Đang tải... (xem toàn văn)
Mục tiêu nghiên cứu của luận án nhằm xác định hàm lượng và thành phần Lipit, Axit béo và dẫn xuất Tocopherol; khảo sát mối quan hệ giữa các Axit béo và các dẫn xuất Tocopherol trong dầu hạt thực vật; Phân lập, tinh chế và xác định cấu trúc Axit béo có hoạt tính. Tạo chế phẩm từ Axit 2 béo có hoạt tính; đánh giá độ an toàn và thăm dò một số tác dụng sinh học của chế phẩm đó trên động vật thực nghiệm.
Bộ GIáO DụC Và ĐàO TạO Viện khoa học công nghệ việt nam VIệN HOá HọC CáC HợP CHấT ThiÊN NHIÊN ON LAN PHNG Nghiên cứu HOá HọC V HO¹T TÝNH SINH HäC MéT Sè DÉN XUÊT TOCOPHEROL Vμ AXIT BÐO Cã NGUåN GèC Tõ THI£N NHI£N Chuyªn ngμnh: Hoá học hợp chất thiên nhiên MÃ số: 62.44.27.02 tóm tắt luận án tiến sĩ hóa học h nội - 2010 Cơng trình hồn thành tại: -Phịng Hóa sinh biển - Viện Hoá học Hợp chất thiên nhiên – Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam -Phịng thí nghiệm Hố học- Viện nghiên cứu Hố – Lý chất béo, Muenster, CHLB Đức Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Phạm Quốc Long TS Bertrand Matthaus Phản biện 1: GS.TSKH Phan Tống Sơn Trường Đại học Khoa học tự nhiên- Đại học Quốc Gia Hà Nội Phản biện 2: GS.TS Phạm Thanh Kỳ Trường Đại học Dược Hà Nội Phản biện 3: GS.TS Lã Đình Mỡi Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp nhà nước họp tại: Hội trường Viện Hoá học Hợp chất thiên nhiên – Viện KH & CN Việt Nam vào hồi ngày tháng năm 2010 Có thể tìm đọc luận án : - Thư viện quốc gia - Thư viện Viện Hoá học Hợp chất thiên nhiên , Viện Khoa học công nghệ Việt Nam DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ TRONG KHN KHỔ LUẬN ÁN Đồn Lan Phương, Phạm Quốc Long, Bertrand Mathaus, (2009), “Chemical and Biological Studies of Seed of Vietnames Citrus Plant”, Traditional and Alternative Medicine Research & Policy Perspectives, DAYA publishing House, ISBN 978-81-7035-614-1, pp.270-280 Đoàn Lan Phương, Phạm Quốc Long, Lành Thị Ngọc, Bertrand Matthaus, (2007), “Nghiên cứu đa biến mối tương quan tocopherol thành phần axit béo dầu thực vật”, Tạp chí khoa học cơng nghệ , tập 45, số 1B, trang 252-258 Đoàn Lan Phương, Phạm Quốc Long, Bertrand Matthaus and Klaus Vosmann, (2006), “Epoxy Acids in Vietnamese Seed Oil: Hibiscus Sabadariffa Lin and Chrysanthemum Coronarium L.”, International Symposium on Herbal Medicines, Phytopharmaceuticals& other Natural Products, Printed by Tharanjee Prints- 2804773, ISBN: 955-9244-30-2, pp 238-245 Đoàn Lan Phương, L¦ưu Văn Huyền, Phạm Quốc Long, Bertrand Matthaus, (2005), “Các axit béo phân loại thực vật học”, Tạp chí khoa học cơng nghệ, tập 43, số 5, tr.101-109 Phạm Quốc Long, Đoàn Lan Phương, Bertrand Matthaus, Klaus Vosmann, (2004), “Lipid composition and their relationship in oilseeds of Vietnam”, Advances in Natural Sciences, Vol.5, No.2, pp.151-164 I GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Đặt vấn đề Nước ta thuộc khu vực nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm nên hệ thực vật phong phú đa dạng số lượng chất lượng Trong số 10400 loài thực vật bậc cao phát có khoảng 564 lồi có dầu Chúng có vai trị quan trọng tài nguyên thực vật nước ta sống cộng đồng, không nguyên liệu thiết yếu cho công nghiệp chế biến xuất mà nhiều dầu hạt thực vật sử dụng dân gian thuốc cổ truyền để điều trị bệnh viêm nhiễm, chống lão hoá số bệnh hiểm nghèo Trong số dầu hạt thực vật chủ lực nhà nước đầu tư áp dụng cơng nghệ tiên tiến để sản xuất nghiên cứu chuyên sâu khoa học có hệ thống lipit axit béo từ thiên nhiên nước ta gần bỏ ngỏ Từ năm 1980 có số thống kê số liệu 500 lồi thực vật có dầu, phổ biến 51 lồi Tuy nhiên số liệu cịn chưa tập trung điều kiện máy móc phân tích nên việc nghiên cứu thành phần, hàm lượng tocopherol axit béo có hoạt tính sinh học chưa quan tâm đến Hiện nghiên cứu liên quan đến chất béo ngày phát triển, lan rộng đối tượng lĩnh vực nghiên cứu liên quan Tại Mỹ Đức xây dựng sở liệu mạng cho thành phần dầu từ loài hạt thực vật khác số liệu liên tục cập nhật hàng năm Tuy nhiên, chưa có số liệu thành phần dầu hạt thực vật Việt Nam Đề tài “Nghiên cứu hố học hoạt tính sinh học số dẫn xuất tocopherol axit béo có nguồn gốc từ thiên nhiên” nhằm góp phần bổ sung vào sơ liệu mạng Quốc tế thành phần dầu hạt thực vật Việt Nam đưa thông tin lý giải tác dụng chữa bệnh chúng y học dân gian, định hướng sử dụng chúng Đối tượng nghiên cứu nhiệm vụ luận án Đối tượng nghiên cứu: 28 lồi thực vật có hạt Việt Nam thuộc họ: Brassicaceae, Cucurbitaceae, Sapindaceae, Rutaceae Malvaceae Nhiệm vụ luận án : - Xác định hàm lượng thành phần lipit, axit béo dẫn xuất tocopherol có dầu hạt 28 loài thực vật Việt Nam thuộc họ: Brassicaeae, Cucurbitaceae, Sapindaceae, Rutaceae Malvaceae Phân tích, nhận dạng chứng minh số axit béo có cấu trúc đặc biệt - Khảo sát mối quan hệ axit béo dẫn xuất tocopherol dầu hạt thực vật Việt Nam - Phân lập, tinh chế xác định cấu trúc axit béo có hoạt tính Tạo chế phẩm từ axit béo có hoạt tính; đánh giá độ an tồn thăm dị số tác dụng sinh học chế phẩm động vật thực nghiệm (in vivo) Những đóng góp ý nghĩa thực tiễn luận án 3.1 Lần nghiên cứu hệ thống thành phần, hàm lượng tocopherol axit béo 28 lồi có dầu, thuộc họ thực vật: họ Cải (Brasicaceae), Bí (Cucurbitaceae), Bồ hịn (Sapindaceae), Cam (Rutaceae) họ Bơng (Malvaceae) Các axit sterculic, malvalic, vernolic axit coronanic lần đựợc tìm thấy hạt dâm bụt giấm Hibiscus sabdraffi L Việt Nam 3.2 Lần sử dụng phương pháp phân tích thành phần (PCA) để chứng minh được: mối tương quan di truyền axit béo C18:3 với γ-tocopherol, axit C18:2 với α-tocopherol, khẳng định hạt thực vật có hàm lượng PUFA cao hoạt tính chống oxy hóa chúng cao dầu hạt khác Và dầu hạt thuộc bốn họ Cải, Cam, Bí, Bồ hịn có axit béo đặc trưng "fingerprinter” C22:1 (họ cải), C16:0 C18:3 (họ cam), C18:2 C18:3 liên hợp (họ bí), C18:1 (họ bồ hịn) Có thể sử dụng axit béo yếu