Luận án tổng hợp một số dẫn chất của Hydantoin thuộc dãy 5-Arylidenhydantoin và các dẫn chất Base Mannich; thử sàng lọc tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, kháng tế bào ung thư của các chất tổng hợp được để tìm kiếm các chất có hoạt tính sinh học cao và có thể rút ra các nhận xét sơ bộ về mối liên quan cấu trúc tác dụng của dãy chất này. Mời các bạn cùng tham khảo luận án để nắm chi tiết nội dung nghiên cứu.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VŨ TRẦN ANH TỔNG HỢP MỘT SỐ DẪN CHẤT CỦA HYDANTOIN VÀ THĂM DÒ TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN, KHÁNG NẤM VÀ CHỐNG UNG THƯ TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH : HOÁ DƯỢC MÃ SỐ : 62.73.01.10 HÀ NỘI – 2010 CƠNG TRÌNH ĐÃ HỒN THÀNH TẠI: Trường Đại học Dược Hà Nội Viện Khoa học- Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Quang Đạt TS Đinh Thị Thanh Hải Có thể tìm đọc luận án tại: - Thư viện Quốc gia Hà Nội - Thư viện Trường Đại học Dược Hà Nội DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Nguyễn Quang Đạt, Đinh Thị Thanh Hải, Vũ Trần Anh, Nguyễn Thu Hương, Đậu Công Hồng, Lê Mai Hương (2006), “Tổng hợp hoạt tính chống ung thư số dẫn chất 5arylidenhydantoin”, Tạp chí Dược học, 11A, 50-54 Dat Nguyen Quang, Hai Dinh Thi Thanh, Anh Vu Tran, Huong Nguyen Thi Thu, Hong Dau Cong, Huu Doan Thi, Huong Le Mai (2007), “Synthesis and cytotoxic activity of some 5arylidenhydantoin derivatives”, Proceeding of the Fifth Inchochina Conference on Pharmaceutical Sciences (Pharma Indochina V), Bangkok, Thailand, November 21-24, PCP-P-42 Vũ Trần Anh, Nguyễn Quang Đạt, Đinh Thị Thanh Hải, Đoàn Thị Hữu (2008), “Tổng hợp thử hoạt tính sinh học số dẫn chất 5-arylidenhydantoin”, Tạp chí Dược học, 12, 36-39 Vũ Trần Anh, Nguyễn Quang Đạt, Đinh Thị Thanh Hải, Phạm Thị Vy (2009), “Tổng hợp thử hoạt tính sinh học số 5-arylidenhydantoin dẫn chất base Mannich”, Tạp chí Hố học, T47 (4A), 7-11 Vũ Trần Anh, Nguyễn Quang Đạt, Đinh Thị Thanh Hải, Trần Thị Oanh (2009), “Tổng hợp thử hoạt tính sinh học 5-(o- pclorobenzyliden)hydantoin dẫn chất base Mannich”, Tạp chí Dược học, 12, 38-42 A GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Đặt vấn đề Các dẫn chất hydantoin dãy chất quan tâm nghiên cứu tổng hợp hoá học, tác dụng sinh học ứng dụng làm thuốc Một số dẫn chất hydantoin sử dụng làm thuốc phenytoin (thuốc chống động kinh), nitrofurantoin (thuốc kháng khuẩn), dantrium (thuốc giãn vân), nilutamid (thuốc điều trị ung thư tuyến tiền liệt di căn) Trong năm qua, nhà nghiên cứu giới nước tiếp tục nghiên cứu, tổng hợp sàng lọc tác dụng sinh học dẫn chất hydantoin, tìm thấy nhiều dẫn chất có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, tác dụng chống ung thư Trong số đó, dẫn chất 5-arylidenhydantoin thiên nhiên tổng hợp thể tiềm hoạt tính chống ung thư đáng quan tâm Mặt khác, nhiều cơng trình nghiên cứu chứng tỏ dẫn chất base Mannich có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, chống ung thư cao Các thành tựu nghiên cứu tổng hợp ứng dụng dẫn chất hydantoin nêu cho thấy việc tiếp tục nghiên cứu tổng hợp thử hoạt tính sinh học dẫn chất hydantoin, đặc biệt dẫn chất 5-arylidenhydantoin cần thiết có nhiều triển vọng Mục tiêu luận án - Tổng hợp số dẫn chất hydantoin thuộc dãy 5-arylidenhydantoin dẫn chất base Mannich - Thử sàng lọc tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, kháng tế bào ung thư chất tổng hợp để tìm kiếm chất có hoạt tính sinh học cao rút nhận xét sơ mối liên quan cấu trúc - tác dụng dãy chất Những đóng góp luận án - Đã tổng hợp 43 dẫn chất hydantoin, có 32 chất chưa thấy cơng bố tài liệu tham khảo - Đã xác định cấu trúc tất chất tổng hợp phương pháp phổ IR, phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H 13C-NMR kết hợp với kỹ thuật phổ 2D-NMR (HSQC, HMBC), phổ khối lượng MS - Đã thử số tác dụng sinh học chất tổng hợp với kết là: * Đã sàng lọc chất có tác dụng với chủng vi khuẩn B.subtilis (MIC=50μg/ml), chất có hoạt tính kháng chủng vi khuẩn S.aureus (MIC=25-50μg/ml) * Đã sàng lọc chất có hoạt tính kháng nấm Asp.niger (MIC=50μg/ml), chất có hoạt tính kháng chủng nấm S.cerevisiae (MIC=50μg/ml) * Đã sàng lọc 13 chất có hoạt tính kháng tế bào ung thư gan Hep-G2 (IC50=0,38÷5μg/ml) Bố cục luận án Luận án có 154 trang, gồm chương, 12 bảng, 36 hình, 79 tài liệu tham khảo 45 phụ lục Các phần luận án: Đặt vấn đề (2 trang), tổng quan (31 trang), nguyên vật liệu, trang thiết bị phương pháp nghiên cứu (6 trang), thực nghiệm kết nghiên cứu (50 trang), bàn luận (63 trang), kết luận đề xuất (2 trang) B NỘI DUNG LUẬN ÁN CHƯƠNG TỔNG QUAN Đã tập hợp trình bày cách hệ thống cơng trình nghiên cứu nước