75-1, -1,25-1,51,75-2, mg/l Theo dõi c ịnh tiêu, bao gồm s chồi trung bình/mẫu, chiều cao chồi trung bình (cm s trung bình/chồi sau tuần nuôi c y Nhân nhanh chồi in vitro: Sử dụng chồi m i tái sinh cắt thành c c oạn dài cm (chứa mắt ngủ ặt m i tr ờng MS chứa g/l saccarozơ, 7, g/l agar, bổ sung BAP riêng lẻ (0,5-1,0-1,5-2,0 g/l) kết hợp v i α-naphthalene acetic acid (NAA) 0,25-0,5 (mg/l), kí hiệu c c c ng thức từ SM1-12 Theo dõi c ịnh tiêu bao gồm s chồi trung bình/mẫu, chiều cao chồi trung bình (cm s l trung bình/chồi sau tuần ni c y * Tạo in vitro hoàn chỉnh: Chồi in vitro có chiều cao 2-3 cm ợc ni c y m i tr ờng MS, g/l saccarozơ, g/l agar N c c nồng ộ -0,25-0,5-0,75-1,0 (mg/l) X c ịnh tiêu: tỷ lệ rễ trung bình ( , s rễ trung bình/chồi, chiều dài rễ trung bình (cm sau tuần ni c y * Rèn luyện in vitro thích nghi mơi trường tự nhiên: Cây in vitro có chiều cao 3-4 cm, có 3-5 rễ ợc sử dụng ể ơm vào gi thể bên gồm: TS1+ t (1:1), TS1, TS1 + phân chuồng ủ hoại (1:1) Theo dõi c ịnh tỷ lệ s ng sót (%) sau tuần thí nghiệm * Phân tích thống kê: S liệu thực nghiệm ợc xử lý theo tham s th ng kê kiểm tra sai khác giá trị trung bình ph ơng ph p LSD Fisher phần mềm Excel 2010 [8] S liệu thể bảng giá trị trung bình ± ộ lệch chuẩn, cột, chữ theo sau khác a, b, c… thể sai h c có ý nghĩa th ng kê v i α = 0,05 2.2 Kết thảo luận ế uả nguồn vật liệu khởi đầu Kết cho th y khử trùng bề mặt cồn 70% dung dịch javel 5% có hiệu quả, phụ thuộc vào thời gian xử lý Trong ó c ng thức cho hiệu khử trùng t t nh t xử lý 134 Nhân giống hoa hồng vân khôi (Rosa “Souvenir de la malmaison”) kĩ thuật nuôi cấy mô cồn phút, sau ó lý dung dịch javel 5% 10 phút cho tỷ lệ mẫu s ng cao nh t ạt 79,0% (kết thể Bảng 1) Bảng Kết tạo vật liệu khởi đầu từ đốt thân cho nuôi cấy in vitro Thời gian xử lý (phút) Công thức Cồn 70% Javel 5% Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Tỷ lệ mẫu không nhiễm (%) Mẫu chết Mẫu sống 75,0a 0,0b 21,0e 10 67,0ab 11,0ab 32,0de I3 15 53,0bc 8,0ab 46,0cd I4 77,0a 17,0ab 22,0e 10 33,0cde 26,0ab 66,0abc I6 15 24,0de 22,0ab 75,0ab I7 45,0cd 22,0ab 54,0ab 10 20,0e 22,0ab 79,0a 15 28,0de 41,0a 71,0ab 19,0 30,0 19,0 I1 I2 2,5 I5 5,0 I8 10,0 I9 LSD0,05 ế uả inh nh n nh nh chồi in vitro * ết tái sinh chồi in vitro BAP loại cytokinin thích hợp nh t ể kích thích hình thành chồi [9], vậy, nghiên cứu này, mẫu chứa mắt ngủ ợc nuôi c y lên m i tr ờng MS có bổ sung nhằm thúc ẩy qu trình ph t sinh chồi ết cho th y bổ sung BAP giúp kéo dài chồi, l anh non (Hình Đ ng ý, m i tr ờng chứa , c c tiêu s chồi trung bình/mẫu, chiều cao trung bình chồi s trung bình/chồi ợc cải thiện c ch có ý nghĩa, ó m i tr ờng chứa BAP 1,0 mg/l thích hợp nh t so v i c c c ng thức lại, cụ thể tiêu s chồi trung bình/mẫu, chiều cao chồi trung bình s trung bình/chồi lần l ợt 2,75; 2,32 3,50 Bảng Tái sinh chồi in vitro từ đốt thân hoa hồng Vân Khôi sau tuần nuôi cấy Công thức BAP (mg/l) Số chồi/mẫu Chiều cao chồi trung bình (cm) Số trung bình/chồi SI1 0,25 1,50b 1,45c 3,75ab SI2 0,5 2,25ab 1,37c 2,62b SI3 0,75 2,50ab 2,60ab 3,50ab SI4 1,0 2,75a 