tố hoá học phân loại thực vật (chemotaxonomy) 3.3 Tìm điều kiện tối ưu cho phản ứng khử hóa axit α-linolenic C18:3(9,12,15) thành dẫn chất thiết yếu Lần khảo sát hoạt tính chống oxy hóa dầu hạt 10 loài thực vật thuộc chi Citrus 3.4 Tạo chế phẩm OF27 từ số axit béo đa nối đôi thiết yếu thuộc họ n-6 (như GLA, ARA) n-3 (như ALA,EPA, DHA), khảo sát độ an toàn có tác dụng làm tăng lượng thần kinh, tăng sinh tổng hợp protein, tăng cường đáp ứng miễn dịch, ức chế đột biến giảm tần suất xuất khối u da chế phẩm OF27 Kết mở triển vọng ứng dụng chế phẩm OF27 thực phẩm chức sống Bố cục luận án Luận án gồm 149 trang với 36 bảng số liệu, 28 hình, với 153 tài liệu tham khảo 55 trang phụ lục Bố cục luận án gồm: Mở đầu (2 trang), Chương 1: Tổng quan tài liệu (37 trang), Chương 2: Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu (9 trang), Chương 3: Thực nghiệm (19 trang), Chương 4: Kết thảo luận (62 trang), Kết luận trang, Danh mục công trình cơng bố liên quan đến luận án (1 trang), Tài liệu tham khảo (17trang) II NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN MỞ ĐẦU Phần mở đầu đề cập đến ý nghĩa khoa học, tính thực tiễn, đối tượng mục đích nghiên cứu luận án Chương 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU Phần tổng hợp tài liệu về: - Hóa học, hoạt tính sinh học ứng dụng dẫn xuất tocopherol - Khái niệm phân loại axit béo, hoạt tính sinh học axit béo đa nối đôi tác động chúng vào trình bệnh lý - Oxy hóa sinh học tác động chất chống oxy hóa Chương NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu Nguyên liệu mẫu hạt thực vật 28 loài, TS Trần Ngọc Ninh, Viện Sinh Thái Tài Nguyên giám định tên khoa học lưu giữ tiêu Viện Hóa học Hợp chất thiên nhiên 2.2 Phương pháp chiết xuất phân tích lipid, tocopherol axit béo Theo tiêu chuẩn ISO, sử dụng thiết bị phân tích sắc ký lỏng cao áp (HPLC) sắc ký khí (GC) 2.3 Phương pháp phân lập axit béo Sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột thường cột pha đảo Thiết bị ghi phổ 1H 13C-NMR: máy Bruker 500MHz AVANCE, chuẩn nội TMS, dung môi CDCl3 2.4 Phương pháp nhận dạng cấu trúc axit béo Được xác định dựa việc phân tích số liệu phổ khối lượng, phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều, chiều so sánh với kết công bố 2.5 Phương pháp sử dụng thành phần axit béo chemotaxonomy khảo sát mối tương quan chúng với tocopherol Sử dụng phương pháp PCA (phân tích thành phần chủ yếu) 2.6 Phương pháp nghiên cứu điều kiện tối ưu cho phản ứng khử hóa nối đơi axit C18:3 Δ9,12,15 Sử dụng mơ hình toán qui hoạch thực nghiệm trực giao bậc 2.7 Các phương pháp nghiên cứu hoạt tính sinh học - Hoạt tính chống oxy hóa in vitro hệ DPPH - Phương pháp xác định độc tính cấp,bán cấp tác dụng chế phẩm OF27 tăng lực tâm thần kinh thần kinh trung ương, đến trình tổng hợp protein động vật, tăng hệ miễn dịch, làm giảm tần suất xuất khối u da Các thí nghiệm dược lý thực Học Viện Quân Y, theo quy định