Đáp ứng miễn dịch tự nhiên của tôm thẻ chân trắng, Penaeus vannamei, cảm nhiễm bởi vi khuẩn gây hoại tử gan tụy cấp Vibbrio parahaemolyticus

Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch tự nhiên của tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) cảm nhiễm bởi vi khuẩn V. parahaemolyticus thông qua phương pháp ngâm được thực hiện trong điều kiện phòng thí nghiệm trong thời gian 120 giờ. Kết quả thí nghiệm cho thấy chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus sử dụng gây cảm nhiễm trên tôm thẻ (2 - 3 g) với liều gây chết 50% (LD50) là 4,7 × 106 CFU/mL. Không có sự khác biệt về các chỉ tiêu miễn dịch giữa nghiệm thức đối chứng và nghiệm thức gây nhiễm ở thời điểm 0 h. Tuy nhiên, ở thời điểm 24 và 48 h, tổng tế bào máu, hoạt tính phenoloxidase và hoạt tính của gốc oxy hoá tự do (respiratory burst) ở tôm cảm nhiễm bởi V. parahaemolyticus giảm đáng kể và khác biệt có ý nghĩa so với nhóm đối chứng (P < 0,05). Ở các thời điểm thu mẫu tiếp theo (72, 96 và 120 giờ) thì không có sự khác biệt về tổng tế bào máu, hoạt tính phenoloxidase và hoạt tính của gốc oxy hoá tự do giữa hai nghiệm thức. Từ kết quả này có thể kết luận rằng hệ thống miễn dịch tự nhiên của tôm thẻ bị suy yếu do cảm nhiễm vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tuỵ cấp V. parahaemolyticus.

80 Trường Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Innate immune responses of whiteleg shrimp (Penaeus vannamei ) experimentally infected with acute hepatopancreas necrosis disease-causing Vibbrio parahaemolyticus Tuan V Vo∗ , Truc T T Nguyen, & Binh T T Vo Faculty of Fisheries, Nong Lam University, Ho Chi Minh City, Vietnam ARTICLE INFO Research Paper Received: March 22, 2018 Revised: August 29, 2018 Accepted: September 18, 2018 Keywords Immune responses Penaeus vannamei Vibrio parahaemolyticus ∗ Corresponding author Vo Van Tuan Email: vovantuan@hcmuaf.edu.vn ABSTRACT The innate immune responses of the whiteleg shrimps (Penaeus vannamei ) experimentally challenged with V parahaemolyticus by immersion were investigated for a period of 120 h The results showed that the lethal dose 50% (LD50 ) of shrimps (2 - g) challenged with V parahaemolyticus was 4.7 × 106 CFU/mL No significant differences in immune parameters were observed between the control and challenged group right after challenge (0 hpi) However, the total haemocyte count, phenoloxidase activity and respiratory burstsactivity were decreased in the challenged shrimps after 24 and 48 hpi and significantly different from those in the control shrimps (P < 0,05) At 72, 96 and 120 hpi, there were no significant differences in the total haemocyte count, phenoloxidase activity and respiratory burst activity between two treatments The observations of this study showed that the innate immune responses of the whiteleg shrimp were decreased due to the infection by V parahaemolyticus Cited as: Vo, T V., Nguyen, T T T., & Vo, B T T (2019) Innate immune responses of whiteleg shrimp (Penaeus vannamei ) experimentally infected with acute hepatopancreas necrosis diseasecausing Vibbrio parahaemolyticus The Journal of Agriculture and Development 18(1), 80-88 Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển 18(1) www.jad.hcmuaf.edu.vn 81 Trường Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Đáp ứng miễn dịch tự nhiên tôm thẻ chân trắng, Penaeus vannamei, cảm nhiễm vi khuẩn gây hoại tử gan tụy cấp Vibbrio parahaemolyticus Võ Văn Tuấn∗ , Nguyễn Thị Thanh Trúc & Võ Thị Thanh Bình Khoa Thủy Sản, Trường Đại Học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh, TP Hồ Chí Minh THÔNG TIN BÀI BÁO Bài báo khoa học Ngày nhận: 22/03/2018 Ngày chỉnh sửa: 29/08/2018 Ngày chấp nhận: 18/09/2018 Từ khóa Đáp ứng miễn dịch Penaeus vannamei Vibrio parahaemolyticus ∗ Tác giả liên hệ Võ Văn Tuấn Email: vovantuan@hcmuaf.edu.vn TÓM TẮT Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch tự nhiên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) cảm nhiễm vi khuẩn V parahaemolyticus thông qua phương pháp ngâm thực điều kiện phòng thí nghiệm thời gian 120 Kết thí