2,32b 3,37ab SI5 1,25 1,75ab 2,82a 4,00a SI6 1,5 1,50b 2,70a 4,00a SI7 1,75 1,75ab 1,27c 4,25a SI8 2,0 1,50b 1,25c 2,75b 135 La Việt Hồng, Chu Đức Hà, Trần Thị Thanh Huyền, Lê Thị Lâm Mai Thị Hồng LSD0.05 0,98 * 0,33 1,11 Môi trường MS, 30 g/l saccarozơ, 7,0 g/l agar (pH 5,8) Hình Tái sinh chồi in vitro từ đốt thân hoa hồng Vân Khôi sau tuần nuôi cấy a hoa hồng Vân Khôi, b-i: tương ứng với công thức bổ sung BAP từ 0,25-2,00 (mg/l) với bước nhảy nồng độ 0,25 * ết nhân nhanh chồi in vitro Bảng Nhân nhanh chồi hoa hồng Vân Khôi in vitro sau tuần nuôi cấy Thành phần bổ sung Công thức 136 Số chồi/mẫu Chiều cao chồi (cm) Số lá/chồi BAP (mg/l) NAA (mg/l) SM1 0,5 1,80c 2,94c 6,00a SM2 1,0 1,80c 2,76c 3,40bc SM3 1,5 3,80b 3,58b 3,80b SM4 2,0 6,00a 4,70a 3,60b SM5 0,5 0,025 4,40b 1,76d 2,00de SM6 1,0 0,025 1,00c 1,60de 2,20cde SM7 1,5 0,025 1,00c 1,38ef 2,20cde SM8 2,0 0,025 1,60c 0,92g 3,00bcd SM9 0,5 0,05 1,20c 1,44ef 1,80de SM10 1,0 0,05 2,00c 1,26f 1,80de SM11 1,5 0,05 1,40c 0,94g 1,60e SM12 2,0 0,05 1,40c 0,44h 2,00de Nhân giống hoa hồng vân khôi (Rosa “Souvenir de la malmaison”) kĩ thuật nuôi cấy mô LSD0,05 1,05 0,26 1,16 Môi trường MS chứa 30 g/l saccarozơ; 7,0 g/l agar (pH 5,8) M i tr ờng chứa BAP riêng lẻ BAP kết hợp NAA ảnh h ởng rõ rệt ến trình nhân nhanh chồi in vitro hoa hồng Vân Khôi Kết cho th y c ng thức SM4, m i tr ờng MS chứa BAP 2,0 mg/l thích hợp nh t cho nhân nhanh chồi in vitro, s chồi trung bình/mẫu ạt 6,0 (chồi) v i chiều cao chồi trung bình ạt 4,7 (cm ( ảng 3, Hình 2d Trong hi ó, m i tr ờng BAP 1,5 mg/l (SM3) BAP 0,5 mg/l kết hợp N , 25 mg/l (SM5 cho tỷ lệ s chồi trung bình, chiều cao trung bình chồi s trung bình/chồi bình/mẫu t ơng i gi ng nhau, lần l ợt 3,8 4,4 ( ảng 3, Hình 2c 2e Mặt h c, c ịnh ợc c ng thức SM1, bổ sung BAP 0,5 (mg/l), phù hợp nh t ể tạo chồi tái sinh (s l trung bình/chồi ạt 6, ( ảng 3, Hình 2a ết ợc giải thích hình thành nhân nhanh chồi in vitro ợc chứng phụ thuộc vào m i tr ờng chứa cytokinin khác [10] Nghiên cứu tr c ây ghi nhận cyto inin giúp ph ngủ chồi bên tỷ lệ bật chồi in vitro R hybrid [11] * Hình Kết nhân nhanh chồi in vitro hoa hồng Vân Khôi a-d: mẫu nuôi cấy môi trường BAP 0,5; 1,0; 1,5 2,0 (mg/l) e-h: mẫu nuôi cấy môi trường BAP 0,5; 1,0; 1,5 2,0 (mg/l) + NAA 0,025( mg/l) i-l: mẫu nuôi cấy môi trường BAP 0,5; 1,0; 1,5 2,0 (mg/l) + NAA 0,5 (mg/l) ế uả đánh giá n ng ễ - tạo in vitro hoàn chỉnh Sự rễ chồi hoa hồng in vitro th ờng ợc cảm ứng ch t iều hòa thuộc nhóm auxin Các ch t iều hịa kích hoạt hình thành phức hệ t c ộng trực tiếp lên ARN mã hóa cho enzym hình thành rễ Trong nghiên cứu này, N ợc sử dụng ể ích thích rễ, tạo in vitro hoàn chỉnh Theo dõi sau tuần nu i c y qu trình rễ chồi hoa hồng Vân Khôi in vitro phụ thuộc vào nồng ộ N ợc bổ sung m i tr ờng ni c y (Bảng 4, Hình Cụ thể, tỷ lệ rễ dao ộng từ -75 ( , tỷ lệ thuận v i nồng ộ NAA, cao nh t công thức (N ,75 mg/l ( ảng 4, Hình 3c Tuy nhiên, hi nồng ộ N 137 La Việt Hồng, Chu Đức Hà, Trần Thị Thanh Huyền, Lê Thị Lâm Mai Thị Hồng 1, mg/l gây ìm hảm rễ, (64,33 Theo ó, rễ tạo nu i c y m hoàn