quốc tế vấn đề: - Các phương pháp tổng hợp hydantoin dẫn chất bao gồm: * Các phương pháp tổng hợp hydantoin hydantoin * Các phương pháp tổng hợp dẫn chất xuất phát từ nhân hydantoin - Tác dụng sinh học dẫn chất hydantoin bao gồm: tác dụng chống co giật; tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm; tác dụng chống ung thư tác dụng khác CHƯƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu, hố chất, dung mơi, thiết bị thí nghiệm - Các hố chất, dung mơi (Merck, Trung Quốc, Việt Nam) - Các dụng cụ thí nghiệm hữu thơng thường - Các thiết bị đo nhiệt độ nóng chảy, phổ IR, phổ cộng hưởng từ hạt nhân, phổ khối lượng - Các chủng vi khuẩn, vi nấm dòng tế bào ung thư Phòng Sinh học thực nghiệm - Viện Hoá học hợp chất thiên nhiên - Viện Khoa học Công nghệ cung cấp 2.2 Phương pháp nghiên cứu - Đã sử dụng phương pháp thực nghiệm hoá học hữu để tổng hợp chất dự kiến - Sử dụng sắc ký lớp mỏng để theo dõi trình tiến triển phản ứng Kiểm tra độ tinh khiết sản phẩm sắc ký lớp mỏng đo nhiệt độ nóng chảy - Xác định cấu trúc hợp chất tổng hợp dựa phương pháp phổ: hồng ngoại, phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều hai chiều, phổ khối lượng - Thử sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm tiến hành theo phương pháp Berghe V.A Vlietlinck , thực phiến vi lượng 96 giếng - Thử tác dụng kháng tế bào ung thư tiến hành theo phương pháp P Skehan cộng K.Likhiwitayawid, áp dụng Viện nghiên cứu ung thư quốc gia Mỹ (National Cancer Institution - NCI) CHƯƠNG THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Tổng hợp hoá học Sơ đồ phản ứng chung 3' 1' 4' R O 2' 5' CH=O + 6' 3' NH O N H 1' 4' R O 2' 5' C H 6' NH O N H + HCHO + HN R1 2' 3' 4' R2 R 5' I - IX R=H; 2'-OH; 4'-OH; (R=H (I); 2'-OH (II); 4'-OH(III); 4'-(CH3)2N;4'-F; 2'-Cl; 4'-(CH3)2N (IV); 4'-F (V); 2'-Cl (VI); 4'-Cl; 3'-NO2; 4'-NO2 4'-Cl(VII); 3'-NO2(VIII); 4'-NO2(IX)) O N CH2-NR1R2 51 O N H 1' C H 6' I(a-d) - IX(a-d) (R=H (I); 2'-OH (II); 4'-OH(III); 4'-(CH3)2N(IV); 4'-F(V); 2'-Cl(VI); 4'-Cl(VII); 3'-NO2(VIII); 4'-NO2(IX)) N N R1 R2 R1 R2 3.1.1 Tổng hợp dẫn chất 5-arylidenhydantoin (I-IX) N N O (a) (b) N N R1 R2 R1 R2 N HN N CH3 (c) CH3 (d) Quy trình tổng hợp chung: Cho vào bình cầu g (0,05 mol) hydantoin , thêm 50ml nước cất, đun nóng hỗn hợp nhiệt độ 60oC, hydantoin tan hồn tồn Trung hịa dung dịch dung dịch natri hydrocarbonat bão hòa đến pH = Thêm vào bình cầu 4,5ml ethanolamin nâng nhiệt độ lên đến 85oC Vừa đun nóng, vừa khuấy hỗn hợp phản ứng thêm giọt dung dịch 0,05 mol aldehyd thơm 10 ml ethanol vào bình phản ứng Sau đó, hỗn hợp phản ứng đun hồi lưu Theo dõi phản ứng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi CHCl3:isoC3H7OH (9:1) mỏng silicagel 60 F254, phát vết đèn tử ngoại bước sóng 254 nm Phản ứng kết thúc sau 4-7 tuỳ theo aldehyd thơm sử dụng Để nguội, đổ hỗn hợp phản ứng cốc có mỏ Lọc hút thu kết tủa Rửa nước cất cồn lạnh Sấy khô tủa thu Kết tinh lại dung môi thích hợp Kết quả: Đã tổng hợp dẫn chất 5-arylidenhydantoin (I-IX) Kết trình bày bảng 3.1 Bảng 3.1: Kết tổng hợp dẫn chất 5-arylidenhydantoin (I-IX) Ký STT hiệu Thực nghiệm Thời R M chất gian Dung môi kết phản tinh lại ứng Nhiệt độ nc ( C) Hiệu suất Tài liệu [61] Nhiệt độ nc ( C) (%) (giờ) Hiệu suất (%) I -H 188 EtOH 220÷222 60,3 220-224 71,3 II 2’-OH 204 EtOH:DMF (8:1) 294÷295 54,1 293-294 21,6 III 4’-OH 204 EtOH:DMF (8:1) 312÷313 57,2 311-314 34,6 IV 4’- N- 231 AcOH 60% 278÷279 52,6 263-266 37,6 (CH3)2 V 4’-F 206 EtOH:DMF (6:1) 260÷262 64,5 260-262 70,6 VI 2’-Cl 222 EtOH:DMF (2:1) 282÷284 67,1 278-281 73,9 VII 4’-Cl 222 EtOH:DMF (2:1) 305÷306 70,4 303-305 62,7 VIII 3’-NO2 233 EtOH:DMF (5:3) 291÷292 74,2 280-282 47,6 IX 4’-NO2 233 EtOH:DMF (5:3) 320÷322 75,4 314-316 51,3 3.1.2 Tổng hợp dẫn chất base Mannich 5-arylidenhydantoin (I(a-d)IX(a-d)) Quy trình tổng hợp chung: Cho vào bình phản ứng 0,0025 mol chất I-IX, thêm 15ml EtOH, khuấy nhiệt độ phòng cho phân tán 15 phút Cho tiếp 0,21ml formol (0,0025 mol HCHO) 0,0025 mol amin, 3-4 giọt CH3COOH, khuấy nhiệt độ phòng Sau đun cách thủy nâng dần nhiệt độ tới 85oC thêm tiếp DMF vào từ từ để hỗn hợp tan hồn tồn Sau đó, tiếp tục khuấy giữ nhiệt độ phản ứng 850C Theo dõi phản ứng sắc ký lớp mỏng, hệ dung mơi H2O:AcOH:MeOH (4:2:4) với chất I(ad)÷VI(a-d), VIII (a-d), hệ dung môi H2O:MeOH (2:3) với chất VII (a-d), IX(ad), phát vết đèn tử ngoại bước sóng 254 nm Sau 2-5 phản ứng đạt tối ưu Đổ hỗn hợp phản ứng cốc có mỏ, để nguội đến nhiệt độ phòng, để tủ lạnh 24 Sau cạo thành cốc thật kỹ để tạo tủa tốt Lọc hút, rửa tủa EtOH lạnh thu sản phẩm thô Kết tinh lại dung mơi thích hợp, sấy khơ 60oC tủ sấy chân không 3h thu sản phẩm Kết quả: 34 dẫn