WHO, Bộ Y tế hiệu lực an toàn thuốc nghiên cứu thuốc y học cổ truyền dân tộc Chương THỰC NGHIỆM 3.1 Khảo sát hàm lượng dầu béo thành phần tocopherol Trình bày cụ thể phương pháp khảo sát số liệu khảo sát hàm lượng dầu béo, thành phần hàm lượng tocopherol 3.2 Khảo sát thành phần- hàm lượng axit béo dầu hạt thực vật Trình bày cụ thể phương pháp số liệu khảo sát thành phần- hàm lượng axit béo dầu hạt thực vật 3.3 Nhận dạng số axit béo có cấu trúc đặc biệt dầu hạt Hibiscus saldariffa L - Các axit cyclopropenoic (CPEFA) nhận dạng sau dầu béo hạt Hibiscus saldariffa L dạng metyl este phản ứng với AgNO3/MeOH đem phân tích thiết bị GC Kết thu so sánh với chất chuẩn phổ GC CPEFA trước phản ứng với AgNO3/MeOH - Các axit epoxy nhận dạng GC phản ứng methyl hóa mơi trường HCl/MeOH Kết thu so sánh với chất chuẩn phổ GC methyl ester axit béo oxy mạch vòng trước phản ứng với HCl/MeOH 3.4 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa in vitro hệ DPPH dầu hạt thực vật thuộc chi Citrus Nêu cụ thể cách tiến hành số liệu đo sau khảo sát hoạt tính chống oxy hố in vitro hệ DPPH dầu hạt thực vật thuộc chi Citrus (hình 3.1) Hình 3.1: Đồ thị biểu diễn hoạt tính chống oxy hố dịch chiết methanol mẫu dầu quất nồng độ khác 3.5 Phân lập nhận dạng axit C18:3Δ9,12,15 từ dầu hạt Citrus japonica Thunb Miêu tả trình phân lập axit C18:3Δ9,12,15 từ dầu hạt Citrus japonica Thunb theo sơ đồ trình bầy hình 3.2 số liệu phổ thực nghiệm Nguyên liệu hạt quất kg -Xay nhỏ -Chiết n-hexan Lipit tổng 406g - Metyl hoá - Phân tích GC Metyl este FA (338 g MFA) (hàm lượng 18:3(9,12,15): 7,32% -Bổ sung axeton -Kết tinh LiOH Thu 219,21g PUFA (hàm lương C18:3(9,12,15): 18.39% -HPLC (C18) -Graidien MeOH/H2O: 96/4 Thu 2,6g C18:3 (9,12,15) -Lấy phân đoạn 92%(GC) Phân tích cấu trúc GC-MS, NRM Hình 3.2: Sơ đồ phân lập axit C18:3 Δ9,12,15 từ dầu hạt quất Citrus Japonica Thunb 3.6 Phản ứng khử hóa nối đôi axit C18:3Δ9,12,15 Cách tiến hành số liệu phản ứng khử hóa nối đơi axit C18:3Δ9,12,15 3.7 Phương pháp nghiên cứu chế phẩm OF27 Phần trình bầy cụ thể cách tạo chế phẩm OF27, nghiên cứu độ an toàn tác dụng sinh học chế phẩm OF27 động vật thực nghiệm (quá trình sinh tổng hợp protein, tăng lực tâm thần kinh, tăng đáp ứng miễn dịch, ức chế hình thành khối u) Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Khảo sát hàm lượng dầu béo thành phần tocopherol Kết phân tích cho thấy hàm lượng dầu béo hạt họ Brassicaceae, Cucurbitacaea Rutaceae tương đối đồng cao, trung bình 35% họ Sapindaceae lại có khác rõ rệt loài: Litchi chinensis Sonn: 1.4%, Dimocarpus longan Lour 4.9%, Aesculus sinensis Hort 18.3% ba lồi cịn lại 30% Nhóm chất hay sử dụng chất chống oxy hóa tự nhiên tocopheerol có mặt trong 28 dầu hạt với hàm lượng tocols tổng thay đổi khoảng rộng từ 2,56mg/100g đến 936,1mg/100g tồn chủ yếu hai dạng α-tocopherol, γtocopherol (bảng 4.2) Hàm lượng tocols tổng lồi thuộc họ Spindaceae có khác biệt lớn