Mục tiêu nghiên cứu của đề tài Nghiên cứu cải thiện khả năng mang thuốc chống ung thư cisplatin của chất mang nano dendrimer là tổng hợp hệ vật liệu nano mang thuốc trên nền dendrimer (PAMAM) biến tính với PNIPAM và PAA tương hợp sinh học nhằm cải thiện hiệu quả mang thuốc Cisplatin.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ NGUYỄN NGỌC HỊA NGHIÊN CỨU CẢI THIỆN KHẢ NĂNG MANG THUỐC CHỐNG UNG THƯ CISPLATIN CỦA CHẤT MANG NANO DENDRIMER Chuyên ngành: Vật liệu cao phân tử tổ hợp Mã số: 44 01 25 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHOA HỌC VẬT LIỆU TP HỒ CHÍ MINH – 2020 Cơng trình hồn thành tại: Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: GS TS Nguyễn Cửu Khoa Người hướng dẫn khoa học 2: PGS TS Trần Ngọc Quyển Phản biện 1: … Phản biện 2: … Phản biện 3: … Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi … ’, ngày … tháng … năm 2020 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Dendrimer lần tổng hợp từ năm 1970-1990 hai nhóm khác (Buhleier cộng sự; Tomalia cộng sự) Các dendrimer kiểm sốt chặt chẽ cấu trúc có nhóm chức bề mặt biến tính dễ dàng tùy thuộc vào mục đích sử dụng Các dendrimer thiết kế để vận chuyển thuốc nhằm gia tăng dược động học phân phối sinh học thuốc tăng cường khả hướng đích thuốc Dendrimer tương tác với phân tử thuốc cách hấp phụ bề mặt, tương tác tĩnh điện liên kết với nhóm chức bề mặt liên kết hóa trị cách bao gói thuốc vào khoang trống dendrimer Các khoang trống bên thường có tính chất kỵ nước, cho phép tương tác với loại thuốc hòa tan Với số lượng lớn nhóm chức bề mặt dendrimer (như amine -NH2 nhóm carboxylate -COO-) cho phép gắn lượng lớn loại thuốc khác tương tác tĩnh điện vận chuyển chúng đến đích Cisplatin từ lâu dùng điều trị lâm sàng loại bệnh ung thư khả gây chết tế bào ung thư thuốc Tùy thuộc vào loại tế bào nồng độ Cisplatin gây độc tế bào Ngồi ra, Cisplatin làm tổn thương khối u thơng qua việc tác động lên hiệu ứng gây chết tế bào apoptosis theo phương thức khác Mặt khác, nghiên cứu Cisplatin gây nhiều tác dụng phụ thần kinh, độc tính với thận ức chế tủy xương Hơn nữa, Cisplatin liên kết với protein enzyme gây việc điều chỉnh chế sinh hóa chúng Q trình điều trị ung thư Cisplatin dẫn tới tế bào ung thư trở nên kháng Cisplatin làm giảm khả điều trị thuốc Nhiều chế kháng Cisplatin nghiên cứu bao gồm thay đổi hấp thụ tế bào, tràn dịch thuốc, tăng giải độc, ức chế trình chết tế bào apoptosis tăng sửa chữa DNA Để giảm thiểu việc kháng thuốc Cisplatin giảm độ gây độc tế bào Cisplatin nhiều giải pháp nghiên cứu chứng minh tính hiệu điều trị bệnh ung thư Một giải pháp việc sử dụng PAMAM dendrimer làm chất mang thuốc Cisplatin Kế thừa phát triển nội dung mà nhóm nghiên cứu Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng thực hiện, nội dung nghiên cứu luận án này, tiếp tục cải thiện khả mang thuốc Cisplatin PAMAM dendrimer sở tăng cường nhóm chức bề mặt dendrimer nhằm tăng khả mang thuốc Cisplatin hệ chất mang Mục tiêu nghiên cứu luận án Tổng hợp hệ vật liệu nano mang thuốc dendrimer (PAMAM) biến tính với PNIPAM PAA tương hợp sinh học nhằm cải thiện hiệu mang thuốc Cisplatin Các nội dung nghiên cứu luận án - Điều chế dẫn xuất PAMAM dendrimer: (PAMAM dendrimer - Poly(N-isopropylacrylamide), PAMAM dendrimer - Poly acrylic acid) - Đánh giá cấu trúc độ chuyển hóa - Đánh giá khả mang thuốc Cisplatin hệ chất mang PAMAM dendrimer hệ chất mang PAMAM dendrimer tạo dẫn xuất bao gồm PAMAM dendrimer - Poly(N-isopropylacrylamide), PAMAM dendrimer - Poly acrylic acid - Phân tích cấu trúc phức chất hệ chất mang - Cisplatin đánh giá hiệu suất mang thuốc Cisplatin hệ chất mang - Thử độc tính tế bào PAMAM dendrimer số dẫn xuất PAMAM dendrimer CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu dendrimer 1.1.1 Khái niệm phân loại Khái niệm dendrimer Donald A Tomalia cộng đưa vào năm 1985 Dendrimer bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp “Dendron”, có nghĩa nhánh Từ đến có nhiều cơng trình nghiên cứu cấu trúc, tính chất, phương pháp tổng hợp ứng dụng dendrimer nhiều lĩnh vực khác Dendrimer nanopolymer có dạng hình cầu, cấu trúc nhánh, có nhiều tính chất ưu việt so với polymer mạch thẳng Cấu tạo phân tử dendrimer gồm ba phần (hình 1.1) Hình 1.1 Cấu tạo phân tử Dendrimer - Một lõi (nhân core) trung tâm dendrimer bao gồm (i) nguyên tử phân tử có hai nhóm chức giống nhau; (ii) nhánh, phát từ lõi, lặp lặp lại có nhiệm vụ liên kết nhóm ngồi với nhân; (iii) nhiều nhóm bên ngồi (nhóm anion, cation, nhóm trung tính, nhóm ưa nước hay kỵ nước) cịn gọi nhóm bề mặt hoạt động Dendrimer, đặc biệt PAMAM dendrimer với cấu trúc khơng gian có nhiều khoảng trống bên nhóm chức hoạt động amine, ester nằm phía bên ngồi tảng cho việc hình thành hệ chất mang thuốc chống ung thư đa chức hướng đích đến tế bào ung thư theo chế hướng đích thụ động hướng đích chủ động 1.1.2 Tính tương hợp sinh học dendrimer Các dendrimer xem chất mang thơng minh chúng có khả mang thuốc vào nội bào, vượt qua rào cản sinh học, lưu thông thể thời gian cần thiết để gây hiệu ứng lâm sàng nhắm tới mục tiêu cụ thể Độc tính dendrimer chủ yếu gây nhóm bề mặt Nhóm amine (-NH2) bề mặt PAMAM PPI dendrimer gây độc tính chứng huyết tan (hemolysis) tùy theo nồng độ chúng nhóm ngồi nhóm trung tính anion có độc tính thấp khơng độc Để tăng tính tương hợp sinh học khả hướng đích giảm độc tính dendrimer PAMAM với tế bào giữ đặc tính bật PAMAM dendrimer với vai trò chất mang, giải pháp đưa tiến hành biến tính bề mặt PAMAM dendrimer cách tạo liên kết với cấu tử khác khơng có khả tích điện nhằm gia tăng tính tương hợp sinh học hướng đích hệ chất mang PAMAM dendrimer 1.2 Thuốc chống ung thư chứa Cisplatin 1.2.1 Tính chất Cisplatin Cisplatin, cịn gọi cis-diamminedichloroplatinum (II), phức chất có cấu trúc tứ diện với