chất base Mannich I(a-d)÷IX(a-d) chất 5-arylidenhydantoin (I-IX) Kết trình bày bảng 3.2 Bảng 3.2: Kết tổng hợp dẫn chất base Mannich (I(a-d)÷IX(a-d)) ST T Ký R NR1R2 M Thời hiệu gian chất phản H H 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Ia Ib Ic Id IIa IIb IIc IId IIIa IIIb IIIc IIId 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 4’-N(CH3)2 4’-N(CH3)2 34 35 36 37 38 39 40 IVa IVb IVc IVd Va Vb Vc Vd VIa VIb VIc VId VIIa VIIb VIIc VIId VIIIa* VIIIb* VIIId 41 42 43 IXa IXb IXd 4’-NO2 4’-NO2 H H N 2’-OH 2’-OH 2’-OH 2’-OH 4’-OH 4’-OH 4’-N(CH3)2 4’-N(CH3)2 4’-F 4’-Cl 4’-NO2 58,1 67,0 31,5 56,0 44,6 52,8 40,2 41,8 43,5 67,6 38,2 66,7 CH3 321 319 334 341 332 330 352 3,5 2,5 4,5 EtOH EtOH EtOH EtOH EtOH EtOH EtOH 234÷236 225÷226 199÷200 232÷233 202÷203 179÷181 196÷197 71,0 70,2 43,1 65,6 51,8 50,9 54,5 CH3 332 330 352 EtOH EtOH EtOH 224÷226 220÷221 244÷246 56,6 46,0 44,3 CH3 N O N N N CH3 HN CH3 N O N N N CH3 HN CH3 N O N N N CH3 HN CH3 N O N N N CH3 HN 3’-NO2 3’-NO2 3’-NO2 246÷248 238÷239 209÷210 249÷251 198÷199 220÷221 193÷194 211÷212 192÷193 208÷209 158÷161 218÷219 N CH3 HN 4’-Cl 4’-Cl 4’-Cl EtOH:DMF (6:1) EtOH EtOH EtOH EtOH:DMF (6:1) EtOH EtOH EtOH EtOH EtOH EtOH EtOH O N 2’-Cl 2’-Cl 2’-Cl 2’-Cl 3,5 3,5 2,5 4,5 3,5 2,5 4,5 CH3 N 4’-F 4’-F 4’-F 330 328 343 350 305 303 318 325 321 319 334 341 N CH3 N CH3 N O N HN N O N HN (%) 76,6 71,6 78,6 84,7 25,0 41,1 32,9 69,3 40,9 70,4 70,8 52,0 O HN 4’-OH 4’-OH suất 192÷193 209÷210 191÷192 220÷223 172÷173 177÷178 167÷168 157÷158 228÷229 207÷208 196÷197 168÷171 N N nc ( C) Hiệu EtOH EtOH EtOH EtOH EtOH EtOH EtOH EtOH EtOH EtOH EtOH EtOH CH3 N 287 285 300 307 303 301 316 323 303 301 316 323 N CH3 HN tinh lại Nhiệt độ ứng (giờ) 3,5 2,5 4,5 3,5 3,5 O N N Dung môi kết 3.2 Xác định cấu trúc chất tổng hợp Để xác nhận cấu trúc chất tổng hợp được, tiến hành ghi phổ hồng ngoại, phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H 13C-NMR kết hợp với kỹ thuật phổ 2D-NMR (HSQC, HMBC), phổ khối lượng MS Kết phân tích phổ ghi bảng 3.3, 3.4, 3.5, 3.6 Bảng 3.3 : Số liệu phổ IR phổ 1H-NMR dẫn chất 5-arylidenhydantoin (I-IX) STT Ký hiệu chất R H-NMR (DMSO-d6, δppm) IR (KBr, νcm-1) νC=C νC =O νC =O H6 N3H N1H Nhân thơm 7,61(d, 2H, H2’,6’, J=7,5); 7,39(t, 2H, H3’,5’, J=7,5); 7,32(t, 1H, H4’, J=7,25) 7,55(dd, 1H, H6’, J= 7,75;1,25); 7,16(td, 1H, H4’, J=7,75;1,5); 6,88(t, 1H, H3’, J=8;1);6,83 (t,1H, H5’, J= 7,5) 7,48 (d, 2H, H2’,6’, J=8,5); 6,81 (d, 2H, H3’,5’, J=8,5) 7,48 (d, 2H, H2’,6’, J=9); 6,70(d, 2H, H3’,5’, J=9); 2,95(s, 6H, N(CH3)2) 7,67(ddd, 2H, H2’,6’, J=7,5;2, JHF=5,5); 7,24(t, 2H, H3’,5’, J=8,75 ; 1,5, JH-F=7) 7,71(dd, 1H, H6’, J=7,75;1,75); 7,53(d, 1H, H3’, J=7,5); 7,36 (qd, 2H, H4’,5’, J=7,75;1,75) 7,64(d, 2H, H2’,6’, J=8,5); 7,45(d, 2H, H3’,5’, J=8,5) 8,36(s, 1H, H2’); 8,13(dd, 1H, H4’, J=8;1,5); 8,01(d, 1H, H6’, J=7,5); 7,67(t, 1H, H5’, J=8) 8,21(s, 2H, H3’,5’, J=8,5); 7,86 (d, 2H,H2’,6’, J=8,5) I -H 1656 1768 1715 6,41 11,19 10,51 II 2’-OH 1661 1752 1708 6,69 11,11 10,20 III 4’-OH 1653 1752 1710 6,36 10,27 10,27 IV 4’-N(CH3)2 1656 1740 1719 6,34 11,00 10,23 V 4’-F 1665 1799 1737 6,41 11,40 10,90 VI 2’-Cl 1664 1779 1732 6,55 11,33 10,67 VII 4’-Cl 1666 1797 1737 6,39 11,20 10,90 VIII 3’-NO2 1665 1773 1717 6,53 11,35 10,85 IX 4’-NO2 1665 1770 1736 6,49 11,40 10,90 Bảng 3.4 : Số liệu phổ IR phổ 1H-NMR dẫn chất base Mannich (I(a-d)-IX(a-d)) TT Ký hiệu chất NR1R2 νC=C IR (KBr, νcm-1) ν-CH ν νC C =O 2 4=O H-NMR (DMSO-d6, δppm) N1H H6 -CH2 Giá trị khác 7,65 (d, 2H, H2’,6’, J=7,5); 7,42 (t, 2H, H3’,5’, J=7,5); 7,34 (t, 1H, H4’, J=7,25); 3,54 (t, 4H, H3’’,5’’, J=4,5); 2,50 (t, 4H, H2’’,6’’, J= 1,5) 7,65 (d, 2H, H2’,6’, J=7,5 ); 7,41 (t, 2H, H3’,5’, J=7,75); 7,34 (t, 1H, H4’, J=7,25); 2,50(t, 4H, H2’’,6’’,, J=5,5);1,46 (t, 4H, H3’’,5’’, J= 2); 1,32 (d, 2H, H4’’, J=4,5) 10 Ia 1659 2959 1769 1719 10,80 6,54 4,36 11 Ib 1658 2935 1758 1715 10,75 6,52 4,35 1662 2846 1765 1714 10,80 6,54 4,37 1658 2965 1760 1710 10,74 6,53 4,89 IIa 1660 2965 1775 1721 10,30 6,80 4,35 15 IIb 1648 2945 1765 1716 10,29 6,77 4,34 16 IIc 1667 2943 1781 1727 10,31 6,66 4,34 17 IId 1657 2954 1757 1707 10,50 6,80 4,88 18 IIIa 1655 2946 1757 1711 10,6 6,48 4,34 19 IIIb 1652 2935 1763 1716 10,61 6,46 4,33 20 IIIc 1653 2948 1764 1712 10,35 6,47 4,34 21 IIId 1653 2954 1758 1705 10,53 6,48 4,89 12 Ic 13 Id 14 HN HN HN CH CH CH 7,66 (d, 2H, H2’,6’, J=7,5 ); 7,42 (t, 2H, H3’,5’, J=7,75); 7,35 (t, 1H, H4’, J=7,25); 2,51 (t,4H, H2’’,6’’, J=3,5);2,28 (b, 4H, H3’’,5’’); 2,14 (s, 3H, -CH3) 7,61 (d, 2H, H2’,6’, J=7); 7,39 (t, 2H, H3’,5’, J= 7,75 ); 7,33 (t, 1H, H4’, J=7,25);6,90 (d, 2H, H3’’,5’’,J=8); 6,75 (d, 2H, H2’’,6’’, J=8,5); 