chỉnh ạt t t nh t c ng thức 4, s rễ/chồi chiều dài rễ t t so v i cơng thức cịn lại, lần l ợt 8, 4,82 (cm ( ảng 4, Hình 3c Bảng Kết rễ - tạo in vitro hồn chỉnh sau tuần ni cấy Công thức NAA* (mg/l) Tỷ lệ rễ (%) Số rễ/chồi Chiều dài rễ (cm) R1 0,00 0,00e 0,00d 0,00d R2 0,25 46,33d 2,75bc 3,20c R3 0,50 56,66c 4,00b 3,87b R4 0,75 75,00a 8,00a 4,82a R5 1,00 64,33b 2,25c 2,85c 1,81 1,31 0,63 LSD0,05 * Mơi trường ½ MS chứa 30 g/l saccarozơ; 7,0 g/l agar (pH 5,8) Hình Kết rễ - tạo hoa hồng in vitro hoàn chỉnh 0,25; 0,50; 0,75 1,00 (mg/l) a, b, c, d t ơng ứng v i công thức bổ sung NAA ế uả n u ện in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên Việc rèn luyện hoa hồng c y m hó hăn m t n c nhanh, nhạy cảm v i ộ ẩm chúng Trong nghiên cứu này, in vitro hoàn chỉnh ợc rửa thạch ơm vào c c gi thể TS1+ t (1:1), TS 1, TS1 + phân chuồng ủ hoại (1:1) Tỷ lệ s ng ( nu i c y m lý c ng thức sau tuần thí nghiệm t ơng i th p, lần l ợt 35,5; 68,4 43,2 (%) (Hình 4) 138 Nhân giống hoa hồng vân khôi (Rosa “Souvenir de la malmaison”) kĩ thuật ni cấy mơ Hình Kết rèn luyện hoa hồng in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên a, b, c tương ứng với giá thể: TS1+đất (1:1), TS1, TS1 + phân chuồng ủ hoại (1:1) Kết luận Đ t thân hoa hồng Vân h i ợc khử trùng bề mặt cồn 70% 10 phút, xử lý tiếp dung dịch javel 5% 10 phút cho tỷ lệ mẫu s ng ạt 79,0 ( M i tr ờng MS, g/l saccarozơ, g/l agar, có bổ sung BAP phù hợp ể bật chồi từ mắt ngủ hoa hồng, ó nồng ộ BAP thích hợp nh t 1,0 mg/l nh t M i tr ờng t ơng tự nh ng bổ sung BAP 2,0 mg/l thích hợp cho nhân nhanh chồi in vitro, cho s chồi trung bình/mẫu ạt 6,0; chiều cao chồi trung bình (cm) 4,70 (cm) sau tuần nuôi c y M i tr ờng MS, g/l saccarozơ, g/l agar, bổ sung NAA (0,75 mg/l) thích hợp cho tạo rễ in vitro, tỷ lệ hình thành rễ cao nh t, ạt 75,0% Cây ợc trồng giá thể hỗn hợp TS1 cho tỷ lệ s ng sót cao nh t 68,4 (%) sau tuần rèn luyện TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] Rajeshbabu P., Gopalakrishnan M., Janarthanan B., Sekar T., 2001 An efficient and rapid regeneration protocol for micropropagation of Rosa bourboniana from nodal explants Int J Curr Biotechnol, 2, tr 24-29 Ali J., Chaudhry N.Y., Aftab F., 2014 In vitro development and improvement of chromium (VI)-affected adventitious roots of Solanum tuberosum L with GA3 and IAA application Pakistan J Bot, 46, 2, tr 687-692 Pati P.K., Kaur N., Sharma M., Ahuja P.S., 2010 In vitro propagation of rose Methods Mol Biol, 589, tr.163-176 Bùi Thị Thu H ơng, Đồng Huy Gi i, Nguyễn Thị Trang, Hồ Thị Quyên, 2017 Nhân nuôi hoa hồng cổ SaPa (Rosa gallica L.) kỹ thuật cấy mơ in vitro Hội nghị Khoa học tồn qu c Sinh thái Tài nguyên sinh vật lần thứ tr.1229 - 1235 Nguyễn Thị h ơng Thảo, Đặng Quang Bích, Nguyễn Thị Thủy, Nguyễn Thị Thùy Linh, Phạm Thị Thu Hằng, Đặng Thị Thanh Tâm, Ninh Thị Thảo, Nguyễn Thị Lâm Hải, Nguyễn Thanh Hải, 2015 Nhân nhanh cảm ứng hoa in vitro hoa hồng cơm (Rosa sericea Lindl) Tạp chí Khoa học Phát triển, 13, 4, tr.606 - 613 Trịnh Thị H ơng, Nguyễn Ngọc Quỳnh Thơ, Trần Trọng Tu n, D ơng