ion trung tâm Pt Cisplatin M Peyrone tổng hợp lần vào năm 1844 cấu trúc hóa học Alfred Werner chứng minh vào năm 1893 Tuy nhiên, năm 1960 giới khoa học bắt đầu quan tâm đến việc sử dụng hợp chất việc điều trị ung thư sau Cisplatin ý đặc biệt cho thấy hoạt tính chống ung thư nhiều khối u bao gồm ung thư buồng trứng, tinh hoàn khối u rắn đầu cổ Các đặc tính gây độc tế bào Cisplatin biết đến vào năm 1960 đến cuối năm 1970 xem thành phần quan trọng việc điều trị hệ thống tế bào mầm ung thư Đây hợp chất Pt (II) FDA chấp thuận điều trị ung thư vào năm 1978 Điều thu hút quan tâm nhà khoa học đến hợp chất Pt (II) kim loại khác thuốc chống ung thư tiềm Tuy nhiên, tính kháng thuốc phản ứng phụ đáng kể Cisplatin, phác đồ điều trị kết hợp Cisplatin với loại thuốc ung thư khác áp dụng xem phương pháp điều trị cho nhiều loại bệnh ung thư người CHƯƠNG NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị nghiên cứu Các hóa chất cung cấp từ hãng Acros, Sigma Aldrich, Merck với chất lượng cao phù hợp mục đích sử dụng cho tổng hợp hóa học phân tích Thiết bị sử dụng bao gồm: Tủ sấy, bể siêu âm, máy khuấy từ gia nhiệt, tủ sấy chân không, Máy cô quay chân không Eyala, bể gia nhiệt memmert, máy đông khô chân không TT Công nghệ Việt Đức, trường ĐH Cơng nghiệp Thực phẩm thành phố Hồ Chí Minh Quan sát hình thái, kích thước mẫu (TEM) chụp máy JEOL JEM 1400 140 KV, Nhật Bản Phân tích quang phổ hồng ngoại FTIR máy Equinox 55 Bruker HPLC đo máy Agilent 1260, Hoa Kỳ Phổ 1H-NMR đo máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance 500 Hàm lượng Pt đo máy ICP-MS-7700x/Agilent (VILAS) Đánh giá độc tế bào đo PTN-SHPT- BM Di truyền, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Thành phố Hồ Chí Minh 2.2 Phương pháp thực nghiệm 2.2.1 Tổng hợp PAMAM dendrimer đến hệ G4.5 từ tâm ethylenediamine (EDA) Quá trình tổng hợp PAMAM dendrimer hệ G4.5 qua 11 giai đoạn (hình 2.1), bắt đầu giai đoạn tổng hợp hệ G-0.5 từ ethylenediamine (EDA) phản ứng với methyl acrylate (MA) thực đến hệ G0, G0.5, G1.0, G1.5, G2.0, G2.5, G3.0, G3.5, G4.0 G4.5 Cấu trúc khối lượng phân tử sản phẩm tạo thành xác định phổ 1H-NMR 2.2.2 Tổng hợp phức PAMAM dendrimer G3.0, G4.0 với Cisplatin Cisplatin hòa tan H2O khuấy liên tục nhiệt độ phòng mơi trường khí N2 PAMAM dendrimer G3.0, G4.0 điều chỉnh đến pH 7-8 HCl Nhỏ từ từ dung dịch PAMAM dendrimer vào dung dịch Cisplatin, khuấy liên tục 24 đánh siêu âm nhiệt độ phịng mơi trường khí N2 Sản phẩm lọc túi thẩm tách đông khô để thu dạng bột 2.2.3 Tổng hợp phức PAMAM dendrimer G2.5, G3,5, G 4.5 với Cisplatin PAMAM dendrimer G2.5, G3.5, G4.5 thủy phân NaOH để tạo nhóm chức bề mặt - COO thực phản ứng tạo phức thực mục 2.2.2 2.2.4 Tổng hợp phức PAMAM dendrimer G2.5, G3,5, G 4.5 với Cisplatin thủy phân Cisplatin thủy phân trước AgNO3 để chuyển dạng monoaqua [cis-(NH2)2PtCl(H2O)] diaqua [cis-(NH2)2Pt(H2O)2] khuấy liên tục nhiệt độ phòng mơi trường khí N2 PAMAM dendrimer G2.5, G3.5, G4.5 thủy phân NaOH cho từ từ vào dung dịch Cisplatin thủy phân, khuấy liên tục 24 đánh siêu âm nhiệt độ phòng mơi trường khí N2 Sản phẩm lọc túi thẩm tách đông khô để thu dạng bột Hình 2.1 Sơ đồ tổng hợp PAMAM dendrimer 2.2.5 Biến tính PAMAM dendrimer G 3.0 với Poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) PNIPAM với nhóm chức đầu cuối -COOH kích hoạt pnitrophenyl chloroformate (NPC) N-Hydroxysuccinimide (NHS) sau cho phản ứng với nhóm -NH2 bề mặt PAMAM dendrimer G 3.0, khuấy liên tục 24 Sản phẩm lọc túi thẩm tách đông khô để thu dạng bột Đánh giá cấu trúc độ chuyển hóa phổ 1H-NMR 2.2.6 Tổng hợp PAMAM dendrimer G 3.5-PNIPAM Sản phẩm PAMAM dendrimer G3.0-PNIPAM nhóm -NH2 chưa phản ứng cho phản ứng với methyl acrylate mơi trường khí N2 96h để tạo PAMAM dendrimer G 3.5-PNIPAM Đánh giá cấu trúc độ chuyển hóa phổ 1H-NMR 2.2.7 Tổng hợp phức PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM với Cisplatin Thực phản ứng tạo phức PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM với Cisplatin tương tự mục 2.2.4 2.2.8 Biến tính PAMAM dendrimer G3.0, G4.0 với poly (acrylic acid) (PAA) PAA kích hoạt 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) sau đem phản ứng với nhóm chức bề mặt -NH2 PAMAM dendrimer G3.0, G4.0 Sản phẩm lọc túi thẩm tách đông khô để thu dạng bột Đánh giá cấu trúc độ chuyển hóa phổ 1H-NMR 2.2.9 Tổng hợp phức PAMAM dendrimer G3.0-PAA, PAMAM dendrimer G4.0-PAA với Cisplatin Thực phản ứng tạo phức PAMAM dendrimer G3.0-PAA, PAMAM dendrimer G4.0-PAA với Cisplatin tương tự mục 2.2.4 2.2.10 Bước đầu thử nghiệm khả nang hóa giải phóng thuốc 5-FU phức PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM-Cisplatin 5-FU hòa tan nước khử ion (DI) sau cho từ từ vào dung dịch chứa PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM-Cisplatin Đánh siêu âm 1h khuấy dung dịch 24h nhiệt độ phòng Sản phẩm lọc túi thẩm tách đông khô để thu dạng bột Sử dụng phương pháp HPLC để đánh giá khả nang hóa giải phóng thuốc 5-FU hệ chất mang 2.2.11 Xác định hàm lượng Cisplatin sản phẩm ICP-MS Phép đo ICP thực hệ thống ICP-MS-7700x/Agilent Hàm lượng Pt xác định dựa khối phổ Pt 195, nội chuẩn Luterium khối phổ 175 2.2.12 Khảo sát giải phóng thuốc in vitro Tiến hành khảo sát khả giải phóng thuốc khỏi hệ chất mang theo thời gian môi trường đệm pH 7,4 pH 5,5 2.2.13 Động học dược động học giải phóng thuốc Chọn lựa mơ hình động học giải phóng thuốc Cisplatin dựa mơ hình động học phổ biến mơ hình bậc 0, bậc 1, Higuchi, Kormeyer-Peppas, Hixson-Crowell Mơ hình động học phù hợp với giải phóng thuốc chọn lựa dựa theo tiêu chuẩn AIC (tiêu chuẩn thông tin Akaike) R2hc (R2 hiệu chỉnh) tính tốn phần mềm R Dự đốn mơ hình dược động học tính tốn thơng số dược động học hệ chất mang Cisplatin 2.2.14 Kiểm tra độc tính tế bào in vitro Sử dụng phương pháp nhuộm SRB