6,29 (t,1H, NH, J=7,5 ); 2,13 (s, 3H, CH3) 7,58 (dd, 1H, H6’, J=8;1,5); 7,18 (td, 1H, H4’, J=8,25;1); 6,88 (d, 1H, H3’, J=8,5);6,84 (t,1H, H5’, J=7,5); 3,55(t, 4H, H3’’,5”, J= 4,5); 2,50 (t, 4H, H2’’,6’’, J=1,5) 7,55 (d, 1H, H6’, J=7); 7,18 (td, 1H, H4’, J=7,75;1,5); 6,88 (d, 1H, H3’, J=7,5); 6,83 (t,1H, H5’, J=7,5); 2,49(d, 4H, H2’’,6’’, J=1,5 ); 1,46 (s, 4H, H3’’,5’’); 1,31(s, 2H, H4’’ ) 7,55 (dd, 1H, H6’, J=7,75;1,5); 7,17 (td, 1H, H4’, J=7,75;1,5); 6,87 (d, 1H, H3’, J=8); 6,84 (t, 1H, H5’, J=7,5); 2,50 (t, 4H, H2’’,6’’, J=2 ); 2,31 (s, 4H, H3’’,5’’); 2,14 (s, 3H, -CH3) 7,52 (dd, 1H, H6’, J=7,5);7,16 (td, 1H , H4’, J=7,75;1,5); 6,89 (t, 1H, H3’, J=8); 6,83 (t, 1H, H5’, J=7,5);6,90 (t, 2H, H3”,5”, J=8,5); 6,75 (t, 2H, H2”,6”, J=8,5); 6,24 (t, 1H, -NH, J=7); 2,13 (s,3H, -CH3) 9,85 (s, 1H, OH); 7,51(d, 2H, H2’,6’, J=8,5); 6,81 (d, 2H, H3’,5’, J =8,5); 3,54 (t, 4H, H3’’,5”, J=4,5 ); 2,49 (t, 4H, H2’’,6’’, J=2 ) 7,50 (d, 2H, H2’,6’, J=8,5); 6,80 (d, 2H, H3’,5’, J=8,5); 2,49 (t, 4H, H2’’,6’’, J=1,5 ); 1,45(t, 4H, H3’’,5”, J=5); 1,31(s, 2H, H4”) 7,51(d, 2H, H2’,6’, J=9); 6,81(d, 2H, H3’,5’, J=9); 2,50(m, 4H, H2’’,6”, J=2); 2,27(b, 4H, H3’’,5’’); 2,11(s, 3H, -CH3) 7,49 (d, 2H, H2’,6’, J=8,5 ); 6,81 (d, 2H, H3’,5’, J=8,5) ; 6,91 (d, 2H, H3”,5”, J=7,5); 6,76 (d, 2H, H2”,6”, J=8,5); 6,28 (t, 1H, -NH, J= 7); 2,14 22 IVa 1651 23 IVb 1654 2931 1752 1705 10,52 6,45 4,32 24 IVc 1651 2937 1757 1706 10,53 6,46 4,33 25 IVd 1651 2915 1744 1698 10,47 6,46 4,86 26 Va 1663 2957 1767 1712 10,84 6,55 4,36 27 Vb 1664 2940 1766 1710 10,76 6,51 4,32 28 Vc 1664 2946 1757 1717 10,80 6,54 4,36 29 Vd 1662 2920 1762 1720 10,76 6,53 4,87 30 VIa 1656 2959 1768 1718 10,96 6,66 4,36 31 VIb 1656 2934 1771 1721 10,92 6,64 4,34 32 VIc 1658 2951 1769 1720 10,90 6,65 4,36 HN HN CH CH 2859 1755 1711 10,52 6,47 4,34 (s, 3H, -CH3) 7,52 (d, 2H, H2’,6’, J=8,5); 6,72 (d, 2H, H3’,5’, J=7); 3,54 (t, 4H, H3’’,5”, J=4,5) ; 2,97 (s, 6H, -N(CH3)2); 2,50 (t, 4H, H2’’,6’’, J=2 ) 7,51 (d, 2H, H2’,6’, J=9); 6,71 (d, 2H, H3’,5’, J=9); 2,96 (s, 6H, -N(CH3)2); 2,50 (d, 4H, H2’’,6’’, J=2); 1,45 (b, 4H, H3’’,5”); 1,30 (s, 2H, H4”) 7,51 (d, 2H, H2’,6’, J=9); 6,72 (d, 2H, H3’,5’, J=8,5); 3,28 (s, 4H, H2’’,6’’ ); 2,97 (s, 6H, N(CH3)2) ; 2,27 (b, 4H, H3’’, 5’’); 2,11 (s, 3H, -CH3) 7,49 (d, 2H, H2’,6’, J=9);6,74 (d, 2H, H3’,5’, J=8); 6,89 (d, 2H, H3”,5”, J=8); 6,70 (d,2H, H2”,6”, J=9); 6,27 (t, 1H, -NH, J=7); 2,95 (s, 6H, -N(CH3)2); 2,12 (s, 3H, -CH3) 7,71 (t, 2H, H2’,6’, J=8,5, JHF=5,5); 7,25 (t, 2H, H3’,5’, J=9, JH-F= 8,5); 3,54 (t, 4H, H3’’,5”, J=4,5); 2,50 (t, 4H, H2’’, 6’’, J=1,5 ) 7,68 (t, 2H, H2’,6’, J=9, JHF=5); 7,23 (t, 2H, H3’,5’, J=8,5, JH-F= 6,5); 2,47 (t, 4H, H2’’,6’’, J=1,5 ); 1,45 (t, 4H, H3’’,5”, J=4,5); 1,29 (d, 2H, H4”, J=4,5) 7,70 (t, 2H, H2’,6’, J=9,5, JH-F= 5,5);7,24 (t, 2H, H3’,5’, J=9,5, JH-F=8,5); 2,50 (t, 4H, H2’’,6”, J= 1,5); 2,28 (s, 4H, H3’’,5’’) ; 2,14 (s, 3H,-CH3) 7,65 (m, 2H, H2’,6’, J=9,5, JHF= 5,5); 7,21 (t, 2H, H3’,5’, J=9, JH-F= 8,5); 6,88 (d, 2H, H3”,5”, J=8); 6,73 (d, 2H, H2”,6”, J=8,5); 6,30 (t, 1H, -NH, J=7,5); 2,11 (s, 3H, -CH3) 7,74 (dd, 1H, H6’, J=7,5;2); 7,54 (d, 1H, H3’, J=7,5); 7,38 (td, 2H, H4’,5’, J=7,5;1) ; 3,54 (d, 4H, H3’’,5’’, J= 4); 2,50 (d, 4H, H2’’,6’’, J=1,5 ) 7,73(dd, 1H, H6’, J=7,5); 7,53 (d, 1H, H3’, J=8); 7,37(t, 2H, H4’,5’, J=8); 2,49(d, 4H, H2’’,6’’, J=1,5); 1,46(d, 4H, H3’’,5’’, J=5 ); 1,31(d, 2H, H4’’, J=8) 7,75 (dd, 1H, H6’, J=8); 7,53 (d,1H, H3’, J=7,5); 7,37 (t, 2H, H4’,5’, J =7,5); 2,5 (d,4H , H3’’,5’’, J=1,5); 2,28( b, 4H, H2’’,6’’ ); 2,12 (s 3H, CH3) 11 12 3.3 Thử nghiệm hoạt tính sinh học 3.3.1 Thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm Tại phịng Sinh học thực nghiệm - Viện Hố học hợp chất thiên nhiên (Viện Khoa học công nghệ Việt Nam), 43 chất tổng hợp thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm theo phương pháp Vanden Bergher Vlietlink Kết trình bày bảng 3.7 Bảng 3.7: Kết thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm chất tổng hợp Chất Tetracyclin Vi khuẩn Gr(-) E.coli P aeruginosa 6,875 (-) Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC): µg/ml Vi khuẩn Gr(+) Nấm mốc B.subtilis S aureus Asp.niger F oxysporum 21,8375 Ampicillin 21,8375 Nystatin I÷VI I(a-d) ÷VI(a-d) VII VIIa VIIb VIIc VIId VIII VIIIa VIIIb VIIId IX IXa IXb IXd (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) 50 50 Nấm men S.cerevisiae C albicans (-) (-) 50 50 25 (-) (-) 50 50 50 (-) (-) 50 (-) (-) 5,78 (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) 50 (-) (-) (-) (-) (-) (-) 2,89 (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) 11,56 (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) 