nghiệm cho thấy chủng vi khuẩn V parahaemolyticus sử dụng gây cảm nhiễm tôm thẻ (2 - g) với liều gây chết 50% (LD50 ) 4,7 × 106 CFU/mL Khơng có khác biệt tiêu miễn dịch nghiệm thức đối chứng nghiệm thức gây nhiễm thời điểm h Tuy nhiên, thời điểm 24 48 h, tổng tế bào máu, hoạt tính phenoloxidase hoạt tính gốc oxy hố tự (respiratory burst) tôm cảm nhiễm V parahaemolyticus giảm đáng kể khác biệt có ý nghĩa so với nhóm đối chứng (P < 0,05) Ở thời điểm thu mẫu (72, 96 120 giờ) khơng có khác biệt tổng tế bào máu, hoạt tính phenoloxidase hoạt tính gốc oxy hố tự hai nghiệm thức Từ kết kết luận hệ thống miễn dịch tự nhiên tôm thẻ bị suy yếu cảm nhiễm vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tuỵ cấp V parahaemolyticus Đặt Vấn Đề Tôm thẻ, Penaeus vannamei, lồi tơm ni phổ biến vùng Western (Menz & Blake, 1980) chiếm khoảng 95% tổng sản lượng tôm nuôi (Lightner, 2011) Với việc gia tăng diện tích ni thâm canh hóa dẫn đến xuất lây lan nhiều tác nhân gây bệnh nguy hiểm (Lightner, 2011), đặc biệt bệnh vi khuẩn virus Những năm gần đây, ngành ni tơm giới nói chung Việt Nam nói riêng phải đối mặt với dịch bệnh với tên gọi ban đầu hội chứng chết sớm (early mortality syndrome – EMS) hay bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (Acute hepatopancreas necrosis syndrome – APHND) tôm thẻ chân trắng Khả bệnh bùng phát lây lan nhanh Bệnh xuất Trung Quốc (2009), sau lây lan nhanh sang Việt Nam (2010), Malaysia (2011), Thái Lan (2012), Mexico (2014), Philippines (2015) (Zorriehzahra & Banaederakhshan, 2015) www.jad.hcmuaf.edu.vn Hệ thống miễn dịch giáp xác nói chung tơm nói riêng thiếu yếu tố cần thiết cho đáp ứng miễn dịch đặc hiệu tế bào lympho T, phân tử MHC (major histocompatability) Ig Quá trình đề kháng giáp xác chủ yếu dựa vào chế đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu (miễn dịch tự nhiên), tế bào máu giữ vai trò quan trọng trình đáp ứng miễn dịch giáp xác nhằm chống lại tác nhân gây bệnh vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng (Bachere & ctv., 2004; Jose & ctv., 2010; Matozzo & Marin, 2010) Tế bào máu giáp xác tham gia trực tiếp vào trình nhận diện, thực bào, phong toả sản sinh hợp chất kháng khuẩn phenoloxidase, gốc oxy hoá tự (reactive oxygen intermediates), superoxide dismutase (Song & Hsieh, 1994; Herández-López & ctv., 1996; Dantas-Lima & ctv., 2013) Quá trình thực bào giáp xác, đặc biệt tôm thẻ (Penaeus vannamei ) tác nhân vi khuẩn gây bệnh Vibrio harveyi, Vibrio campbellii nghiên cứu tác giả (Vo & ctv., 2015) Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển 18(1) 82 Phương pháp phân tích tiêu miễn dịch nghiên cứu tôm xanh (Macrobrachium rosenbergii ) (Dang & ctv., 2012) Các nghiên cứu trình đáp ứng miễn dịch tự nhiên tôm thẻ cảm nhiễm vi khuẩn Vibrio alginolyticus ghi nhận (Liu & ctv., 2004; Tseng & Chen, 2004; Hsu & Chen, 2007) Tuy nhiên, có nghiên cứu khả đáp ứng miễn dịch tự nhiên tôm thẻ sau bị cảm nhiễm tác nhân vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (Vibrio parahaemolyticus) Do đó, mục tiêu đề tài nhằm đánh giá khả đáp ứng miễn dịch tự nhiên tôm thẻ cảm nhiễm vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp Vật Liệu Phương Pháp Nghiên Cứu 2.1 Vật liệu nghiên cứu Tôm thẻ (PL11 ), nhập từ Trại sản xuất tôm giống bệnh công ty Việt Úc, nuôi hệ thống tuần hoàn Trại thực nghiệm Thuỷ sản – Khoa Thuỷ sản, Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM Tôm cho ăn lần/ngày với 5% trọng lượng thân Nhiệt độ nước bể trì mức 27 ➧ 10 C, pH 7,5 - 8,0, độ mặn 12 ➧ g/L, độ kiềm > 80 mg/L, ammonia tổng < 0,5 mg/L, nitrite < 0,15 mg/L Tôm với trọng lượng từ - g chọn để tiến hành thí nghiệm Trường Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh đường chuẩn CFU/mL = (11,92 × OD610 nm – 1,13) × 108 (số liệu chưa cơng bố) 2.2.2 Phương pháp xác định LD50 (Lethal Dose 50%) chủng vi khuẩn V parahaemolyticus Thí nghiệm xác định giá trị LD50 bố trí theo phương pháp hồn tồn ngẫu nhiên với bốn nghiệm thức có liều gây nhiễm chênh lệch 10 lần nghiệm thức đối chứng không gây nhiễm Vi khuẩn sau tăng sinh môi trường TSB, bổ sung 1% NaCl, nhiệt độ 300 