hạt vải Litchi chinensis cao nhất: 936,1mg/100g, mắc kẹn Aesculus sinensis: 141,1mg/100g, ngược lại hạt chơm chơm Nephelium lappaceum có 2.56mg/100g hạt mác rạc Delavaya toxocarpa là: 3.4mg/100g Dạng α-tocopherol chiếm ưu (90% so với dạng tocols tổng) dầu hạt thuộc chi Citrus Sự đa dạng khác biệt hàm lượng tocopherol tocotrienol có dầu béo mẫu hạt thực vật Việt nam thể dầu hạt quýt Sài Gòn Citrus nobilis var microcarpa Hassk quýt Thái Lan Citrus nobinis var chryoscarpa Lamk dạng γtocopherol khơng xuất thay vào chủ yếu dạng α-tocopherol α-tocotrienol Dạng γ-tocopherol có mặt loài thuộc họ Brassicaceae nhiều (từ 24,0mg/100g đến 51,6mg/100g), họ lại 10mg/100g Trong dầu hạt mướp đắng Momordica charantia hai dạng α-tocopherol γ-tocopherol có mặt với hàm lượng cao: 39,8mg/100g 49,2mg/g Hàm lượng dầu béo hạt vải L.chinensis thấp hàm lượng tocols cao (276,8mg/100g) với thành phần phong phú: α-tocopherol: 34,5mg/100g; αtocotrienol: 21,3mg/100g; γ-tocopherol: 8,8mg /100g γ-tocotrienol: 19,7mg/100g Đặc biệt dạng δ-tocotrienol thấy dầu hạt vải với hàm lượng lớn: 181,5mg/100g; dạng δ-tocopherol hạt dưa chuột leo Cucumis sativus: 91,3mg/100g 4.2 Khảo sát thành phần hàm lượng axit béo Ngoài axit béo phổ biến thường gặp như: axit béo no (axit palmitic C16:0, axit stearic C18:0), axit béo không no (axit oleic C18:1, axit linoneic C18:2), số dạng axit béo bất thường như: axit béo đa nối đôi liên hợp C18:3, axit cyclopropenoic, axit epoxy tìm loài (bảng 4.2) Đã phát khác thường thành phần 28 dầu hạt có mặt axit arachidic (20:0) hạt chôm chôm Nephelium lappaceum với hàm lượng lớn 33,24%, dầu hạt khác axit có mặt khoảng từ 0,07 đến 9,65%, đa phần 1% Hàm lượng axit palmitic khoảng từ 2,0% (Brassica chinensis) đến 29,21% (Citrus grandis), cao chi Citrus Axit stearic có mặt trung bình 20% dầu hạt họ Cucubitaceae, bốn họ lại 2% Tổng số axit béo khơng no có giá trị cao hai họ Brassicaceae Rutaceae 70% Chỉ có lồi hạt họ Brassicaceae có hàm lượng tổng số axit béo no thấp 10% Axit béo đa nối đôi liên hợp C18:3(9c,11t,13t) có lượng lớn dầu hạt mướp đắng Momordica charantia (60,60%) dầu hạt gấc Momordica conchinchinensis (58,61%) thuộc họ Cucurbitaceae Axit oleic 18:1 thấp (3,72%-7,92%) hạt mướp đắng, gấc, song hạt cịn lại có hàm lượng cao (16,36%-52,39%) chẳng hạt hạt bồ hịn (52,39%) Axit gadoleic C20:1 có mặt lượng lớn hạt hai loài: hạt mác rạc (20,57%), hạt bồ hịn (37,49%), sáu lồi thuộc họ Brasicaceae có lượng trung bình (8%) hai mươi lồi cịn lại chứa hàm lượng ≤1% Tổng hợp số liệu phân tích thành phần axit béo 28 loại hạt thực vật Việt nam cho biết hàm lượng axit béo no cao từ 46,98-51,31% thuộc hạt: nhãn, vải, chôm chôm Mẫu hạt có hàm lượng axit béo nối đơi chiếm từ 73,93%-77,55% hạt mác rạc bồ hịn Các mẫu hạt gấc, mướp đắng 10 lồi hạt chi Citrus có hàm lượng axit béo đa nối đôi cao tới 65,61-77,89%, mẫu hạt khác khoảng 3,19% 21,13% Việc có mặt axit béo không no với hàm lượng cao nói lên giá trị hoạt tính sinh học dầu nhân loại hạt đặc biệt Y, dược cơng nghiệp thực phẩm, axit béo đa nối đơi có hoạt tính sinh học giá trị đặc dụng dầu béo loại hạt 4.3.