50 50 50 11,56 (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) 13 3.3.2 Thử tác dụng kháng dòng tế bào ung thư người 43 chất tổng hợp thử hoạt tính kháng dịng tế bào ung thư người theo phương pháp Skehan P Likhiwitayawid cộng Phòng Sinh học thực nghiệm (Viện KH&CNVN) Kết trình bày bảng 3.8 Bảng 3.8: Kết thử hoạt tính kháng dịng tế bào ung thư người chất tổng hợp Chất Giá trị IC50 (µg/ml) Kết luận Chất Giá trị IC50 (µg/ml) Dịng tế bào LU Dương tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính DMSO Chứng (+) Vb Vc Vd VI Dòng tế bào Hep-G2 0,34 >5 >5 >5 2,72 >5 Âm tính VIa 4,22 >5 >5 >5 Âm tính VIb 4,31 >5 IIa IIb IIc >5 >5 >5 >5 >5 >5 Âm tính Âm tính Âm tính VIc VId VII >5 >5 4,69 >5 >5 >5 IId III >5 >5 >5 >5 Âm tính Âm tính VIIa VIIb >5 1,53 >5 >5 IIIa >5 >5 Âm tính VIIc 0,38 >5 IIIb >5 >5 Âm tính VIId 2,89 >5 IIIc >5 >5 Âm tính VIII >5 IIId >5 >5 Âm tính VIIIa 4,31 >5 IV >5 >5 Âm tính VIIIb 3,71 >5 IVa >5 >5 Âm tính VIIId 1,99 >5 IVb >5 >5 Âm tính IX 3,70 >5 IVc >5 >5 Âm tính IXa 2,77 >5 IVd V Va >5 >5 >5 >5 >5 >5 Âm tính Âm tính Âm tính IXb IXd >5 >5 >5 >5 Dòng tế bào LU DMSO Chứng (+) I Ia Ib Ic Dòng tếbào Hep-G2 0,34 >5 >5 >5 >5 0,42 >5 >5 >5 >5 Id >5 II 0,42 >5 >5 >5 >5 Kết luận Dương tính Âm tính Âm tính Âm tính Dương tính dịng Dương tính dịng Dương tính dịng Âm tính Âm tính Dương tính dịng Âm tính Dương tính dịng Dương tính dịng Dương tính dịng Dương tính dịng Dương tính dịng Dương tính dịng Dương tính dịng Dương tính dịng Dương tính dịng Âm tính Âm tính 14 CHƯƠNG BÀN LUẬN 4.1 Về tổng hợp hoá học xác định cấu trúc chất tổng hợp 4.1.1 Về phản ứng tổng hợp dẫn chất 5-arylidenhydantoin Các dẫn chất 5-arylidenhydantoin tổng hợp phản ứng ngưng tụ aldehyd thơm với hydantoin dung môi hỗn hợp nước-ethanol (1:1) với xúc tác ethanolamin Các dẫn chất 5-arylidenhydantoin điều chế chất rắn có màu trắng, số chất có màu vàng Các chất có điểm nóng chảy tương đối cao, từ 220÷3220C, chất III, VII, IX phân huỷ nhiệt độ nóng chảy Kết trình bày bảng 3.1 cho thấy thời gian phản ứng hiệu suất phụ thuộc vào nhóm aldehyd thơm Khả phản ứng aldehyd thơm tăng theo thứ tự sau: p-dimethylaminobenzaldehyd < o-hydroxybenzaldehyd < p-hydroxybenzaldehyd < benzaldehyd < p-fluorobenzaldehyd < o-clorobenzaldehyd < p-clorobenzaldehyd < m-nitrobenzaldehyd < p-nitrobenzaldehyd Điều hợp lý nhóm NO2 nhóm hút điện tử mạnh hai hiệu ứng –I – M (hằng số Hammett σ m-NO2 0,71; p-NO2 0,78) nên hiển nhiên làm tăng mật độ điện tích dương nguyên tử carbon carbonyl khiến cho phản ứng dễ dàng (thời gian phản ứng giờ, hiệu suất 74,2÷75,4%) Các nguyên tử halogen (F,Cl) có hiệu ứng hút điện tử yếu hai hiệu ứng –I +M (hằng số Hammett σ p-F 0,06; p-Cl 0,23) nên ảnh hưởng chúng yếu nhóm –NO2 (5 giờ, 64,4÷70,3%) mạnh benzaldehyd (6 giờ, 60,3%) Trong đó, nhóm đẩy điện tử (o-OH, p-OH, p-N(CH3)2) hiệu ứng +M (hằng số Hammett σ p-OH -0,37; p-N(CH3)2 -0,83) làm giảm mật độ điện tích dương carbon carbonyl khiến phản ứng chậm hiệu suất (7 giờ, 52,6÷57,2%) 4.1.2 Về xác định cấu trúc dẫn chất 5-arylidenhydantoin tổng hợp (IIX) Cấu trúc chất (I-IX) xác định phân tích phổ hồng ngoại IR, phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H 13C-NMR kết hợp kỹ thuật phổ 2D NMR (HSQC, HMBC), phổ khối lượng MS O H R C NH O N H 6' 2' 5' 3' 4' I-IX - Phổ IR chất I-IX xuất dải hấp thụ đặc trưng cho liên kết đôi -1 ethylenic (C(5)=C(6)) nằm vùng từ 1666÷1653cm Đây dải hấp thụ quan trọng cho phép sơ khẳng định tạo thành sản phẩm phản ứng ngưng tụ (xem bảng 3.3) Các dao động hoá trị liên kết C=C chất I-IX xuất -1 vùng 1666÷1653cm chứng tỏ chất chúng tơi tổng hợp đồng phân Z 15 - Phổ 1H-NMR cho thấy tín hiệu proton H-N1 H-N3 (tín hiệu tù, cường độ yếu), độ chuyển dịch hoá học proton H-N3 có giá trị từ 11,00 ÷ 11,40 ppm , độ chuyển dịch hoá học proton H-N1 có giá trị từ 10,20 ÷ 10,90 ppm Proton ethylenic (H-6) có tín hiệu cộng hưởng dạng singlet nằm vùng từ 6,34 ÷ 6,69 ppm Các nhóm nhân thơm gây ảnh hưởng làm thay đổi tín hiệu cộng hưởng proton nhân thơm Ảnh hưởng nhóm tín hiệu proton nhân thơm trình bày bảng 4.1 Bảng 4.1: Độ chuyển dịch hoá học proton nhân thơm 5arylidenhydantoin tổng hợp (I-IX) Ký hiệu I II III IV V VI VII VIII IX R -H 2’-OH 4’-OH 4’-(CH3)2N4’-F 2’-Cl 4’-Cl 3’-NO2 4’-NO2 H2’ 7,61 7,48 7,48 7,67 7,64 8,36 7,86 H3’ 7,39 6,88 6,81 6,70 7,24 7,53 7,45 H4’ 7,32 7,14 H5’ 7,39 6,83 6,81 6,70 7,24 7,36 7,45 7,67 8,21 7,36 8,13 8,21 H6’ 7,61 7,55 7,48 7,48 7,67 7,71 7,64 8,01 7,86 Từ phổ H-NMR phân biệt hai đồng phân Z E cách dựa độ chuyển dịch hoá học proton ethylenic (H-6) proton ortho phenyl phần benzyliden (H2’ H6’) O H H 6' C 1' N H H 4' NH H 6' H 2' H3' C H H 5' H 