để đánh giá độc tính tế bào dòng tế bào ung thư phổi NCIH460 dòng tế bào ung thư vú MCF-7 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Tổng hợp PAMAM Dendrimer hệ G-0.5 đến G4.5 Xác định cấu trúc dendrimer PAMAM dựa vào phổ 1H-NMR Độ dịch chuyển hóa học cho proton đặc trưng dendrimer PAMAM ghi nhận theo nhiều báo cáo trước Trong kết phổ 1H -NMR tương ứng với proton điển hình cấu trúc dendrimer: CH2CH2N< (a) δH = 2,60 ppm; -CH2CH2CO- (b) δH = 2,80-2,90 ppm; -CH2CH2CONH- (c) δH = 2,30 - 2,40 ppm; -CH2CH2NH2 (d) δH = 2,70 -2,80 ppm; -CONHCH2CH2N- (e) δH = 3,20 - 3,40 ppm; -CH2CH2COOCH3- (g) δH = 2,40 - 2,50 ppm -COOCH3 (h) δH = 3,70 ppm Kết 1H-NMR dendrimer PAMAM hệ sau: H-NMR PAMAM G-0.5: δH = 2,47 - 2,50 ppm (a), δH = 2,77-2,80 ppm (b), δH = 2,54 ppm (g) δH = 3,68 ppm (h) H -NMR PAMAM G0.0: δH = 2,56 - 2,57 ppm (a), δH = 2,77 - 2,82 ppm (b), δH = 2,37 - 2,40 ppm (c), δH = 2,71 -2,75 ppm (d) δH = 3,25 - 3,27 ppm (e) H -NMR PAMAM G0.5: δH = 2,54 -2,57 ppm (a), δH = 2,76 - 2,82 ppm (b), δH = 2,37 - 2,40 ppm (c), δH = 3,24 - 3,26 ppm (e), δH = 2,45 - 2,48 ppm (g) δH = 3,66 ppm (h) H -NMR PAMAM G1.0: δH = 2,59 - 2,60 ppm (a), δH = 2,80 -2,82 ppm (b), δH = 2,38 - 2,40 ppm (c), δH = 2,73 - 2,76 ppm (d) δH = 3,26 - 3,28 ppm (e) H -NMR PAMAM G1.5: δH = 2,58 - 2,59 ppm (a), δH = 2,78 - 2,86 ppm (b), δH = 2,39 - 2,42 ppm (c), δH = 3,27 - 3,29 ppm (e), δH = 2,47 -2,50 ppm (g) δH = 3,69 ppm (h) H -NMR PAMAM G2.0: δH = 2,57 - 2,59 ppm (a), δH = 2,77 -2,81 ppm (b), δH = 2,36 -2,38 ppm (c), δH = 2,68 -2,74 ppm (d) δH = 3,24 - 3,27 ppm (e) H -NMR PAMAM G2.5: δH = 2,57 - 2,64 ppm (a), δH = 2,84 - 2,86 ppm (b), δH = 2,40 -2,42 ppm (c), δH = 3,27 -3,30 ppm (e), δH = 2,48 - 2,46 ppm (g) δH = 3,68 - 3,69 ppm (h) H -NMR PAMAM G3.0: δH = 2,61 - 2,62 ppm (a), δH = 2,80 -2,83 ppm (b), δH = 2,38 - 2,40 ppm (c), δH = 2,74 - 2,76 ppm (d) δH = 3,26 -3,29 ppm (e) H -NMR PAMAM G3.5: δH = 2,57 -2,64 ppm (a), δH = 2,84-2,85 ppm (b), δH = 2,38 -2,43 ppm (c), δH = 3,27 -3,37 ppm (e), δH = 2,48 -2,51 ppm (g) δH = 3,69 ppm (h) H -NMR PAMAM G4.0: δH = 2,59 -2,62 ppm (a), δH = 2,80 -2,83 ppm (b), δH = 2,39 – 2,40 ppm (c), δH = 2,74 – 2,76 ppm (d) δH = 3,26 -3,28 ppm (e) H -NMR PAMAM G4.5: δH = 2,57 - 2.65 ppm (a), δH = 2,84 – 2,85 ppm (b), δH = 2,39 – 2,42 ppm (c), δH = 3,27 - 3.31 ppm (e), δH = 2,47 - 2.50 ppm (g) δH = 3,69 ppm (h) Hình 3.1 Phổ 1H-NMR PAMAM Dendrimer hệ So sánh tỷ lệ proton vị trí (a), (e) phân tử dendrimer χLT) tỉ lệ diện tích peak proton vị trí (a), (e) thể phổ 1H-MNR (χNMR) chúng tơi lập cơng thức tính khối lượng phân tử dendrimer thông qua phổ 1H-NMR sau: Trong đó: (e) M(NMR) = χNMR χLT (a) MLT = SH(-CH2 -) (e) ∑ H(-CH2 -) (a) SH(-CH2 -) , SH(-CH2 -) : Diện tích peak proton vị trí (e) (a) xuất phổ 1HNMR (e) (a) ∑ H(-CH2 -) , ∑ H(-CH2 -) : Tổng số proton vị trí (e) (a) tính cơng thức phân tử PAMAM Dendrimer MLT : Khối lượng phân tử Dendrimer tính theo lý thuyết (e) SH(-CH2 -) MLT (a) ∑ H(-CH2 -) Kết tính tốn sau: Bảng 3.1 Kết tính tốn KLPT Dendrimer theo 1H-NMR (e) H(-CH2-) G-0.5 (a) H(-CH2-) χLT M(LT) χNMR M(NMR) Sai lệch (vị trí b) 404 2,01 405,62 0,40% G0 2,00 517 1,99 515,02 0,32% G0.5 12 0,67 1205 0,67 1205,42 0,06% G1.0 24 12 2,00 1430 1,95 1396,18 2,36% G1.5 24 28 0,86 2808 0,81 2668,19 4,96% G2.0 56 28 2,00 3257 1,95 3181,78 2,30% G2.5 56 60 0,93 6012 0,90 5774,30 3,95% G3.0 120 60 2,00 6910 1,90 6556,70 5,11% G3.5 120 124 0,97 12420 0,92 11809,71 4,91% G4.0 248 124 2,00 14216 1,90 13510,97 4,96% G4.5 248 252 0,98 25237 0,90 23103,55 8,45% Các phân tử PAMAM dendrimer hệ từ G-0.5 đến G4.5 tổng hợp thành cơng có cấu trúc tương đối đồng ổn định nên ứng dụng làm chất mang thuốc 3.2 Phổ FTIR sản phẩm phức PAMAM dendrimer với Cisplatin 3.2.1 Phổ FTIR PAMAM Dendrimer G2.5, G3.5, G4.5 phức G2.5-CisPt, G3.5-CisPt, G4.5CisPt Phổ FTIR PAMAM G2.5, G3.5 có tín hiệu hấp thu có cường độ mạnh tín hiệu có cường độ trung bình yếu vị trí 1731 cm-1, 1045 cm-1 (G2.5); 1736 cm-1, 1646 cm-1 (G3.5) tương ứng với νC=O, νC-O nhóm chức ester Một tín hiệu hấp thu có cường độ mạnh, mũi bầu rộng đặc trưng cho dao động nối –OH 3294 cm-1 (G2.5); 3302 cm-1 (G3.5); 3426 cm-1 (G4.5), tín hiệu hấp thu amide nằm vùng bị tín hiệu nối –OH che khuất Tín hiệu đặc trưng cho dao động bất đối xứng nhóm –CH2, CH3, tín hiệu đặc trưng cho dao động nối –CH3 2952 cm-1, 2832 cm-1 (G2.5); 2952 cm-1, 2830 cm-1 (G3.5), tín hiệu dao động biến dạng ngồi mặt phẳng nhóm CH3 1360 cm-1 (G2.5), 1359 cm-1 (G3.5), 1399 cm-1 (G4.5) Các mũi với tín hiệu dao động đặc trưng phù hợp với nhóm có cơng thức sản phẩm PAMAM dendrimer G2.5, 3.5, 4.5 So với PAMAM G2.5, 3.5, 4.5 phổ FTIR phức tương ứng PAMAM G2.5-Cisplatin, G3.5Cisplatin, G4.5-Cisplatin có tín hiệu hấp thu tương tự Tuy nhiên, cường độ tín hiệu hấp thu có thay đổi rõ Do q trình tạo phức, phần lớn nhóm ester ngồi PAMAM chuyển thành COO- nên dao động νC=O, νC-O nhóm ester có cường độ giảm xuống Đồng thời, dao dộng hóa trị bất đối xứng, đối xứng nhóm COO- chồng lên tín hiệu amide I, amide II δC-H nhóm CH3 nên cường độ tín hiệu hấp thu tăng lên liên quan đến dao động kéo căng N-H Cisplatin Kết cho thấy có hình thành liên kết phối trí ion Pt2+ với nhóm carboxylate -COO- PAMAM dendrimer Hình 3.2 Phổ FTIR PAMAM dendrimer G2.5, G3.5, G4.5 phức G2.5-Cisplatin, G3.5-Cisplatin, G4.5-Cisplatin 3.2.2 Phổ FTIR phức PAMAM Dendrimer G3.0-Cisplatin, G4.0-Cisplatin Phổ FTIR PAMAM dendrimer G3.0 G3.0-Cisplatin; G4.0 G4.0-Cisplatin cho thấy có dịch chuyển peak dao động biến dạng -NH 1643 cm-1 thành 1639 cm-1 (G3.0, G3.0-Cisplatin); 1643 cm-1 thành 1642 cm-1 (G4.0, G4.0-Cisplatin) Điều cho thấy có hình thành phức chất sở liên kết phối trí cation Pt2+ nhóm NH2 bề mặt PAMAM dendrimer G3.0 Ngồi ra, phổ FTIR cho thấy suy giảm cường độ dịch chuyển peak