Ứng dụng axit béo chemotaxonomy 4.3.1 Sử dụng phương pháp phân tích thành phần (PCA): Trong phân loại thực vật học người ta thường sử dụng nhiều dấu hiệu khác hình thái sinh lí- sinh hố, sinh thái tập tính học địa lí học để bổ sung hỗ trợ cho Ở Việt Nam, việc sử dụng thành phần axit béo có mặt dầu hạt thực vật yếu tố hoá học để giúp cho phân loại thực vật (chemotaxonomy) chưa có tài liệu cơng bố Phương pháp phân tích thành phần (Principal component anlysis-PCA) để xử lý hồi quy đa biến biến có quan hệ tuyến tính với thành phần PCn (n- số thành phần vận dụng vào số liệu thành phần, hàm lượng axit béo 27 mẫu dầu họ thực vật (hình 4.1) Trong nhóm khác biệt phân biệt rõ ràng thơng Ỹu tè qua vùng phân bố PCA Các nhóm tương ứng với số thứ tự 1.5 34 mẫu bảng 4.2 nhóm: (a) mẫu 1.0 51 10 0.5 Hä Bracitaceae -1.5 -1.0 -0.5 1416 0.0 0.0 -0.5 0.5 119 1.0 34 27 26 35 31 28 15 -1.0 Hä Sapindaceae 13 12 17 -1.5 Hä Cucubicateae YÕu tè 1, 2, 3, 4, 5, (mầu xanh dương), (b) mẫu 7, 8, 9, 10,11 (mầu xanh cây), (c) mẫu 12, 13, 14, 15, 16, 17 (mầu đỏ), (d) mẫu 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, Hä Rutaceae 26, 27 (mầu đen) Trên giản đồ loài -2.0 -2.5 thuộc họ tập trung giạt phía, có phân bố khác rõ ràng Hình 4.1: Giản đồ PCA (PC1-PC2) với số liệu đầu vào 10 thành phần axit béo 27 mẫu hạt thực vật 15 Bảng 4.4: Ma trận thực nghiệm phản ứng N 10 11 12 13 14 15 x0 + + + + + + + + + + + + + + + x1 + + + + 1,215 -1,215 0 0 x2 x3 + + + + + + + + 0 0 1,215 -1,215 0 1,215 -1,215 0 x1x2 x1x3 X2x3 + + + + + + + + + + + + 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 x’12 0,27 0,27 0,27 0,27 0,27 0,27 0,27 0,27 0,746 0,746 -0,73 -0,73 -0,73 -0,73 -0,73 x’22 0,27 0,27 0,27 0,27 0,27 0,27 0,27 0,27 -0,73 -0,73 0,746 0,746 -0,73 -0,73 -0,73 x’32 0,27 0,27 0,27 0,27 0,27 0,27 0,27 0,27 -0,73 -0,73 -0,73 -0,73 0,746 0,746 -0,73 y (%) 33,7 34,6 34 43,4 35,7 45,1 36,3 43,7 43,4 36,6 38,6 39,4 44,9 41,7 44,6 Trong đó: x1, x2, x3 yếu tố mã hoá phản ứng, y hiệu suất thực tế phản ứng thu dựa theo bố trí thí nghiệm Ở sử dụng giá trị ϕ d tính sẵn cho mơ hình kế hoạch hóa thực nghiệm bậc tâm trực giao với n =3: ϕ = 0,73; d = 1,215 b Xác định hệ số phương trình hồi quy Các hệ số phương trình hồi quy mơ hình quy hoạch thực nghiệm bậc tâm trực giao tính tốn theo cơng thức sau: Sau sử dụng phần mềm tin học để tính tốn, hệ số phương trình hồi quy sau: bo 39,713 b1 3,229 b2 0,669 b3 1,734 b12 0,813 b13 0,813 b23 -1,238 b11 -2,394 c Đánh giá tính có nghĩa hệ số phương trình hồi quy b22 -3,071 b33 -0,161 16 Bốn thí nghiệm thực thêm tâm để xác định giá trị phương sai tái sinh thí nghiệm Hiệu suất thí nghiệm 42,6; 41,6; 41,2 42,9, giá trị ttính tính sau: to t1 t2 t3 t12 t13 t23 t11 t22 