4' H 2' H 5' O H 3' Đồng phân Z O N H NH O Đồng phân E * Do nhóm carbonyl C4=O gần proton ethylenic H-6 dạng đồng phân Z, nên hiệu ứng anisotrop C4=O giảm chắn proton H-6 dạng đồng phân Z so với đồng phân E, proton H-6 dạng đồng phân Z cộng hưởng trường yếu có độ chuyển dịch hố học lớn Độ chuyển dịch hoá học proton ethylenic vùng trường thấp (δH 6,40 – 7,00 ppm) tương ứng với đồng phân Z, vùng trường cao (δH 6,20 – 6,30 ppm) tương ứng với đồng phân E Các chất ngưng tụ (I-IX) có độ chuyển dịch hố học proton ethylenic từ 6,34 ÷ 6,83 ppm tương ứng đồng phân Z * Các chất ngưng tụ I, II, V, VI, VII có độ chuyển dịch hố học proton Ho từ 7,55 ÷ 7,71 ppm (phù hợp với giá trị 7,52-7,65 ppm đồng phân Z, δHo đồng phân E 7,90-7,98 ppm theo cơng trình Tan cộng số 5-arylidenhydantoin có nhóm -Cl, -CH3, -OCH3 vị trí 4’) Chất III chất IV vị trí 4’ có nhóm đẩy điện tử mạnh p-hydroxy p-dimethylamino nên giá trị 16 Ho 7,48 ppm Chất VIII, chất IX có nhóm hút điện tử vị trí 3’ 4’ nên có độ chuyển dịch hố học Ho tương ứng H-2’- 8,36 ppm H-6’-8,01 ppm với chất VIII, H-2’ H-6’ 7,86 ppm với chất IX Như số liệu độ chuyển dịch hoá học Ho (H-2’, H-6’) cho thấy chất I-IX có cấu hình Z - Xét phổ 13C-NMR chất ngưng tụ I-IX cho thấy số lượng nguyên tử carbon độ chuyển dịch hoá học tương ứng phù hợp (xem bảng 3.5) Cấu trúc chất xác nhận qua kỹ thuật phổ 2D HSQC, HMBC - Để khẳng định thêm cấu trúc dãy chất ngưng tụ 5-arylidenhydantoin tiến hành ghi phổ MS theo phương pháp EI Trong phổ khối lượng hợp chất nhận thấy xuất pic phân tử có cường độ lớn, số khối ion phân tử phù hợp với kết tính khối lượng phân tử xác hợp chất Ngoài ra, phổ đồ nhận thấy pic ion mảnh đặc trưng (bảng 4.6) phù hợp với sơ đồ phân mảnh (Hình 4.19) Sự hình thành ion mảnh phổ MS (EI) 5-arylidenhydantoin xảy theo hướng theo sơ đồ sau (Hình 4.19) O NH N H R O -R O O O N H O N H R NH NH + F1 F2 - HNCO m/z = 187 m/z = 43 R C HN -COHNCO m/z=71 O F3 - CO m/z = 28 + NH Ar Ar CH C NH F6 m/z=116 F4 - HCN m/z = 27 -R + CH R +2H R F5 - C2H2 -C NH -R + +3H + F7 m/z=90 + C H F10, m/z=51 F9, m/z=63 F8, m/z=89 Hình 4.19 Sơ đồ phân mảnh tổng quát chất ngưng tụ 17 Bảng 4.6 : Số liệu phổ MS dẫn chất 5-arylidenhydantoin tổng hợp (I-IX) Công thức cấu tạo chung: O 3' 2' 1' 4' C H 5' N H R NH O 6' I-IX Số TT Ký hiệu M M+ F1-R F1-HNCO F3-CO F4-HCN + + F2-CONHCO Khác + C+ H F1 F2 F3 F4 F5 (51) F9 F10 F6 F7 116 90 63 51 116 90 63 51 I 188 188 187 144 117 II 204 204 187 161 133 106 III 204 204 161 133 106 IV 231 231 187 188 160 132 116 V 206 206 187 163 135 108 116 VI 222 222 187 151 124 116 151 123 F8 (63) 90 89 63 51 90 89 63 51 F11,F11’ 89 90 89 63 116 89 63 116 89 63 224 VII 222 222 179 224 VIII 233 233 187 162 F11=[M-NO]=203, F11’=[M-NOCONHCO]=132 IX 233 233 188 162 116 90 89 63 F11= [M-NO]=203, F11’= [M-NOCONHCO] 18 4.1.3 Về phản ứng tổng hợp dẫn chất base Mannich 5-arylidenhydantoin Do có nhóm carbonyl hoạt hố nên H -NH imid (N-3) linh động H -NH amid (N-1), phản ứng Mannich N-3 dễ dàng N-1; mặt khác nhóm aryliden C-5 cản trở khơng gian nên phản ứng aminomethyl vào N-1 gặp khó khăn Vì với dẫn chất 5-arylidenhydantoin, phản ứng Mannich xảy N3 Các base Mannich điều chế chất rắn, có màu trắng, số có màu vàng nhạt đến vàng, hồng nhạt đến da cam,có điểm nóng chảy thấp hẳn arylidenhydantoin gốc (bảng 3.2) Sự khác biệt nhóm aminomethyl N-3 làm cho phân tử cồng kềnh hơn, khó xếp thành mạng lưới tinh thể đặn nên điểm nóng chảy thấp so với chất gốc không Thời gian phản ứng phụ thuộc vào chất amin vào cấu tạo phân tử arylidenhydantoin Đối với chất arylidenhydantoin thời gian phản ứng tăng theo thứ tự amin sau: piperidin N–CH2–N< , tương ứng với độ chuyển dịch hố học có giá trị từ 4,32÷4,90 ppm - Xét phổ 13C-NMR chất base Mannich I(a-d)-IX(a-d) cho thấy số lượng nguyên tử carbon độ chuyển dịch hoá học tương ứng phù hợp (xem bảng 3.6) Cấu trúc chất xác nhận qua kỹ thuật phổ 2D HSQC, HMBC Hình 4.30 4.31 minh hoạ tương tác gần tương tác xa chất Ic (dẫn chất base Mannich từ N-methylpiperazin) H H H O 3' 2' R 5' 1' 4' 6' C H N H N C 3'' 6'' 5'' H 4'' N C N O 2'' H H H H H 19 Hình 4.30 Phổ HSQC chất Ic Hình 4.31 Phổ HMBC chất Ic - Chúng tiến hành ghi phổ MS chất base Mannich theo phương pháp EI LC 32 chất có xuất pic phân tử có khối lượng ion phân tử phù hợp với khối lượng phân tử dự đoán chất dự kiến Sự hình thành ion mảnh phổ MS (EI) base Mannich arylidenhydantoin xảy theo hướng theo sơ đồ sau (Hình 4.35) Số liệu pic ion mảnh số dẫn chất base Mannich (I(a-d), III(a-d), VII(a-d), VIII(a-d)) ghi bảng 4.11 20 Bảng 4.11 : Số liệu phổ MS sô dẫn chất base Mannich tổng hợp (I(a-d),III(a-d),VII(a-d), VIII(a-d)) Số TT Ký hiệu M M+ O F1-43 