dao động kéo căng đối xứng bất đối xứng nhóm -CH2 2944 cm-1 2839 cm-1 PAMAM dendrimer G3.0 thành 2944 cm-1 2899 cm-1 phức G3.0-Cisplatin); 2944 cm-1 2839 cm-1 PAMAM G4.0 thành 2975 cm-1 2884 cm-1 phức G4.0-Cisplatin, peak hấp thu dạng mũi nhọn 3437 cm-1 (G3.0-Cisplatin) 3427 cm-1 (G4.0Cisplatin) liên quan đến dao động kéo căng N-H Cisplatin 3.8 Kết đo hàm lượng Pt 3.8.1 Kết đo hàm lượng Pt phức PAMAM dendrimer hệ chẵn-Cisplatin Bảng 3.3 Hàm lượng Pt phức PAMAM TT hệ chẵn - Cisplatin (không thủy phân) Tên mẫu %Cisplatin G3.0-Cisplatin 9,63 1,47 G4.0-Cisplatin 16,95 1,29 Kết biểu diễn dạng: trung bình SD (độ lệch chuẩn), số lần đo n=3 Kết cho thấy, hiệu gắn Cisplatin thu cao so với kết nghiên cứu trước nhóm nghiên cứu với kết hàm lượng Cisplatin phức G2.5-Cisplatin G3,5Cisplatin 10,33% 2,3% Sự khác biệt lớn tiến hành thủy phân trước 3.8.2 Kết đo hàm lượng Pt phức Cisplatin với AgNO3 Bằng cách này, Cisplatin gần PAMAM dendrimer hệ lẻ– Cisplatin (khơng thủy phân hồn tồn thành cation thủy phân) [Pt(NH3)2(H2O)]2+ nên hiệu gắn Cisplatin vào Bảng 3.4 Hàm lượng Pt phức PAMAM hệ lẻ - Cisplatin (không thủy phân) TT Tên mẫu G2.5-Cisplatin G3.5-Cisplatin G4.5-Cisplatin %Cisplatin 15,89 ± 1,41 7,90 ± 1,92 5,90 ± 0,68 Kết biểu diễn dạng: trung bình SD (độ lệch chuẩn), số lần đo n=3 Đối với PAMAM dendrimer G lẻ hàm lượng Cisplatin bị giảm hệ dendrimer tăng Khả mang thuốc thấp PAMAM dendrimer G lẻ hệ cao giải thích cản trở khơng gian nhóm carboxylate bề mặt, nhóm có xu hướng co cụm lại dẫn đến giảm khả mang thuốc Cisplatin Ngược lại với PAMAM dendrimer hệ lẻ, hàm lượng Cisplatin PAMAM dendrimer hệ chẵn G4.0 tăng khoảng 1,7 lần so với PAMAM dendrimer G3.0 3.8.3 Kết đo hàm lượng Pt phức PAMAM hệ lẻ– Cisplatin (thủy phân) Bảng 3.5 Hàm lượng Pt phức G2.5-Cisplatin, G3.5-Cisplatin G4.5-Cisplatin TT Tên mẫu G2.5-Cisplatin G2.5-Cisplatin (SA) G3.5-Cisplatin G3.5-Cisplatin (SA) G4.5-Cisplatin G4.5-Cisplatin (SA) %Cisplatin 28,99 2,01 31,82 1,39 30,23 1,29 33,01 1,56 31,11 1,48 34,03 1,96 Kết biểu diễn dạng: trung bình SD (độ lệch chuẩn), số lần đo n=3; SA: có sử dụng siêu âm PAMAM dendrimer hệ lẻ tăng lên nhiều Khi hệ PAMAM dendrimer tăng lên số nhóm bề mặt tăng số phân tử Cisplatin gắn vào PAMAM dendrimer tăng lên Tuy nhiên, so với gia tăng nhóm bề mặt hiệu gắn Cisplatin vào PAMAM giảm hệ dendrimer tăng Kirkpatrick cho hệ dendrimer tăng việc chuyển nhóm ngồi PAMAM dendrimer thành nhóm carboxylate khó khăn hiệu ứng không gian tăng làm giảm khả phản ứng Cisplatin với nhóm amine amide bên PAMAM dendrimer 3.8.4 Kết đo hàm lượng Pt phức G3.0-PAA-Cisplatin G4.0-PAA- Cisplatin (thủy phân) Bảng 3.6 Hàm lượng Pt phức G3.0-PAACisplatin (thủy phân) G4.0-PAA-Cisplatin (thủy TT phân) Tên mẫu G3.0-PAA-Cisplatin (1:6) G3.0-PAA-Cisplatin (1:12) G4.0-PAA-Cisplatin (1:8) G4.0-PAA-Cisplatin (1:16) %Cisplatin 12,93 1,60 13,89 1,39 20,22 1,44 40,44 1,29 Kết biểu diễn dạng: trung bình SD (độ lệch chuẩn), số lần đo n=3 Hàm lượng Cisplatin tăng tăng tỉ lệ mol polymer nhạy pH Poly acrylic acid (PAA) So sánh hàm lượng Cisplatin G3.0-Cisplatin, G4.0-Cisplatin với G3.0-PAA-Cisplatin, G4.014 PAA-Cisplatin ta thấy có mặt PAA làm tăng dendrimer tăng lên làm tăng đáng kể khả hàm lượng Cisplatin Điều giải thích mang thuốc Cisplatin hệ chất mang (bảng PAA có nhiều nhóm -COOH nên tăng khả hình 3.8) Mặt khác, liên kết Pt2+ nhóm amine thành liên kết phức chất Pt-COO- tăng khả bề mặt -NH2 hệ chất mang PAMAM mang thuốc Cisplatin dendrimer hệ chẵn (G3.0; G4.0) tương đối bền 3.9 So sánh khả mang thuốc Cisplatin khó giải phóng khỏi hệ chất Cisplatin hệ chất mang điều kiện mang không tiến hành khảo khơng thủy phân có thủy phân Cisplatin sát khả mang thuốc Cisplatin (thủy phân) Bảng 3.7 Khả mang thuốc Cisplatin (không PAMAM dendrimer có nhóm amine -NH2 bề thủy phân) hệ chất mang PAMAM mặt Kết bảng 3.13 cho thấy Cisplatin thủy T T Hệ chất mang G2.5-COOH G3.5-COOH G4.5-COOH G4.0-PAA (1:16) G3.0-NH2 G4.0-NH2 dendrimer Số nhóm chức % bề mặt Cisplatin NH2 COOH 32 15,89 1,41 64 7,90 1,92 128 5,90 0,68 49 405 19,06 1,44 32 64 0 9,63 1,47 16,95 1,29 Khả mang thuốc Cisplatin (không thủy phân) hệ chất mang PAMAM dendrimer tóm tắt bảng 3.7 Kết cho thấy hệ chất mang không mang nhiều thuốc Cisplatin so với nghiên cứu trước Tuy nhiên, tiến hành thủy phân cách triệt để Cisplatin AgNO3 để tạo thành dạng [Pt(NH3)2(H2O)n]2+ khả tạo phức Pt2+ Cispaltin với nhóm bề mặt -COOH hệ chất mang PAMAM phân dễ dàng tạo phức với nhóm carboxylate COOH bề mặt hệ chất mang Hệ chất mang PAMAM dendrimer G4.0-PAA (1:16) với số nhóm chức bề mặt -COOH vượt trội (405 nhóm) so với hệ chất mang khác mang lượng thuốc Cispaltin lên tới 40,44% Bảng 3.8 Khả mang thuốc Cisplatin (thủy phân) hệ chất mang PAMAM dendrimer T Hệ chất Số nhóm chức % T mang bề mặt Cisplatin NH2 COO H G2.5-COOH 32 31,82 1,39 G3.5-COOH 64 33,01 1,56 G4.5-COOH 128 34,03 1,96 G3.0-PAA 27 75 12,93 1,60 (1:6) G3.0-PAA 26 90 13,89 1,39 (1:12) G4.0-PAA 57 189 20,22 1,44 (1:8) G4.0-PAA 49 405 40,44 1,29 (1:16) 3.10 Thử nghiệm khả mang đồng thời hai thuốc 5-FU Cisplatin hệ chất mang PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM Hệ chất mang G3.5-PNIPAM tổng hợp từ PAMAM dendrimer G3.0 -PNIAM carboxylate hóa nhóm -COOCH3 ngồi thành nhóm -COO- có khả tạo phức với Cisplatin Hơn nữa, nhóm PNIPAM nhạy nhiệt bề mặt hệ chất mang thuộc loại polymer nhạy nhiệt có nhiệt độ tới hạn thấp (LCST, 320C) Ở điều kiện nhiệt độ điểm LCST, PNIPAM trương nở cực đại dung dịch thuốc mang phân tử thuốc vào bên mạng Khi nhiệt độ tăng lên điểm LCST, mạch polymer co ngót lại thuốc nhả bên ngồi mơi trường Trên sở ngun lý này, thực việc mang thuốc 5-FU vào hệ PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM-Cisplatin Kết nang hóa 30mg 5-FU vào 100 mg hệ copolymer PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM hệ phức chất PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM-Cisplatin sau: 15 Bảng 3.9 Kết nang hóa 5-FU vào phức G3.5-PNIPAM-Cisplatin 5FU khơng nang hóa 5-FU nang hóa mg mg %DL % EE PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM-5FUCisPt PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM-5FU PNIPAM-CisPt-5FU 4.32 0.26 25.68 0.26 20.43 0.17 85.61 0.88 3.73 0.29 26.27 0.29 20.81 0.18 87.57 0.97 11.90 0.27 18.10 0.27 15.32 0.20 60.33 0.91 Kết biểu diễn dạng: trung bình SD (độ lệch chuẩn), số lần đo n=3 Phức chất PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM-Cisplatin thể khả nang hóa 5-FU tạo thành hệ nano-gel nhạy nhiệt có khả mang đồng thời hai thuốc chống ung thư 5-FU Cisplatin Phác đồ điều trị ung thư với Cispaltin thường kết hợp thêm thuốc khác để làm tăng hoạt tính giảm tác dụng phụ thuốc Do đó, hệ PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM mang đồng thời hai thuốc chống ung thư 5-FU Cisplatin hệ mang thuốc chống ung thư đầy hứa hẹn 3.11 Kết đo TEM, DLS zeta Kích thước hạt nano phức PAMAM dendrimer hế hệ lẻ với Cisplatin tương đối đồng nằm khoảng 5-10 nm (hình 3.11) Kết TEM cho thấy kích thước hạt PAMAM dendrimer G3.0-PNIPAM tồn dung dịch 190 nm (hình 3.12) So với kích thuớc ban đầu PAMAM dendrimer G3.0 (3-4 nm) kích thước hạt PAMAM dendrimer G3.0-PNIPAM tăng lên nhiều làm tăng khả mang thuốc hạt Kích thước hạt hệ PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM-Cisplatin dung dịch 184 nm lớn nhiều polymer PNIPAM bao bọc phía bên ngồi hạt PAMAM dendrimer G3.5 Ảnh TEM (hình 3.13) mẫu PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM-Cisplatin cho thấy có khả Cisplatin tạo liên kết chéo với hệ chất mang PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM Hình 3.11 Ảnh TEM phức PAMAM dendrimer hệ lẻ - Cisplatin 16 Hình 3.12 Ảnh TEM mẫu G3.0, PAMAM dendrimer G3.0-PNIPAM DLS mẫu PAMAM dendrimer G3.0-PNIPAM Hình 3.13 Ảnh TEM mẫu PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM-Cisplatin DLS mẫu G3.5-PNIPAMCisplatin mẫu PNIPAM-Cisplatin Hình 3.14 Ảnh TEM PAMAM dendrimer G4.0 (A), G4.0-PAA Hình 3.15 Ảnh TEM hệ (C) DLS PAMAM dendrimer G4.0 (B), G4.0-PAA (D) PAMAM dendrimer G3.0-PAACisplatin PAMAM dendrimer G4.0-PAA-Cisplatin 17 Ảnh TEM PAMAM dendrimer G4.0 chứng minh hình thành hạt nano hình cầu đồng với đường kính khoảng 4,0 nm, gần giống với kết đo DLS 7,8 ± 2,4nm Kích thước hệ chất mang nano G4.0-PAA (28 nm) tăng gần 3,6 lần so với PAMAM dendrimer G4.0 Kích thước hạt tăng lên nhiều mang thuốc Cisplatin Để khảo sát độ ổn định hệ chất mang, zeta dung dịch chứa hệ chất mang đo điều kiện khác Kết đo zeta hệ chất mang G3.0-PAA (tỉ lệ mol 1:12); G4.0-PAA (tỉ lệ mol 1:8) G4.0-PAA (tỉ lệ mol 1:16) cho thấy zeta hệ chất mang phụ thuộc vào giá trị pH dung dịch Các hệ chất mang tương đối ổn định pH trung tính pH 7,4 Hệ G4.0-PAA tỉ lệ mol 1:16 dễ bị kết tụ pH 5,5 với ζ= 7,3 mV Kết cho thấy không ổn định hạt dẫn đến khả hạt bị kết tụ kích thước hạt tăng nên hạt khơng thể khuếch tán vào hệ thống mạch bạch huyết lại gia tăng việc tích tụ mơi trường khối u pH 5,5 lượng Cisplatin giải phóng tăng làm tăng khả diệt khối u thuốc Ở pH 7,4, G4.0-PAA tỉ lệ mol 1:16 có ζ= -58,6 mV cho thấy ổn định mơi trường plasma nên làm tăng tính tuần hồn thuốc hệ thống mạch máu tăng khả thuốc vận chuyển đến khối u a) b) -13,9 mV c) -14,6 mV a) -58,6 mV c) 19,0 mV b) -19,2 mV 7,3 mV Hình 3.16 Thế zeta hệ chất mang G3.0-PAA (tỉ lệ Hình 3.17 Thế zeta hệ chất mang G4.0-PAA mol 1:12) a pH 7,4; b pH 7,0 c pH 5,5 (tỉ lệ mol 1:16) tại: a pH 7,4; b pH 7,0 c pH 5,5 -23,2 mV c) b) -17,2 mV 14,1 mV 100 Transmittance [%] a) 80 60 40 20 10 pH G3PAA 1:12 G4PAA 1:16 G4PAA 1:8 Hình 3.18 Thế zeta hệ chất mang G4.0-PAA (tỉ Hình 3.19 Độ tan hệ chất mang phụ thuộc lệ mol 1:8) tại: a pH 7,4; b pH 7,0 c pH 5,5 vào pH dung dịch 18 Điểm đục hệ chất mang thay đổi pH dung dịch xác định Hình 3.19 cho thấy, độ hịa tan hệ G3.0-PAA 1:12, G4.0-PAA 1:8 G4.0-PAA 1:16 phụ thuộc pH theo ba vùng pH: vùng pH thấp, vùng kết tủa (vùng trung gian) vùng pH cao Tại vùng trung gian pH 3,5 - 5,5 (hệ G4.0-PAA 1:16), pH 4,0 - 6,0 (hệ G3.0-PAA 1:12, G4.0-PAA 1:8) hệ chất mang bị trung hịa điện tích pH dung dịch pH đẳng điện gây tượng kết tụ hệ chất mang 3.12 Kết bàn luận khả giải phóng thuốc in vitro 3.12.1 Khả giải phóng thuốc phức PAMAM hệ lẻ - Cisplatin (thủy phân) Bảng 3.10 Kết giải phóng thuốc in vitro phức PAMAM dendrimer: G2.5-Cisplatin, G3.5Cisplatin G4.5 - Cisplatin G3.5-Cisplatin G2.5-Cisplatin Thời gian (giờ) 12 24 48 60 72 %Cisplatin pH 5,5 G4.5 - Cisplatin %Cisplatin pH 7,4 pH 5,5 %Cisplatin pH 7,4 pH 5,5 pH 7,4 0 0 0 30,42 1,20 37,18 1,48 43,10 1,70 45,98 1,82 48,18 1,90 51,05 2,02 22,78 0,81 28,35 1,01 31,84 1,14 34,61 1,23 36,29 1,29 36,54 1,30 31,72 1,00 39,04 1,25 44,94 1,41 47,93 1,50 50,24 1,62 53,24 1,67 27,17 0,91 35,12 1,12 38,64 1,16 41,35 1,18 43,76 1,28 45,69 1,37 34,96 1,08 45,52 1,30 47,86 1,04 53,18 1,47 55,07 1,51 55,49 1,54 28,23 0,81 33,12 1,03 43,48 1,20 48,03 1,51 48,91 1,54 49,19 1,54 ANOVA cho thấy hàm lượng Cisplatin giải phóng khỏi hệ chất mang PAMAM dendrimer phụ thuộc vào thời gian, pH khảo sát hệ dendrimer dùng làm chất mang Trong hệ PAMAM dendrimer, lượng Cisplatin giải phóng pH 5,5 cao pH 7,4 khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê Sau 60 lượng % Nhả thuốc Cisplatin Kết phân tích phương sai 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 12 24 36 48 60 72 Thời gian (h) Cisplatin giải phóng khơng có khác biệt pH 5.5 (G2.5cis) pH 7.4 (G2.5cis) pH 5.5 (G3.5cis) đáng kể mặt thống kê pH 7.4 (G3.5cis) pH 5.5 (G4.5cis) pH 7.4 (G4.5cis) Cisplatin giải phóng thuốc mơi trường acid đệm ABS pH 5,5 cao Hình 3.20 Khảo sát giải phóng