C với số vòng lắc 150 vòng/phút Sau tiến hành gây bệnh thực nghiệm cách cho trực tiếp huyền phù vi khuẩn vào bể thí nghiệm 50 L (chứa 18 L nước L canh vi khuẩn) để đạt nồng độ pha lỗng 10−1 Sau đó, lấy L nước từ bể cho vào bể thứ hai chứa 18 L nước để đạt nồng độ pha loãng 10−2 Tiếp tục làm cho cho bể thứ ba thứ tư để đạt nồng độ pha lỗng 10−3 10−4 Tơm ngâm giờ, sau rửa qua nước biển với độ mặn 12 ➧ g/L bố trí vào bể thí nghiệm chứa 20 L nước Mỗi bể bố trí 20 tơm (2 - g/con) tương ứng với nồng độ pha loãng lặp lại lần Tôm bể đối chứng ngâm 20 L nước với lượng TSB với lượng TSB chứa huyền phù vi khuẩn bể thí nghiệm Thí nghiệm theo dõi 10 ngày Tơm có biệu bệnh lý thu mẫu (gan tụy) cấy phân lập môi trường TCBS môi trường chọn lọc Chromagar Vibrio Giá trị LD50 tính theo công thức (Reed & Muench, 1938): Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tuỵ cấp (EMS/APHND) phân lập, định danh giữ giống (-800 C) phòng thí nghiệm Bệnh học Thuỷ sản, Khoa Thuỷ sản, logLD50 = log(tỷ lệ chết > 50%) + (log(10−1 ) trường Đại học Nơng Lâm TP.HCM × pd) = y 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Vi khuẩn điều kiện nuôi cấy Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus phục hồi môi trường TCBS (Thiosulfate Citrate Bile Salt), bổ sung 1% NaCl, nhiệt độ 280 C 24 Chọn khuẩn lạc cấy sang môi trường TSA (Tryptic Soya Agar), bổ sung 1% NaCl, nhiệt độ 280 C 24 Sau chọn khuẩn lạc riêng lẻ tăng sinh môi trường TSB (Tryptic Soya Broth), bổ sung 1% NaCl, nhiệt độ 300 C với số vòng lắc 150 vòng/phút Mật độ vi khuẩn xác định máy đo quang phổ bước sóng 610 nm, sau quy đổi dựa cơng thức Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển 18(1) pd = ((tỷ lệ chết > 50%) – 50)/((tỷ lệ chết > 50%) – (tỷ lệ chết < 50%)) LD50 = 10y Liều gây chết 50% = (nồng độ vi khuẩn huyền phù ban đầu) × 10y 2.2.3 Thí nghiệm xác định tiêu miễn dịch tơm Thí nghiệm xác định tiêu miễn dịch bố trí ngẫu nhiên hệ thống bể composit 50 L (chứa 20 L nước), sục khí liên tục Nhiệt độ nước dao động từ 27 ➧ 10 C, pH 7,5 – 8,0, độ mặn 12 ➧ g/L, độ kiềm > 80 mg/l, ammonia tổng < 0,5 mg/l, nitrite < 0,15 mg/L Tơm thẻ – g bố trí vào bể với số lượng www.jad.hcmuaf.edu.vn Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh 10 con/ bể/ thời điểm thu mẫu lặp lại lần Tôm sau bố trí vào bể tiếp tục dưỡng ngày Tôm gây bệnh thông qua phương pháp ngâm (dựa vào kết LD50 chủng vi khuẩn V parahaemolyticus) Tôm nghiệm thức đối chứng ngâm 20 L nước với lượng TSB (Trytic Soya Broth) với lượng TSB chứa huyền phù vi khuẩn bể thí nghiệm Sau gây cảm nhiễm, mẫu tôm thu vào thời điểm 0, 24, 48, 72, 96 120 để lấy máu xác định tiêu miễn dịch Mỗi bể thu ngẫu nhiên 2.2.4 Phương pháp phân lập định danh vi khuẩn Vi khuẩn từ mẫu tôm bệnh tái phân lập môi trường TCBS Chromagar Vibrio (bổ sung 1% NaCl) Thu mẫu tôm bệnh, tách phần gan tuỵ tôm nghiền dung dịch đệm sPBS (shrimp phosphate buffer saline) Hút 0,1 mL dịch nghiền cho vào môi trường TCBS (1% NaCl), tran ủ 24 300 C Chọn khuẩn lạc riêng lẻ cấy môi trường TCBS, TSA Chromagar Vibrio (1% NaCl) Quan sát hình dạng, màu sắc khuẩn lạc tiến hành định danh vi khuẩn IDS 14 GRNS (14 phản ứng sinh hoá dùng để định danh trực khuẩn gram âm) Công ty Nam Khoa 83 theo phương pháp Dantas-Lima & ctv (2013) Máu tôm thu ống tiêm vô trùng (1 mL) có chứa dung dịch chống đơng, sau đem ly tâm với lực ly tâm 500 xg 10 phút 40 C Phần dịch phía loại bỏ phần viên cố định dung dịch marine fixative (2% glutaraldehyde + 2% saccharose) 30 phút 40 C Mẫu máu trãi lên lam thủy tinh, làm khô, cố định phút ethanol, rửa nước cất nhuộm với haematoxylin eosin Quan sát tiêu vật kính hiển vi (100X) đếm tổng 200 tế bào (Hrubec & ctv., 2000) Định loại tế bào (tb/mL) = (số lượng loại tế bào × tổng tế bào máu)/200 2.2.6 Phương pháp xác định hoạt tính phenoloxidase (PO) Hoạt tính phenoloxidase xác định dựa theo phương pháp Herández-López & ctv (1996) với số hiệu chỉnh Mẫu máu sau thu ly tâm với lực ly tâm 500 xg 10 phút 40 C, sau loại bỏ phần dịch phía Phần viên hòa tan mL dung dịch đệm cacodylate-citrate (0,01 M sodium cacodylate, 0,45 M sodium chloride 0,1 M