Ar O + N CH2 N H O Ar NH N H F4-R [ArCH=CNH]+ O F4CONHCO F5-R F6-HCN X H2C N + X HN + [NCONCH2] C+ H (63) m/z=90 + 10 11 12 13 Ia Ib Ic Id 287 285 300 307 F2 F3 F4 F5 F6 F7,F7’ F8 F9 F10 m/z=89 F11,F11’ 287 285 300 307 244 201 201 201 188 188 188 188 188 188 188 188 117 117 117 117 116 116 116 116 90 90 90 90 100 98 113 119 86 84 99 106 90, 89 90,89 90,89 90,89 257 HN CH CH 18 19 20 21 34 35 36 37 IIIa IIIb IIIc IIId VIIa VIIb VIIc VIId 303 301 316 323 321 319 334 341 303 301 316 322 321 319 334 341 260 273 216 217 217 278 236 291 204 204 204 203 222 222 222 222 188 188 188 VIIIa 332 332 39 40 VIIIb VIIId 330 352 330 351 289 233 233 187 F14 63 63 63 63 56 55 56 58 70 70 70 56 56 56 89 89 89 89 70 70 70 63 56 55 56 70 56 91 CH3 117 117 117 106 106 106 100 98 113 86 84 100 151 151 151 151 116 116 116 116 124 124 124 100 98 113 119 86 84 99 91 CH CH F13 CH3 133 133 133 HN 38 H2N F12 + O=C=N=CH2 (56) m/z=78 F1 (70) 78 78 78 CH3 162 116 100 86 89 162 116 98 84 89 + 21 + O O N H + 1H X (F10) N X + C H R - HNCO N CH2 N X (F9) CH2 N m/z = 43 O + N CH2 R O N R N X C H R F3 F2 C H R [NCONCH2] + F14 m/z=70 N H -R O N H N=C=O CO + NH C H O + NH Ar Ar NH F6 F5' F5 O N CH2 X O m/z=187 X F1 NH C H N CH2 N N H F4 O F14’ m/z=56 O N H -R + OC=N=CH2 O + NH C H O N H + O m/z=188 - CONHCO m/z=71 -HCN m/z=27 -R + CH=C=N + CH=C=NH CH R F7 m/z=116 F7' m/z=117 - CH3 + F8 R R R +2H +3H -C + + C H F13 m/z=63 + + F12 m/z=78 -C2H2 F11 m/z = 90 F11' m/z=89 Hình 4.35 Sơ đồ phân mảnh tổng quát dẫn chất base Mannich 4.2 Về tác dụng sinh học 4.2.1 Về hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm - Trong số 43 chất tổng hợp có chất (IXb, IXd) có tác dụng với chủng vi khuẩn B.subtilis (MIC=50μg/ml), chất (VII, VIIa, VIIb, VIII, VIIIa, VIIIb, IXa) có hoạt tính kháng chủng vi khuẩn S.aureus (riêng chất VIIb có MIC=25 μg/ml), chất cịn lại có MIC=50μg/ml) chất (VIIIa) có hoạt tính kháng nấm Asp.niger (MIC=50μg/ml), chất (IXa, IXb, IXd) có hoạt tính kháng chủng nấm S.cerevisiae (MIC=50μg/ml).Cả 43 chất tổng hợp khơng có hoạt tính kháng chủng vi khuẩn Gram (-) (E.coli, P.aeruginosa), khơng có hoạt tính kháng chủng nấm F.oxysporum C.albicans 22 - Các nhóm hút điện tử (nhóm p-cloro chất VII, VIIa, VIIb; nhóm -NO2 (nhóm m-NO2) chất VIII, VIIIa, VIIIb nhóm -NO2 (nhóm p-NO2) chất IXa, IXb, IXd) góp phần mang lại hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm dẫn chất 5-arylidenhydantoin dẫn chất base Mannich chúng Theo chúng tơi, có lẽ nhóm hút điện tử (Cl, NO2) làm phân cực mạnh liên kết đơi C=C nhóm carbonyl α,β-khơng no, làm tăng khả tham gia phản ứng cộng Michael với chất nhân sinh học (chứa –SH, -NH2) vi khuẩn nấm, gây tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm Ảnh hưởng nhóm base Mannich thấy rõ chất IX, chất IX khơng có hoạt tính cịn chất IXa, IXb, IXd có hoạt tính 4.2.2 Về hoạt tính kháng tế bào ung thư người - Trong số 43 chất tổng hợp có 13 chất (VI, VIa, VIb, VII, VIIb, VIIc, VIId, VIII, VIIIa, VIIIb, VIIId, IX, IXa) có hoạt tính kháng tế bào ung thư gan Hep-G2 (IC50=0,38÷5μg/ml) chất có hoạt tính mạnh chất VIIc (IC50=0,38 μg/ml).Cả 43 chất tổng hợp khơng có hoạt tính kháng tế bào ung thư phổi LU - dẫn chất 5-arylidenhydantoin (VI, VII, VIII, IX) dẫn chất base Mannich chúng (VIa, VIb, VIIb, VIIc, VIId, VIIIa, VIIIb, VIIId, IXa) có đặc điểm cấu tạo chung chứa nhóm hút điện tử (Cl, NO2) Cơ chế tác dụng giả thiết tương tự nêu tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm : nhóm hút điện tử (Cl, NO2) làm phân cực mạnh liên kết đôi C=C nhóm carbonyl α,β-khơng no phân tử thử nghiệm dẫn tới khả tham gia phản ứng cộng Michael chúng với chất nhân sinh học tế bào ung thư với hệ ức chế phát triển tế bào ung thư Mặt khác, liên kết đơi liên hợp ngồi vịng cịn tạo cho hợp chất có khả tác dụng tương tác với vị trí hoạt động EGFR (thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu mơ) Đó chế tác dụng kép dãy chất - Về so sánh tác dụng dẫn chất base Mannich với 5-arylidenhydantoin gốc, nhận thấy ảnh hưởng nhóm aminomethyl N-3 khơng đồng đều, khơng có tính qui luật Để giải thích ảnh hưởng nhóm base Mannich cần xem xét đến thơng số lý hố logP thông số điện tử cấu trúc momen lưỡng cực μ, số lập thể Es hay khả chuyển hoá base Mannich trở lại chất ban đầu có hoạt tính với vai trị tiền thuốc (prodrug) nêu tài liệu P.K Larsen [37] - Các hợp chất khác khơng có hoạt tính kháng Hep-G2 LU có hoạt tính kháng dịng tế bào ung thư khác 4.2.3 Tính logP chất tổng hợp để đánh giá sơ liên quan hoạt tính sinh học tính chất lý hố Chúng tơi tính logP 43 chất tổng hợp cách sử dụng phần mềm ChemSketch để vẽ công thức chất, sau dùng phần mềm KowWin version 