thuốc Cisplatin in vitro hệ mơi trường đệm PBS pH 7,4 chất mang PAMAM G2.5, PAMAM G3.5 PAMAM G4.5 giải thích môi trường acid môi trường đệm PBS pH 7,4 đệm ABS pH 5,5 nhóm -COO- bề mặt PAMAM dendrimer bị proton hóa chuyển thành dạng -COOH làm giảm độ bền phức PAMAM dendrimer hệ lẻ - Cisplatin Lượng Cisplatin giải phóng 72 khỏi hệ chất mang PAMAM G2.5, PAMAM G3.5 PAMAM G4.5 51,05%, 53,24% 55,49% 3.12.2 Khả giải phóng thuốc 5-FU Cisplatin hệ chất mang hai thuốc G3.5-PNIPAMCispaltin – 5FU 19 Bảng 3.11 Khảo sát khả giải phóng thuốc 5FU hệ chất mang G3.5-PNIPAM-CisPt PNIPAMCisPt % 5-FU giải phóng Thời gian (giờ) G3.5-PNIPAM-CisPt PNIPAM-CisPt pH 5,5 pH 7,4 pH 5,5 pH 7,4 0 0 5,47 0,95 5,84 1,01 14,40 1,19 8,29 1,02 33,29 1,09 18,33 1,01 11,67 1,11 9,86 1,39 33,77 1,02 21,31 1,41 12,92 1,01 10,18 0,99 24 39,60 1,01 26,50 1,14 17,27 1,12 17,19 1,04 48 43,89 1,00 31,98 0,99 24,19 1,02 24,31 0,92 72 47,87 1,06 37,38 1,10 34,53 1,19 32,23 1,04 3.12.3 Khả giải phóng thuốc Cisplatin hệ chất mang PAMAM dendrimer G4.0-PAA Bảng 3.12 Kết giải phóng thuốc Cisplatin hệ chất mang PAMAM dendrimer G4.0-PAA Thời gian So sánh với hệ chất mang PAMAM Cisplatin giải phóng (%) (giờ) pH 5,5 pH 7,4 dendrimer G4.5, lượng Cisplatin giải phóng từ 0 PAMAM dendrimer G4.5 tăng nhanh khoảng 25,17 1,08 11,21 0,69 thời gian 24 (đạt 43,48%) Cisplatin tích lũy 12 34,42 1,51 21,40 0,62 đệm PBS pH 7,4 (49,19 %) gần tương tự 24 40,97 0,92 28,75 0,84 đệm ABS pH 5,5 lúc 72 Trong đó, 32 44,96 0,88 32,93 0,97 Cisplatin giải phóng từ hệ PAMAM dendrimer G4.0- 48 52,02 0,94 42,72 1,29 PAA 28,75% (trong 24h) thấp gần lần so với 55 56,51 0,84 45,46 1,38 hệ chất mang PAMAM dendrimer G4.5 Qua cho 72 59,13 0,96 48,32 1,48 thấy khác biệt cấu trúc nhóm chức bề mặt gây xu hướng nhả thuốc khác PAMAM dendrimer G4.5 PAMAM dendrimer G4.0-PAA 3.13 Động học q trình giải phóng thuốc Cisplatin Mơ hình động học phù hợp với giải phóng thuốc chọn lựa dựa theo tiêu chuẩn AIC (tiêu chuẩn thông tin Akaike) R2hc (R2 hiệu chỉnh) tính tốn phần mềm R Bảng 3.13 Giá trị AIC R2hc theo mơ hình động học hệ mang thuốc Cisplatin pH 5,5 pH 7,4 G2.5-CisPt Bậc pH 5,5 Bậc Higuchi Korsmeyer-Peppas G3.5-CisPt G4.5-CisPt G4.0-PAACisPt R2hc 0,527 0,523 0,465 0,759 AIC 58,397 59,032 60,893 62,509 R2hc 0,638 0,641 0,585 0,875 AIC -15,041 -14,256 -11,745 -22,971 R2hc 0,804 0,801 0,756 0,95 AIC 52,236 52,915 55,397 49,911 R2hc 0,964 0,961 0,9056 0,992 20 Hixson Crowell Bậc Bậc Higuchi pH 7,4 Korsmeyer-Peppas Hixson Crowell AIC -29,183 -28,682 -24,469 -38,636 R2hc 0,601 0,602 0,544 0,840 AIC 1,827 2,561 4,835 -3,071 R2hc 0,493 0,506 0,577 0,892 AIC 54,611 57,251 57,843 54,069 R2hc 0,562 0,5986 0,675 0,943 AIC -19,490 -16,389 -15,440 -32,894 R2hc 0,781 0,787 0,846 0,994 AIC 48,749 51,354 50,776 30,847 R2hc 0,953 0,929 0,948 0,994 AIC -28,110 -25,232 -24,412 -32,765 R2hc 0,539 0,5674 0,643 0,928 AIC -2,398 0,546 1,358 -12,494 Kết thực nghiệm cho thấy mô hình giải phóng thuốc Korsmeyer-Peppas phù hợp để giải thích chế giải phóng thuốc hệ chất mang Đây mơ hình đặc trưng cho q trình giải phóng thuốc từ hệ chất mang polymer 3.14 Dự đốn mơ hình dược động học hệ mang thuốc Hình 3.27 biễu diễn biến thiên nồng độ thuốc (dự đoán) máu theo thời gian, biểu thị tượng trưng cho lượng thuốc đưa vào tuần hồn dạng cịn hoạt tính sau thời gian t Vùng đường cong nồng độ thuốc huyết tương (AUC) phản ánh mức độ phơi nhiễm thực tế thể với thuốc sau dùng liều thuốc biểu thị Hình 3.21 Mơ hình giải phóng thuốc Korsmeyer-Peppas hệ mang mg.giờ/L Kết tính tốn giá trị thuốc Cisplatin pH 5,5 pH 7,4 AUC hệ mang thuốc Cisplatin khác (bảng 3.14) cho thấy hệ chất mang có khả giải phóng thuốc chậm dó làm tăng hiệu lực thuốc, giảm độ độc thuốc làm giảm tác dụng phụ thuốc 21 Bảng 3.14 Các thông số dược động học hệ mang thuốc Cisplatin G4.0-PAA-CisPt G4.5-CisPt G3.5-CisPt G2.5-CisPt pH 7,4 pH 5,5 pH 7,4 pH 5,5 pH 7,4 pH 5,5 pH 7,4 Cmax (ng/mL) 15,92 13,75 19,19 16,46 16,51 14,80 15,86 11,92 AUC (mg.giờ/mL) 1,79 1,47 1,73 1,55 1,65 1,42 1,59 1,14 Tmax (giờ) 48-55 48-55 12 24 12-24 12 12-24 12 20 18 G2.5CisPt pH = 5,5 15 G3.5CisPt pH = 5,5 G4.5CisPt pH = 5,5 10 50 100 150 Thời gian (giờ) Cisplatin plasma (ng/mL) Cisplatin plasma (ng/mL) Cisplatin plasma (ng/mL) pH 5,5 G2.5CisPt pH =7,4 G3.5CisPt pH =7,4 G4.5CisPt pH =7,4 13 200 -2 50 100 150 200 Thời gian (giờ) 15 10 G4.0-PAA-CisPt pH = 5,5 G4.0-PAA-CisPt pH = 7,4 0 40 80 120 thời gian (giờ) 160 Hình 3.22 Nồng độ Cisplatin (dự đốn) plamsa 3.15 Kết bàn luận khả gây độc tế bào 3.15.1 Kết bàn luận khả gây độc tế bào ung thư phổi NCI-H460 hệ chất mang PAMAM dendrimer G4.5 PAMAM dendrimer carboxylate hóa tương thích tế bào, Cisplatin tự có độc tính cao giá trị IC50 1,00 ± 0,11 μg /mL ức chế 50% tăng trưởng tế bào Tuy nhiên, gắn vào hệ chất mang PAMAM dendrimer, độc tính tế bào Cisplatin giảm lần, giá trị IC50 3,23 ± 0,06 μg/mL trì hoạt động kháng tăng sinh đáng kể tế bào ung thư NCI-H460 Bảng 3.15 Độc tính tế bào in vitro Carboxylate PAMAM dendrimer G4.5, Cisplatin phức chất PAMAM G4.5-Cisplatin Mẫu Carboxylate PAMAM dendrimer G4.5 Cisplatin) G4.5-Cisplatin (34,01 Hoạt động tăng sinh (dòng tế bào NCI- (g/mL) H460) 112,25 0,87% phát triển tế bào 100 Cisplatin PAMAM Nồng độ % 1,00 ± 0,11 Ức chế 50% phát triển tế bào 3,23 0,06 Ức chế 50% phát triển tế bào 3.15.2 Kết bàn luận khả gây độc tế bào hệ chất mang G4.0-PAA 22 Bảng 3.16 Độc tính tế bào in vitro PAMAM G4.0-PAA, Cisplatin phức chất PAMAM G4.0-PAACisplatin Mẫu Nồng độ (g/mL) PAMAM G4.0-PAA Cisplatin Phức G4.0-PAA-Cisplatin (40,44 % Cisplatin) 100 Hoạt động tăng sinh (dòng tế bào NCI-H460) 115,40 3,57% phát triển tế bào 0,98 ± 0,09 Ức chế 50% phát triển tế bào 2,88 0,08 Ức chế 50% phát triển tế bào Hình 3.23 cho thấy khả gây độc tế bào PAMAM dendrimer G4.0 cao