trisodium citrate, pH 7,0) Ly tâm lần 500 xg 10 phút 40 C, loại bỏ phần dịch, phần viên lại hòa tan với 200 µL dung 2.2.5 Phương pháp phân tích tiêu miễn dịch đệm cacodylate (0,01M sodium cacodylate, dịch 0,45M sodium chloride, 0,01 M calcium chloride Các tiêu miễn dịch tổng tế bào máu, 0,26 M magnesiumchloride, pH 7,0) 100 µL định loại tế bào máu (tế bào không hạt, tế bào mẫu cho vào đĩa 96 giếng (96-cell culture bán hạt tế bào hạt), khả tạo hợp plates), cho tiếp 50 µL trypsin (1 mg/mL) vào chất kháng khuẩn dựa vào tài liệu nghiên cứu ủ 10 phút nhiệt độ phòng Sau đó, Song & Hsieh, 1994; Herández-López & ctv., 50 µL L-DOPA (3 mg/mL) cho vào ủ 1996; Dantas - Lima & ctv., 2013; Vo & ctv., 2015 10 phút Tiếp theo, cho 800 µL dung dịch đệm cacodylate vào Đọc kết máy so màu Tổng tế bào máu: máu tôm thu quang phổ (microplate reader) bước sóng 490 cách dùng ống tiêm vơ trùng 1mL có chứa dung nm Mẫu đối chứng gồm có 100 µL mẫu, 50 µL dịch chống đông (marine anticoagulant: 450 mM đệm cacodylate (thay trypsin) 50 µL LNaCl, 100 mM glucose, 30 mM trisodium citrate, DOPA (L-3,4-dihydroxyphenylalanine) 26 mM citric acid, 10 mM EDTA, pH 5,4) với tỷ lệ 1:1 (200 µL dung dịch chống đơng: 200 µL 2.2.7 Phương pháp xác định hoạt tính gốc oxy hố máu tơm) Mật độ tế bào máu xác định tự (respiratory burst) buồng đếm hồng cầu quan sát kính hiển vi (40X) Hoạt tính respiratory burst xác định theo Tổng tế bào máu (tb/mL) = tổng tế bào đếm phương pháp Song & Hsieh (1994) với lớn × 2500 × hệ số pha lỗng vài hiệu chỉnh Mẫu máu sau thu ly tâm 500 xg 10 phút 40 C, loại bỏ phần dịch (Hansen, 2000) Định loại tế bào máu: qui trình thực phía trên, sau phần viên hòa tan tiêu bản, nhuộm định loại tế bào thực mL môi trường nuôi cấy tế bào (L-15 medium) www.jad.hcmuaf.edu.vn Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển 18(1) 84 100 µL mẫu máu cho vào đĩa 96 giếng ủ nhiệt độ 27-280 C 30 phút Loại bỏ phần dịch, sau cho vào 100 µL zymosan (0,1% zymosan Hanks’ solution minus phenol red, Sigma) Ủ 30 phút nhiệt độ 27-280 C, loại bỏ zymosan, tế bào máu rửa lần với 100 µL dung dịch sPBS (shrimp phosphate buffered saline) Mẫu nhuộm với 100 µL dung dịch nitroblue tetrazolium chloride (NBT) (0,3%) 30 phút nhiệt độ phòng, loại bỏ dung dịch NBT Tế bào máu sau rửa lần với 100 µL methanol 70%, để khơ, hòa tan cách thêm vào 120 µL KOH 2M 140 µL dimethyl sulphoxide Mẫu đo máy microplate reader bước sóng 630 nm Trường Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Hình Hình thái khuẩn lạc Vibrio parahaemolyticus mơi trường TCBS Chromagar Vibrio 1,13) × 108 cho thấy, mật độ vi khuẩn V parahaemolyticus bình tăng sinh gốc đạt 7,5 × 108 CFU/ml Như vậy, liều gây nhiễm nghiệm thức NT 10−1 , NT 10−2 , NT 10−3 , NT 2.2.8 Phương pháp phân tích thống kê 10−4 , tương ứng với liều vi khuẩn gây nhiễm lần 106 CFU/mL, Tất số liệu xử lý phần mềm lượt 7,55 × 10 CFU/mL, 7,5 × Microsoft Excel thơng qua trắc nghiệm T-test với 7,5 × 10 CFU/mL, 7,5 × 10 CFU/mL Từ kết này, chúng tơi tính tốn liều LD50 mức ý nghĩa 0,05% (theo phương pháp Reed & Muench, 1938) chủng vi khuẩn V parahaemolyticus 4,7 × Kết Quả Thảo Luận 106 CFU/mL 3.1 Liều LD50 chủng vi khuẩn V parahaemolyticus Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus tác nhân vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm xuất thời gian qua gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành cơng nghiệp ni tơm tồn cầu (Tran & ctv., 2013; Lee & ctv., 2015) Từ kết thí nghiệm, chúng tơi nhận thấy rằng, tơm gây nhiễm chủng vi khuẩn V parahaemolyticus xuất triệu chứng bệnh lờ đờ, phản xạ chậm vài có dấu hiệu bỏ ăn sau ngày gây nhiễm Tôm bắt đầu chết sau ngày gây nhiễm số lượng tôm chết tăng dần đến ngày thứ 10 Phần gan tuỵ tôm bệnh nhạt màu, mềm dễ ấn nhẹ Kết phân lập tơm có biểu bệnh cho thấy, vi khuẩn cho khuẩn lạc màu xanh mơi trường TCBS màu tím hoa cà mơi trường Chromagar Vibrio (Hình 1) Kết định danh chứng minh được, vi khuẩn có đặc điểm sinh hoá phù hợp với chủng V parahaemolyticus Số lượng tỷ lệ tơm chết trung bình nghiệm thức thí nghiệm xác định liều gây chết 50% động vật thí nghiệm (LD50 ) trình bày qua Bảng Kết kiểm tra mật độ vi khuẩn máy đo quang phổ bước sóng 610 nm (OD610 nm ) quy đổi dựa công thức đường chuẩn CFU/mL = (11,92 × OD610 nm – Tạp chí Nông nghiệp Phát triển 18(1) Các kết nghiên cứu trước cho thấy rằng, liều LD50 chủng Vibrio cao hay thấp tuỳ thuộc vào chủng vi khuẩn, phương pháp gây nhiễm kích cỡ tơm Theo Robertson & ctv (1998), liều LD50 vi khuẩn V harveyi tôm thẻ post-larvae gây nhiễm phương pháp ngâm 5,0 × 106 CFU/mL Trong liều LD50 vi khuẩn V alginolyticus tơm sú post-larvae 2,5 × 106 CFU/mL (Thakur & ctv., 2003) Nghiên cứu gần Lopez-Leon & ctv (2016) cho thấy, liều LD50 chủng vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tôm thẻ Penaeus vannamei (0,1 - 0,5 g) phương pháp ngâm (trong 72 giờ) 6,0 × 104 CFU/mL đến 3,0 × 105 CFU/mL Trong thí nghiệm này, tơm với kích cỡ - g gây nhiễm phương pháp ngâm với giá trị LD50 đạt 4,7 × 106 CFU/mL Kết thu khác biệt đáng kể so với nghiên cứu Robertson & ctv (1998) Thakur & ctv (2003), nhiên cao so với kết nghiên cứu Lopez-Leon & ctv (2016) Sự khác biệt khác biệt kích cỡ tơm, thời gian gây nhiễm độc tính chủng vi khuẩn V parahaemolyticus Kết cho thấy, khả đề kháng tôm nhỏ vi khuẩn V parahaemolyticus so với tôm lớn www.jad.hcmuaf.edu.vn 85 Trường Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Bảng Số lượng tỷ lệ tơm chết thí nghiệm xác định LD50 Nghiệm thức (NT) NT 10−1 NT 10−2 NT 10−3 NT 10−4 Lần lặp lại 3 3 Số tơm bố trí/lần lặp lại 20 20 20 20 3.2 Đáp ứng miễn dịch tự nhiên tôm thẻ cảm nhiễm vi khuẩn V parahaemolyticus 3.2.1 Tổng tế bào máu loại tế bào Kết thực tiêu máu nhuộm với hematoxylin eosin cho thấy, có loại tế bào ghi nhận: tế bào không hạt (hyaline cells), tế bào bán hạt (semi-granular cells), tế bào hạt (granular cells) Kết phù hợp với kết nghiên cứu trước phân loại tế bào máu giáp xác (Să oderhă all & Smith, 1983; van de Braak & ctv., 1996; Dantas-Lima & ctv., 2013)(Hình 2) Hình Hình thái tế bào máu tôm thẻ chân trắng (A: tế bào cố định dung dịch marine fixative; B: tế bào nhuộm với hematoxylin eosin) Kết định lượng cho thấy khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê (P > 0,05) tổng tế bào máu nghiệm thức đối chứng nghiệm thức gây nhiễm vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus thời điểm Tổng tế bào máu nghiệm thức đối chứng nghiệm thức gây nhiễm 43,9 ➧ 6,8 × 105 tế bào/mL 41,2 ➧ 8,2 × 105 tế bào/mL Tổng tế bào máu nghiệm thức gây nhiễm giảm 19% (33,4 ➧ 6,1 Ö 105 tế bào/mL) 24% (31,4 ➧ 5,9 × 105 tế bào/mL) sau 24 48 gây nhiễm với vi khuẩn V parahaemolyticus khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng (P < 0,05) Ở thời điểm thu mẫu (72, 96 120 giờ) khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê tổng tế bào máu nghiệm thức đối chứng nghiệm thức gây www.jad.hcmuaf.edu.vn Số tôm chết cộng dồn 35 15 4,3 1,3 Số tôm sống cộng dồn 9,3 26,3 45,0 Tỷ lệ chết cộng dồn (%) 100,00 61,64 14,13 2,88 nhiễm (Bảng 2) Kết tương tự với kết nghiên cứu Hsieh & ctv (2008) tôm thẻ cảm nhiễm vi khuẩn Vibrio alginolyticus Kết định loại tế bào cho thấy, khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê tỷ lệ tế bào không hạt, tế bào bán hạt tế bào hạt nghiệm thức đối chứng nghiệm thức gây nhiễm hầu hết thời điểm thu mẫu Tuy nhiên, thời điểm 24 giờ, ghi nhận khác biệt có ý nghĩa thống kê tỷ lệ tế bào không hạt, tế bào bán hạt tế bào hạt nghiệm thức đối chứng nghiệm thức gây nhiễm (P < 0,05) Tế bào khơng hạt nhóm đối chứng chiếm tỷ lệ thấp nhóm gây nhiễm vi khuẩn V parahaemolyticus (đối chứng: 65,6% nghiệm thức: 78,9%), tế bào bán hạt tế bào hạt lại chiếm tỷ lệ cao (tế bào bán hạt nhóm đối chứng 22,2% nghiệm thức 13,3%; tế bào hạt nhóm đối chứng 14,0% nghiệm thức 7,7% ) Riêng tế bào hạt khác biệt có ý nghĩa thống kê ghi nhận thời điểm 48 (Bảng 2) Tế bào hạt nghiệm thức gây nhiễm có khuynh hướng giảm dần sau tăng ổn định trở lại Sự biến động chế đáp ứng miễn dịch tự nhiên giáp xác, tiêu để đánh giá đáp ứng miễn dịch tự nhiên tôm Theo Johansson & ctv (2000), tế bào máu giáp xác giữ vai trò quan trọng hệ thống miễn dịch, thực chức thực bào, đóng gói, lưu trữ phóng thích prophenoloxidase