T n Nhựt, 2018 Nghiên cứu nhân giống vô tính hoa in vitro hoa hồng tỉ muội (Rosa chinensis Jacq var Minima Redh) Kỷ yếu Hội thảo Khoa học Cơng nghệ Sinh học tồn qu c, tr 1392-1397 Murashige T.S., Skoog F., 1962 A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures Physiol Plantarum, 15, 3, tr.473-497 Nguyễn Văn M , La Việt Hồng, Ong Xuân Phong, 2013 Phương pháp nghiên cứu sinh lý học thực vật Nhà xu t Đại học Qu c gia Hà Nội Vijaya N., Satyanarayana G., 1991 Effect of culture media and growth regulators on in vitro propagation of rose In Horticulture - New technologies and applications: Proceedings of the International Seminar on New Frontiers in Horticulture, tr.209-214 Aboelhana E., 2012 In vitro propagation of Rosa hybrida L cv Al-Taif Rose plant African J Biotechnol, 11, 48, pp 10888-10893 Kapchina-Toteva V.V., van Telgen H.J., Yakimova E., 2000 Role of phenylurea cytokinin CPPU in apical dominance release in in vitro cultured Rosa hybrida L J Plant Growth Reg, 19, 2, tr.232-237 139 La Việt Hồng, Chu Đức Hà, Trần Thị Thanh Huyền, Lê Thị Lâm Mai Thị Hồng ABSTRACT Propagation of rosa “souvenir de la malmaison” by tissue culture techniques La Viet Hong1, Chu Duc Ha2, Tran Thi Thanh Huyen3, Le Thi Lam1 and Mai Thi Hong1 Faculty of Biology - Agricultural technology, Hanoi Pedagogical University 2 Agricultural Genetics Institute, Vietnam Academy of Agricultural Sciences Faculty of Biology, Hanoi National University of Education In this study, stem segments of rose were used as explants The results shown that nodal stems were surface disinfected by immersing 70% etanol in 10 minutes, then treating in 5% javel solution, the rate of living-disinfected explants reached 79.0% The medium for in vitro generating shoot from domacy buds of stem was MS, 30 g/l sucrose, g/l agar and added 1.0 mg/l BAP The same medium, which was added 2.0 mg/l BAP, was suitable for shoot multiplication, in which the average shoot number per explant, the average length of shoot were 6.0 and 4.70 (cm), respectively The ½ MS, 30 g/l sucrose, g/l agar and supplemented 0.75 mg/l NAA was effective for in vitro root formation, the rooting percent of microshoots reached 75.0% In vitro plantlets were acclimatized by growing in TS1 mixture substrate which had the highest survival rate (68.4%) after weeks hardening Keywords: Tissue culture, rose, technique, micropropagation, Van Khoi 140 ... lựa chọn thực nghiên cứu đề tài: ? ?Xây dựng quy trình nhân nhanh giống hồng Vân Khôi (Rosa “Souvenir de la malmaison”) kĩ thuật nuôi cấy mô? ?? để đưa quy trình nhân nhanh phù hợp, tạo số lượng lớn,... LÂM XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG HOA HỒNG VÂN KHÔI (Rosa “Souvenir de la malmaison”) BẰNG KỸ THUẬT NI CẤY MƠ KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật Ngƣời hƣớng dẫn TS LA. .. paper is available online at http://stdb.hnue.edu.vn DOI: 10.18173/2354-1059.2019-0016 NHÂN GIỐNG CÂY HOA HỒNG VÂN KHÔI (Rosa “Souvenir de la malmaison”) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ La Việt Hồng1 , Chu