đáng kể so với PAMAM dendrimer G4.5 PAMAM dendrimer G4.0 với nhóm amine (-NH2) bề mặt có độ gây độc tế bào cao PAMAM dendrimer G4.5 với nhóm carboxylate (-COO-) bề mặt Nhìn chung, PAMAM dendrimer G4.5 khơng gây độc dòng tế bào ung thư vú MCF-7 khoảng nồng độ 30-150 ppm Ngược lại, tỷ lệ ức chế phát triển tế bào MCF-7 tăng tuyến tính với gia tăng nồng độ PAMAM dendrimer G4.0 Ngược lại, PAMAM dendrimer G4.0 nồng độ 92,15 ± 0,15 g/mL gây ức chế 50% phát triển tế bào Hình ảnh dòng tế bào ung thư vú MCF-7 chụp sau 48 ủ với PAMAM dendrimer G4.0 có tế bào màu cam với chấm nhân tế bào màu đỏ khơng có giếng nuôi cấy PAMAM dendrimer G4.0-PAA, PAMAM dendrimer G4.5 nồng độ thử nghiệm (100 g/mL) Hình 3.23 Thử nghiệm in vitro độc tế bào dòng tế bào MCF-7 với chất mang khác (PAMAM G4.0, PAMAM G4.5 G4.0-PAA) (A) Đánh giá khả sống tế bào MCF-7 thêm PAMAM dendrimer G4.0, PAMAM dendrimer G4.5, G4.0-PAA DMEM nồng độ 100 ppm 48 giờ, kính hiển vi huỳnh quang (B) Nhuộm kép (AO/EB) áp dụng để xác định tế bào sống, chết theo chương trình apoptosis sớm (E)/muộn (L) (tương ứng màu xanh màu cam/vàng) hoại tử (N, màu đỏ) Tiến hành thử nghiệm độc tính tế bào nguyên bào sợi cho số hệ chất mang nồng độ 100ppm để đánh giá mức độ tương hợp sinh học PAMAM dendrimer G4.0-PAA dùng làm hệ mang thuốc Trong đầu tiên, tất hệ chất mang dường không gây độc nguyên bào sợi (Hình 3.24) Tuy nhiên, sau 48 nuôi cấy môi trường có chứa chất mang, PAMAM dendrimer G4.5 PAMAM dendrimer G4.0-PAA nồng độ 100 ppm cho kết tương tự thử nghiệm dòng tế bào MCF-7 Dendrimer cation (PAMAM dendrimer G4.0) thể độc tính dendrimer anion (PAMAM dendrimer G4.5 G4.0-PAA không gây độc nguyên bào sợi Khi có mặt PAMAM 23 dendrimer G4.0, tỉ lệ sống (%) nguyên bào sợi giảm mạnh 9,32 ± 1,07% tỷ lệ chết 100% ghi nhận vào thời điểm 168 Ngược lại, nguyên bào sợi nuôi cấy môi trường chứa G4.0-PAA PAMAM dendrimer G4.5 trì tỉ lệ sống 100% Hình 3.24 Tỷ lệ sống sót nguyên bào sợi người xử lý với hệ mang thuốc PAMAM dendrimer G4.0, PAMAM dendrimer G4.5, PAMAM dendrimer G4.0-PAA, Camptothecin (kiểm soát dương tính) PBS 1X (kiểm sốt âm tính) nồng độ (100 ppm) Quá trình chết tế bào theo chương trình (apoptosis) hoại tử (necrosis) sau xử lý với hệ mang thuốc khảo sát dựa phương pháp nhuộm kép AO/EB Hình ảnh quan sát kính hiển vi đồng tiêu huỳnh quang (hình 3.30) nhân màu vàng-xanh đỏ cam cho thấy PAMAM dendrimer G4.0 gây chết lượng lớn tế bào theo chương trình (apoptosis) Mức độ apoptosis PAMAM dendrimer G4.0 gây tương tự so với kiểm soát dương tính Các nguyên bào sợi xử lý với PAMAM dendrimer G4.0 có dạng hình cọc sợi ngắn hơn, mật độ thấp độ bám dính thấp so với tế bào ủ với kiểm soát âm tính Hơn nữa, kết nối nguyên bào sợi biến có mặt PAMAM dendrimer cation G4.0 môi trường nuôi cấy Mặt khác, nguyên bào sợi xử lý với PAMAM dendrimer G4.5 PAMAM dendrimer G4.0-PAA có hình thái đồng hiển thị huỳnh quang màu xanh tương tự kiểm sốt âm tính Những tế bào có hình dạng cọc sợi dài ổn định Các nguyên bào sợi cho thấy độ bám dính tốt kết nối tốt Như vậy, PAMAM dendrimer cation G4.0 gây hại cho tế bào MCF7 nguyên bào sợi Việc biến tính PAMAM dendrimer G4.0 với PAA làm giảm đáng kể độc tính PAMAM dendrimer G4.0 PAMAM dendrimer G4.0-PAA không gây apoptosis tế bào MCF-7 ác tế bào thường Đặc điểm cho thấy PAMAM dendrimer G4.0-PAA có ưu điểm vượt trội so với PAMAM dendrimer G4.0 PAMAM dendrimer G4.5 ứng dụng làm chất mang thuốc điều trị ung thư 24 Hình 3.25 Hình ảnh huỳnh quang thu từ kính hiển vi đồng tiêu huỳnh quang - nguyên bào sợi nhuộm acridine cam (AO) ethidium bromide (EB) 3.15.3 Kết bàn luận khả gây độc tế bào hệ chất mang PAMAM dendrimer G3.5PNIPAM mang hai thuốc cispaltin 5-FU Bảng 3.17 Tỷ lệ (%) gây độc tế bào ung thư vú MCF-7 mẫu Mẫu Nồng độ thử G3.5-NIPAM-5FU G3.5-NIPAM-CisPt-5FU Tỉ lệ (%) gây độc tế bào Lần Lần Lần TB ± ĐLC 100 µg/mL 68,17 69,57 68,41 68,72 ± 0,75 100 µg/mL 78,78 79,57 76,59 78,32 ± 1,55 PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM-5-FU có khả gây độc cho tế bào tương đối cao, khoảng 68,72% Không thế, việc mang đồng thời hai thuốc phức PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM-cisPt25 5FU giúp cho hoạt lực ức chế tế bào tăng mạnh (78,78%) lượng Cisplatin PAMAM cao (35,22%) Điều chứng tỏ phức chất PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM-cisPt-5FU có hoạt tính chống ung thư hiệu Bảng 3.18 Độc tính tế bào in vitro PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM, 5-FU PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM-CisPt-5FU Mẫu Hoạt động tăng sinh Nồng độ (g/mL) (dòng tế bào NCI-H460) PAMAM dendrimer G3.5 100 110,22 0,85% phát triển tế bào PAMAM G3.5-PNIPAM 100 115,22 0,98% phát triển tế bào 5-FU G3.5-PNIPAM-CisPt-5FU 2,6 ± 0,31 Ức chế 50% phát triển tế bào 1,625 ± 0,419 Ức chế 50% phát triển tế bào KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu hoàn thành nội dung luận án, rút kết luận sau: - Đã tổng hợp thành công dendrimer PAMAM từ hệ G-0.5 đến hệ G4.5 Sản phẩm PAMAM dendrimer hệ từ G-0.5 đến G4.5 xác định cấu trúc phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR tính tốn khối lượng phân tử sở liệu phổ 1H-NMR - Đã tổng hợp thành công phức PAMAM dendrimer G3.0-Cisplatin (9,63% Cisplatin) PAMAM dendrimer G4.0-Cisplatin (16,95% Cisplatin) - Đã tổng hợp thành công phức PAMAM dendrimer G2.5-Cisplatin (28,99% Cisplatin), PAMAM dendrimer G3.5-Cisplatin (30,23% Cisplatin) PAMAM dendrimer G4.5-Cisplatin (31,11% Cisplatin) Kết phân tích hàm lượng Pt ICP-MS cho thấy, phương pháp tổng hợp có hỗ trợ siêu âm hàm lượng Cisplatin phức PAMAM dendrimer G2.5-Cisplatin (31,82% Cisplatin), PAMAM dendrimer G3.5-Cisplatin (33,01% Cisplatin) PAMAM dendrimer G4.5-Cisplatin (34,03% Cisplatin) cao so với phương pháp tổng hợp không sử dụng siêu