1.67 để tính giá trị logP chất Kết ghi bảng 4.12 Giá trị logP 43 dẫn chất hydantoin tổng hợp < 4, giá trị đáp ứng yêu cầu giá trị logP 23 phân tử giống thuốc ≤ theo “qui tắc 5” Lipinsky Chúng tơi trình bày mối liên quan giá trị logP IC50 hình 4.36 Từ hình 4.36 nhận thấy khoảng giá trị logP 13 dẫn chất hydantoin có hoạt tính kháng dòng tế bào ung thư gan Hep-G2 (IC50≤5 μg/ml) 0,36÷3,84 hồn tồn tương tự với khoảng giá trị logP 30 dẫn chất hydantoin cịn lại khơng có hoạt tính kháng dịng tế bào ung thư gan Hep-G2 (IC50>5 μg/ml) 0,17÷3,84 Điều cho thấy khơng có mối liên quan rõ ràng giá trị logP hoạt tính kháng dịng tế bào HepG2 dãy chất nghiên cứu Bảng 4.12 : Giá trị logP chất tổng hợp tính phần mềm KowWin Chất I Ia Ib Ic Id II IIa IIb IIc IId III IIIa IIIb IIIc IIId LogP 1,65 0,68 2,43 0,65 3,2 1,17 0,20 1,94 0,17 2,72 1,17 0,20 1,94 0,17 2,72 Chất IV IVa IVb IVc IVd V Va Vb Vc Vd VI VIa VIb VIc VId LogP 1,82 0,86 2,60 0,83 3,37 1,85 0,88 2,63 0,85 3,40 2,29 1,32 3,07 1,29 3,84 Chất VII VIIa VIIb VIIc VIId VIII VIIIa VIIIb VIIId IX IXa IXb IXd LogP 2,29 1,32 3,07 1,29 3,84 1,32 0,36 2,10 2,87 1,32 0,36 2,10 2,87 IXd IXb VIIa VIc Vc Va IC50 μg/ml) >5 IVc IVa IIIa IIc IIa III 5,0 VIIIa IV IIIb IVb VII VIa IX VId Vd IVd IIId IId Id VIb VIIIb VI IXa 3,0 Ib I VIII 4,0 Vb IIb II Ic Ia V VIId VIIId 2,0 VIIb 1,0 VIIc 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 LogP Hình 4.36 Giá trị log P IC50 5-arylidenhydantoin dẫn chất base mannich chúng dòng tế bào ung thư gan Hep-G2 24 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Kết luận Từ kết nghiên cứu trình bày đây, rút số kết luận sau: Đã tổng hợp 43 dẫn chất hydantoin, có 32 chất chưa thấy cơng bố tài liệu tham khảo [I(a-d)÷VII(a-d), VIIId, IXa, IXb, IXd)] Kết cụ thể sau: - Đã tổng hợp dẫn chất 5-arylidenhydantoin (I-IX) - Đã tổng hợp 34 dẫn chất base Mannich (I(a-d)÷IX(a-d)) chất 5arylidenhydantoin (I-IX) + Tất chất tổng hợp được kiểm tra độ tinh khiết sắc ký lớp mỏng đo nhiệt độ nóng chảy Cấu trúc chất tổng hợp xác định phân tích phổ hồng ngoại, phổ cộng hưởng từ proton (1H-NMR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C (13C-NMR), phổ chiều (HMBC, HSQC), phổ khối lượng (MS) Kết thu cho phép kết luận chất tổng hợp có cấu trúc dự kiến có cấu hình Z 2.+ Đã thử tác dụng kháng khuẩn 43 chất tổng hợp với chủng vi khuẩn Gram (+) chủng vi khuẩn Gram (-) Kết cho thấy số 43 chất tổng hợp có chất (IXb, IXd) có tác dụng với chủng vi khuẩn B.subtilis (MIC=50μg/ml), chất (VII, VIIa, VIIb, VIII, VIIIa, VIIIb, IXa) có hoạt tính kháng chủng vi khuẩn S.aureus (riêng chất VIIb có MIC=25 μg/ml, chất cịn lại có MIC=50μg/ml) Cả 43 chất tổng hợp khơng có hoạt tính kháng chủng vi khuẩn Gram (-) (E.coli, P.aeruginosa) + Đã thử tác dụng kháng nấm 43 chất tổng hợp với chủng nấm mốc, chủng nấm men Kết cho thấy số 43 chất có chất (VIIIa) có hoạt tính kháng nấm Asp.niger (MIC=50μg/ml), chất (IXa, IXb, IXd) có hoạt tính kháng chủng nấm S.cerevisiae (MIC=50μg/ml) Cả 43 chất tổng hợp khơng có hoạt tính kháng chủng nấm F.oxysporum C.albicans + Đã thử hoạt tính kháng tế bào ung thư 43 chất tổng hợp dòng tế bào ung thư người tế bào ung thư gan Hep-G2 tế bào ung thư phổi LU Kết cho thấy số 43 chất tổng hợp có 13 chất (VI, VIa, VIb, VII, VIIb, VIIc, VIId, VIII, VIIIa, VIIIb, VIIId, IX, IXa) có hoạt tính kháng tế bào ung thư người Hep-G2 (IC50=0,38÷5μg/ml) chất có hoạt tính mạnh chất VIIc (IC50=0,38 μg/ml) Cả 43 chất tổng hợp khơng có hoạt tính kháng tế bào ung thư phổi LU Kết hoạt tính kháng tế bào ung thư gan Hep-G2 dãy chất đáng quan tâm Đề xuất Từ kết nghiên cứu , có đề xuất sau: - Tiến hành xác định độc tính cấp tác dụng chống khối u động vật thí nghiệm chất có hoạt tính kháng tế bào ung thư mạnh để hướng tới việc tìm kiếm thuốc chống ung thư - Tiếp tục thử nghiệm hoạt tính kháng tế bào ung thư chất tổng hợp dòng tế bào ung thư khác - Tiếp tục tổng hợp sàng lọc hoạt tính sinh học dẫn chất hydantoin nhằm tìm kiếm chất có triển vọng dãy chất ... phương pháp tổng hợp dẫn chất xuất phát từ nhân hydantoin - Tác dụng sinh học dẫn chất hydantoin bao gồm: tác dụng chống co giật; tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm; tác dụng chống ung thư tác dụng khác... tiêu luận án - Tổng hợp số dẫn chất hydantoin thuộc dãy 5-arylidenhydantoin dẫn chất base Mannich - Thử sàng lọc tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, kháng tế bào ung thư chất tổng hợp để tìm kiếm chất. .. nghiên cứu, tổng hợp sàng lọc tác dụng sinh học dẫn chất hydantoin, tìm thấy nhiều dẫn chất có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, tác dụng chống ung thư Trong số đó, dẫn chất 5-arylidenhydantoin