Sau cảm nhiễm vi khuẩn V parahaemolyticus, hệ miễn dịch tơm bị suy yếu Điều đồng nghĩa với biến động tế bào máu theo chiều hướng giảm, triệu chứng bình thường trình đáp ứng miễn dịch tự nhiên giáp xác trường hợp nhiễm bệnh Kết nghiên cứu Hsieh & ctv (2008) chứng minh rằng, tổng tế bào máu tôm thẻ giảm đáng kể sau bị cảm nhiễm vi khuẩn V alginolyticus khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm đối chứng Song & ctv (2003) cho thấy rằng, tổng tế bào máu (bao gồm tế bào hạt) giảm đáng kể sau Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển 18(1) 86 Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh Tế bào bán hạt (× 105 tb/mL) ĐC NT 7,4 ➧ 1,0 8,3 ➧ 0,8 11,0 ➧ 0,9* 4,5 ➧ 1,6* 10,2 ➧ 4,2 4,7 ➧ 0,5 5,9 ➧ 2,1 7,8 ➧ 2,7 9,6 ➧ 3,1 10,6 ➧ 4,1 8,4 ➧ 4,2 8,3 ➧ 3,5 ➧ độ lệch chuẩn Ký hiệu (*) thể khác biệt có ý nghĩa thống kê hai nghiệm thức (P < 0,05) Tế bào khơng hạt (× 105 tb/mL) ĐC NT 30,6 ➧ 5,7 28,4 ➧ 6,1 31,7 ➧ 3,5* 26,2 ➧ 3,1* 30,5 ➧ 3,8 24,6 ➧ 5,5 40,0 ➧ 10,9 33,0 ➧ 5,8 41,0 ➧ 12,3 39,5 ➧ 2,3 41,0 ➧ 9,7 35,5 ➧ 4,2 Bảng Số lượng tỷ lệ tơm chết thí nghiệm xác định LD50 Thời gian thu mẫu (giờ) 24 48 72 96 120 Các giá trị thể bảng số trung bình tơm bị nhiễm Taura syndrome virus Ở thời điểm thu mẫu 72, 96 120 giờ, khơng có khác biệt tổng tế bào máu tỷ lệ phần trăm tế bào không hạt, tế bào bán hạt tế bào hạt hai nghiệm thức Lý giải cho tượng hệ miễn dịch tôm dần phục hồi trở lại Kết nghiên cứu gần giống kết nghiên cứu Hsu & Chen (2007) Penaeus vannamei cảm nhiễm vi khuẩn Vibrio alginolyticus 3.2.2 Hoạt tính Phenoloxidase Phenoloxidase enzyme quan trọng hệ thống miễn dịch tự nhiên giáp xác Enzyme kích hoạt lượng nhỏ thành phần vách tế bào vi khuẩn lipopolysaccharides (LPS) β-1,3-glucans từ nấm (Perazzolo & ctv., 1997; Sritunyalucksana & ctv., 2000) Khi giáp xác bị mầm bệnh cơng, enzyme kích hoạt nhằm bất hoạt ngăn chặn lan truyền tác nhân gây bệnh Do đó, dựa vào hoạt tính phenoloxidase, đánh giá trình đáp ứng miễn dịch tự nhiên giáp xác Tế bào hạt (× 105 tb/mL) ĐC NT 5,9 ➧ 2,4 4,5 ➧ 2,5 6,9 ➧ 1,3* 2,7 ➧ 1,5* 6,1 ➧ 2,4* 2,1 ➧ 0,8* 5,6 ➧ 0,7 4,0 ➧ 1,5 6,9 ➧ 1,7 5,6 ➧ 1,4 3,5 ➧ 0,7 4,1 ➧ 0,8 Tổng tế (× 105 ĐC 43,9 ➧ 6,8 49,6 ➧ 2,9* 46,8 ➧ 7,4* 51,5 ➧ 12,4 57,5 ➧ 9,5 52,9 ➧ 12,2 bào máu tb/mL) NT 41,2 ➧ 8,2 33,4 ➧ 6,1* 31,4 ➧ 5,9* 44,8 ➧ 9,5 55,7 ➧ 5,5 47,9 ➧ 7,8 Trong nghiên cứu này, hoạt tính phenoloxidase nghiệm thức gây nhiễm vi khuẩn V parahaemolyticus giảm đáng kể sau 24 48 h gây nhiễm khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm đối chứng (P < 0,05), sau ổn định đến hết thời gian thí nghiệm (Hình 3) Ngun nhân thay đổi hệ thống đáp ứng miễn dịch tự nhiên tôm bị suy yếu Theo Wang & Chen (2005), hoạt tính phenoloxidase tơm thẻ tăng có tăng lên tổng tế bào máu, bao gồm tế bào không hạt tế bào hạt Kết phù hợp với kết nghiên cứu Hsieh & ctv (2008) Ngoài ra, nghiên cứu Le Moullac & Haffner (2000) cho thấy rằng, lượng mã hoá enzyme prophenoloxidase giảm đến 60% tôm Litopenaeus stylirostris bị gây stress yếu tố mơi trường (NH3 ) Do đó, chúng tơi thiết nghĩ, suy giảm hoạt tính phenoloxidase nghiên cứu kết suy giảm lượng mã hố enzyme prophenoloxidase tơm bị nhiễm vi khuẩn V parahaemolyticus 3.2.3 Hoạt tính Respiratory burst Hoạt tính gốc oxy hố tự (respiratory burst) khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê (P > 0,05) nghiệm thức đối chứng Tạp chí Nông nghiệp Phát triển 18(1) www.jad.hcmuaf.edu.vn 87 Trường Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Kết Luận Tổng tế bào máu, hoạt tính phenoloxidase hoạt tính respiratory burst tơm nhóm gây nhiễm vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus ghi nhận thời điểm 24 48 có khuynh hướng giảm khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm đối chứng Ở thời điểm thu mẫu (72, 96 120 giờ) khơng có khác biệt hai nghiệm thức Như vậy, khả đáp ứng miễn dịch tự nhiên tôm thẻ Penaeus vannamei bị suy yếu sau tôm bị vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus cơng Hình Sự thay đổi hoạt tính phenoloxidase sau tôm bị cảm nhiễm vi khuẩn V parahaemolyticus nghiệm thức gây nhiễm vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus thời điểm h Tuy nhiên, sau 24 48 gây nhiễm, hoạt tính respiratory burst giảm đáng kể khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm đối chứng (P < 0,05) Ở thời điểm thu mẫu tiếp theo, khơng có khác biệt hoạt tính respiratory burst nghiệm thức (Hình 4) Sự khác biệt chức miễn dịch tự nhiên tôm bị suy yếu sau tôm bị cảm nhiễm vi khuẩn V parahaemolyticus Wang & Chen (2005) chứng minh rằng, gia tăng hoạt tính respiratory burst kết gia tăng tổng tế bào máu, bao gồm tế bào không hạt tế bào hạt Tuy nhiên, hoạt tính enzyme NADPH-oxidase (giữ vai trò quan trọng q trình giải phóng oxy hoạt hố superoxide anion) giảm tơm bị nhiễm bệnh, kết hoạt tính respiratory burst giảm Tài Liệu Tham Khảo (References) Bachere, E., Gueguen, Y., Gonzalez, M., De Lorgeril, J., Garnier, J., & Romestand, B (2004) Insights into the anti-microbial defense of marine invertebrates: the penaeid shrimps and the oyster Crassostrea gigas Immunological Reviews 198, 149-168 Dang, O T H., Le, T H., & Nguyen, P T (2012) Optimization and application of protocols for immune response analysis in Macrobrachium rosenbergii Can Tho University Journal of Science 21b, 10-18 Dantas-Lima, J J., Vo, T V., Corteel, M., Grauwet, K., An, N T T., Sorgeloos, P., & Nauwynck, H J (2013) Separation of Penaeus vannamei haemocyte subpopulations by iodixanol density gradient centrifugation Aquaculture 408-409, 128-135 Hansen (2000) Use of a hemacytometer Laboratory procedures, Department of Animal Sciences, University of Florida, Florida, USA Hernández-López, J., Gollas-Galván, T., & VargasAlbores, F (1996) Activation of the prophenoloxidase system of the brown shrimp (Penaeus californiensis, Holmes) Comparative Biochemical Physiology 113C (1), 61-66 Hrubec, C T., Cardinale, J L., & Smith, S A (2000) Hematology and plasma chemistry reference intervals for cultured tilapia (Oreochromis hydrid) Veterinary Clinical Pathology 29(1), 7-12 Hsieh, S L., Ruan, Y H., Li, Y C., Hsieh, P S., Hu, C H., & Kuo, C M (2008) Immune and physiological responses in Pacific white shrimp (Penaeus vannamei) to Vibrio alginolyticus Aquaculture 275(1-4), 335-341 Hsu, S W., & Chen, J C (2007) The immune response of white shrimp Penaeus vannamei and its susceptibility to Vibrio alginolyticus under sulfide stress Aquaculture 271(1-4), 61-69 Hình Sự thay đổi hoạt tính respiratory burst sau tơm bị cảm nhiễm vi khuẩn V parahaemolyticus www.jad.hcmuaf.edu.vn Johansson, M W., Keyser, P., Sritunyalucksana, K., & Să oderhă all, K (2000) Crustacean haemocytes and haematopoiesis Aquaculture 191(1-3), 45-52 Jose, S., Mohandas, A., Philip, R., & Bright Singh, I S (2010) Primary hemocyte culture of Penaeus monodon as an in vitro model for white spot syndrome Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển 18(1) 88 Trường Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh virus titration, viral and immune related gene expression and cytotoxicity assays Journal of Invertebrate Pathology 105(3), 312-321 Le Moullac, G., & Haffner, P (2000) Environmental factors affecting immune responses in Crustacea Aquaculture 191(1-3), 121-131 Lee, C T., Chen, I T., Yang, Y T., Ko, T P., Huang, Y T., Huang, J Y., Huang, M F., Lin, S J., Chen, C Y., Lin, S S., Lightner, D V., Wang, H C., Wang, A H., Wang, H C., Hor, L I., & Lo, C F (2015) The opportunistic marine pathogen Vibrio parahaemolyticus becomes virulent by acquiring a plasmid that expresses a deadly toxin Proceedings of National Academy of Sciences U.S.A 112(34), 10798-10803 Lightner, D (2011) Virus diseases of farmed shrimp in the Western Hemisphere (the Americas): A review Journal of Invertebrate Pathology 106(1), 110-130 Liu, C H., Yeh, S T., Cheng, S Y., & Chen, J C (2004) The immune response of white shrimp Litopenaeus vannamei and its susceptibility to Vibrio infection in relation with the moult cycle Fish & Shellfish Immunology 16(2), 151-161 Lopez-Leon, P., Luna-Gonzalez, A., Escamilla-Montes, R., Flores-Miranda, M C., Fierro-Coronado, J A., Alvarez-Ruiz, P., & Diarte-Plata, G (2016) Isolation and