âm Phương pháp tổng hợp có thủy phân Cisplatin AgNO3 trước thực phản ứng tạo phức với nhóm carboxylate bề mặt PAMAM dendrimer hệ lẻ làm tăng đáng kể hàm lượng Pt sản phẩm so với phương pháp không thủy phân Cisplatin Sản phẩm dạng bột màu vàng nhạt (4) Đã biến tính thành cơng PAMAM dendrimer G3.0 với Poly N-isopropylacrylamide (PNIPAMCOOH) với tỉ lệ mol khác tổng hợp thành cơng hệ chất mang G3.5-PNIPAM Tính tốn số nhóm PNIPAM gắn vào PAMAM dendrimer G3.0 tính KPLPT sản phẩm dựa phổ 1H-NMR Hệ chất mang G3.0-PNIPAM cho thấy khả mang đồng thời hai thuốc chống ung thư 5-FU (20.43%) Cisplatin (35,22%) áp dụng để mang loại thuốc khác (5) Đã biến tính thành cơng PAMAM dendrimer G3.0 G4.0 với acid poly acrylic (PAA) với tỉ lệ mol khác Tính tốn số nhóm PAA gắn vào PAMAM dendrimer tính KPLT sản phẩm dựa phổ 1H-NMR Hệ chất mang G4.0-PAA với số nhóm PAA gắn lên bề mặt PAMAM dendrimer G4.0 15 nhóm thể khả mang thuốc Cisplatin tốt (40,44% Cisplatin) Phức G4.0-PAA-Cisplatin có độc tố giảm so với Cisplatin tự (có IC50 cao gấp lần Cisplatin tự do) thử nghiệm dòng tế bào ung thư phổi NCI-H460 thể hoạt tính ức chế hiệu phát triển tế bào ung thư thể khả nhả thuốc tốt môi trường acid pH 5,5 26 (6) Kết chụp TEM đo DLS cho thấy hệ chất mang tổng hợp có kích nano phân bố đồng dung dịch (7) Các hệ chất mang carboxylate PAMAM dendrimer G2.5, G3,5, G4.5, G3.5-PNIPAM G4PAA cho thấy khả nhả thuốc chậm ổn định điều kiện in vitro (8) Các hệ chất mang phức PAMAM dendrimer G3.5-Cisplatin, G3.5-PNIPAM-Cisplatin-5FU G4.0-PAA-Cisplatin làm giảm độc tính thuốc chống ung thư Cisplatin thể hoạt tính ức chế hiệu phát triển tế bào ung thư KIẾN NGHỊ Khảo sát hoạt tính hệ Carboxylate PAMAM G3.5-PNIPAM, G4.0-PAA mang thuốc chống ung thư Cisplatin thể chuột mang khối u ung thư phổi Khảo sát khả gây độc chúng số dòng tế bào ung thư khác in vitro lẫn in vivo, đặc biệt dòng tế bào ung thư kháng Cisplatin Khảo sát in vivo dược động học hệ mang thuốc PAMAM dendrimer G4.0-PAA-Cisplatin Khảo sát khả mang đồng thời thuốc chống ung thư chứa Platin 5-FU hệ chất mang PAMAM dendrimer G3.0-PNIPAM, PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM, PAMAM dendrimer G4.0PNIPAM PAMAM dendrimer G4.5-PNIPAM Đánh giá ảnh hưởng pH dung dịch lên khả gắn nhóm PAA vào PAMAM dendrimer G4.0 NHỮNG ĐĨNG GĨP MỚI CỦA LUẬN ÁN - Đã tổng hợp thành công phức PAMAM dendrimer G3.0-Cisplatin PAMAM dendrimer G4.0Cisplatin - Đã tổng hợp thành công phức PAMAM dendrimer G2.5-Cisplatin, PAMAM dendrimer G3.5Cisplatin PAMAM dendrimer G4.5-Cisplatin có khơng có sử dụng sóng siêu âm Phương pháp tổng hợp có thủy phân Cisplatin AgNO3 trước thực phản ứng tạo phức với nhóm carboxylate bề mặt PAMAM dendrimer hệ lẻ kết hợp với hỗ trợ siêu âmlàm tăng đáng kể hàm lượng Pt sản phẩm so với phương pháp không thủy phân Cisplatin - Đã biến tính thành cơng PAMAM dendrimer G3.0 với Poly N-isopropylacrylamide (PNIPAMCOOH) với tỉ lệ mol khác tổng hợp thành công hệ chất mang G3.5-PNIPAM Đã tính tốn số nhóm PNIPAM gắn vào PAMAM dendrimer G3.0 tính KPLPT sản phẩm dựa phổ 1H-NMR Bước đầu thử nghiệm cho thấy hệ chất mang G3.5-PNIPAM cho thấy khả mang đồng thời hai thuốc chống ung thư 5-FU (20.43%) Cisplatin (35,22%) áp dụng để mang loại thuốc khác - Đã biến tính thành cơng PAMAM dendrimer G3.0 G4.0 với acid poly acrylic (PAA) với tỉ lệ mol khác Đã tính tốn số nhóm PAA gắn vào PAMAM dendrimer tính KPLT sản phẩm dựa phổ 1H-NMR Hệ chất mang G4.0-PAA với số nhóm PAA gắn lên bề mặt PAMAM dendrimer G4.0 15 nhóm thể khả mang thuốc Cisplatin tốt (40,44%) Phức G4.0-PAA-Cisplatin có độc tố giảm so với Cisplatin tự (có IC50 cao gấp lần Cisplatin tự do) thử nghiệm dòng tế bào ung thư phổi NCI-H460 thể hoạt tính ức chế hiệu phát triển tế bào ung thư thể khả nhả thuốc tốt môi trường acid pH 5,5 - Các hệ chất mang carboxylate PAMAM dendrimer G2.5, G3,5, G4.5, G3.5-PNIPAM G4PAA cho thấy khả nhả thuốc chậm ổn định điều kiện in vitro 27 - Các hệ chất mang phức PAMAM dendrimer G3.5-Cisplatin, G3.5-PNIPAM-Cisplatin-5FU G4.0-PAA-Cisplatin làm giảm độc tính thuốc chống ung thư Cisplatin thể hoạt tính ức chế hiệu phát triển tế bào ung thư DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH Ngoc Hoa Nguyen, Le Hang Dang, Dang Nam Nguyen, Cuu Khoa Nguyen, Ngoc Quyen Tran, Polyacrylic-conjugated polyamidoamine G4.0 dendrimer as a potetial nanocarrier for effectively delivery of Cisplatin, Bulletin of materials science (chấp nhận đăng: Nov 2020) Phung Ngan Le, Ngoc Hoa Nguyen, Cuu Khoa Nguyen, Ngoc Quyen Tran, Smart dendrimer-based nanogel for enhancing 5-fluorouracil loading efficiency against MCF7 cancer cell growth, Bulletin of Materials Science 39(6):1493-1500, 2016 Hoang Nguyen, Ngoc Hoa Nguyen, Ngoc Quyen Tran, Cuu Khoa Nguyen, Improved loading method for Cisplatin in dendrimer carriers and behavior of the complex nanoparticles against NCI-H460 lung cancer cell, Int J Nanotechnology, Vol 15, N0 6, june 2015, pp 4106-4110 (5), 2015 Ngoc Quyen Tran, Ngoc Hoa Nguyen, Thị Bich Tram Nguyen, Nguyen Cuu Khoa, Positive effect of dendrimers nanocarriers on reducing cytotoxicity of anticancer drugs, Tạp chí Hóa học, 51(4AB), pp 270275, 2013 28 ... khả mang thuốc Cisplatin hệ chất mang Mục tiêu nghiên cứu luận án Tổng hợp hệ vật liệu nano mang thuốc dendrimer (PAMAM) biến tính với PNIPAM PAA tương hợp sinh học nhằm cải thiện hiệu mang thuốc. .. nhóm nghiên cứu Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng thực hiện, nội dung nghiên cứu luận án này, tiếp tục cải thiện khả mang thuốc Cisplatin PAMAM dendrimer sở tăng cường nhóm chức bề mặt dendrimer. .. 1,29 Khả mang thuốc Cisplatin (không thủy phân) hệ chất mang PAMAM dendrimer tóm tắt bảng 3.7 Kết cho thấy hệ chất mang không mang nhiều thuốc Cisplatin so với nghiên cứu trước Tuy nhiên, tiến