characterization of infectious Vibrio parahaemolyticus, the causative agent of AHPND, from the whiteleg shrimp (Litopenaeus vannamei) Latin American Journal of Aquatic Research 44(3), 470-479 Matozzo, V., & Marin, M G (2010) The role of haemocytes from the crab Carcinus aestuarii (Crustacea, Decapoda) in immune responses: A first survey Fish & Shellfish Immunology 28(4), 534-541 Menz, A., & Blake, B F (1980) Experiments on the growth of Penaeus vannamei Boone Journal of Experimental Marine Biology and Ecology 48(2), 99-111 Perazzolo, L M., & Barracco, M A (1997) The prophenoloxidase activating system of the shrimp Penaeus paulensis and associated factors Developmental Comparative Immunology 21, 385-395 Reed, L J., & Muench, H (1938) A simple method of estimating fifty per cent endpoints American Journal of Hygiene 27(3), 493-497 Robertson, P A W., Calderon, J., Carrera, L., Stark, J R., Zherdmant, M., & Austin, B (1998) Experimental Vibrio harveyi infections in Penaeus vannamei larvae Diseases of Aquatic Organism 32(2), 151-155 Song Y L., & Hsieh Y T (1994) Immunostimulation of tiger shrimp (Penaeus monodon) hemocytes for generation of micribicidal substances: Analysis of reactive oxygen species Developmental and Comparative Immunology 18(3), 201-209 Song, Y L., Yu, C I., Lien, T W., Huang, C C., & Lin, M N (2003) Haemolymph parameters of Pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei) infected with Taura syndrome virus Fish & Shellfish Immunology 14(4), 317-331 Sritunyalucksana, K., & Să oderhă all, K (2000) The proPO and clotting system in crustaceans Aquaculture 191, 53-69 Thakur, A B., Vaidya, R B., & Suryawanshi S A (2003) Pathogenicity and antibiotic susceptibility of Vibrio species isolated from moribund shrimps Indian Journal of Marine Sciences 32(1), 71-75 Tran, L H., Nunan, L., Redman, R.M., Mohney, L L., Pantoja, C R., Fitzsimmons, K., & Lightner, D V (2013) Determination of the infectious nature of the agent of acute hepatopancreatic necrosis syndrome affecting penaeid shrimp Diseases of Aquatic Organism 105(1), 45-55 Tseng, I T., & Chen, J C (2004) The immune response of white shrimp Litopenaeus vannamei and its susceptibility to Vibrio alginolyticus under nitrite stress Fish & Shellfish Immunology 17(4), 325-333 Van de Braak, C., Faber, R., & Boon, J H (1996) Cellular and humoral characteristics of Penaeus monodon (Fabricius, 1798) haemolymph Comparative Haematology International 6(4), 194-203 Vo, T V., Dantas-Lima, J J., Khuong, T V., Li, W., Grauwet, K., Bossier, P., & Nauwynck, H J (2015) Differences in uptake and killing of pathogenic and non-pathogenic bacteria by haemocyte subpopulations of penaeid shrimp, Litopenaeus vannamei, (Boone) Journal of Fish Diseases 39(2), 163-174 Wang, L U., & Chen, J C (2005) The immune response of white shrimp Litopenaeus vannamei and its susceptibility to Vibrio alginolyticus at different salinity levels Fish & Shellfish Immunology 18(4), 269-278 Zorriehzahra, M., & Banaederakhshan, R (2015) Early mortality syndrome (EMS) as new emerging threat in shrimp industry Advances in Animal Veterinary Sciences 3(2s), 64-72 Să oderhă all, K., & Smith, V J (1983) Separation of the haemocyte populations of Carcinus maenas and other marine decapods, and prophenoloxidase distribution Developmental & Comparative Immunology 7(2), 229-239 Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển 18(1) www.jad.hcmuaf.edu.vn ... Trường Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Đáp ứng miễn dịch tự nhiên tôm thẻ chân trắng, Penaeus vannamei, cảm nhiễm vi khuẩn gây hoại tử gan tụy cấp Vibbrio parahaemolyticus Võ Văn Tuấn∗ , Nguyễn... oxy hoá tự hai nghiệm thức Từ kết kết luận hệ thống miễn dịch tự nhiên tôm thẻ bị suy yếu cảm nhiễm vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tuỵ cấp V parahaemolyticus Đặt Vấn Đề Tôm thẻ, Penaeus vannamei,. .. 2004; Hsu & Chen, 2007) Tuy nhiên, có nghiên cứu khả đáp ứng miễn dịch tự nhiên tôm thẻ sau bị cảm nhiễm tác nhân vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (Vibrio parahaemolyticus) Do đó, mục