t33 39,713 13,262 2,748 7,121 2,852 2,852 4,344 6,206 7,96 0,415 Tra bảng giá trị số student, giá trị tbảng theo bảng (mức ý nghĩa p=0.05) 3,18 So sánh giá trị ttính với giá trị tbảng thấy giá trị t2, t12, t13 t33 nhỏ giá trị tbảng kết luận hệ số b2, b12, b13 b33 hệ số khơng có ý nghĩa bị loại khỏi phương trình hồi quy phương trình hồi quy sau loại bỏ hệ số khơng có nghĩa sau: Y = 43.704 + 3.229*x1+1.734*x3 - 1.238*x2.x3 - 2.394*x12 - 3.071*x22 (1) d Đánh giá phù hợp phương trình hồi quy Tính giá trị Ftính (giá trị F theo chuẩn Fisher) theo công thức dựa tài liệu tham khảo [5], [125], thu Ftính=6,16 Tra bảng giá trị F với f1=6, f2=3 cho giá trị Fbảng = 8,9 So sánh với giá trị Ftính, cho thấy Ftinh< Fbảng, chứng tỏ phương trình hồi quy mơ tả thực nghiệm Sử dụng phép biến đổi Xj = o Zj - Zj để đưa phương trình (1) dạng biến thực Δ Zj 2 Y=6.966+0.256*Z1+0.295*Z2+0.14*Z3-0.0008*Z2*Z3-0.001*Z1 -0.0012*Z2 (2) Z1: hàm lượng tác nhân oxy hoá, dung dịch H2O2 30%, từ 50 – 150 µmol Z2: hàm lượng dung dịch N2H4, từ 50 – 150 µmol Z3: thời gian phản ứng từ 30 đến 90 phút 4.6.4.3 Xác định điều kiện tối ưu cho phản ứng khử hố nối đơi Điều kiện tối ưu phản ứng khử hố nơi đơi axit béo khơng no theo lý thuyết điều kiện để có cực đại hàm mục tiêu biến thực (2) vùng quy hoạch Sau tính tốn cực đại phương trình hồi quy (2) thuật tốn FLEXIPLEX (bằng ngơn ngữ lập trình Pascal) cho giá trị YMax=46,31% Z1 = 128,0 (µmol); Z2 = 92,9 (µmol); Z3 = 90 (phút) Làm lại thí nghiệm hàm lượng dung dịch H2O2 30%: 128 µmol; hàm lượng N2H4: 93 µmol thời gian phản ứng 90 phút cho kết sau: Trung bình STT Hiệu suất (%) 45,9 46,5 46,1 46,17±0,25 Kết chứng minh việc sử dụng mô hình quy hoạch hố thực nghiệm bậc tâm trực giao nghiêm cứu phản ứng hoàn tồn phù hợp xác Phương trình hồi quy (1) cho thấy hai yếu tố X1(nồng độ H2O2) X3 (thời gian phản ứng) ảnh hưởng dương lên hiệu suất tạo sản phẩm axit béo nối đôi (b1,b3>0), yếu tố 17 ảnh hưởng mạnh Ngồi ra, hiệu suất phản ứng cịn chịu tác động kết hợp yếu tố: hàm lượng hydrazin thời gian phản ứng thể số hạng x2x3 Sự có mặt hệ số b11 b22 chứng minh tác động mạnh hai yếu tố bậc X1 (hàm lượng tác nhân oxy hóa) X2 (hàm lượng hydrazin) lên hiệu suất tạo thành sản phẩm axit béo nối đôi 4.7 Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm từ PUFA 4.7.1 Nghiên cứu tạo chế phẩm Trên sở kết khảo sát hoạt tính sơ tất mẫu dầu dạng nguyên chất số dạng công thức phối hỗn hợp loại dầu khác tạo chế phẩm tối ưu OF27 có hoạt tính khả quan là: dầu n-3 (từ mỡ cá biển) + dầu n-6 (từ dầu hạt thực vật) với tỉ lệ thích hợp n-6/n-3= 10/1.Chế phẩm OF27 nghiên cứu toàn diện độc tính cấp, độc tính bán trường diễn số tác dụng dược lý, thí nghiệm tiến hành Khoa Dược, học viện Quân Y 4.7.2 Nghiên cứu an toàn chế phẩm OF27 4.7.2.1 Kết nghiên cứu độc tính cấp OF27 theo đường uống Bảng 4.5: Kết nghiên cứu độc tính cấp OF27 theo đường uống xi ( g/kg ) 2,40 4,80 9,60 14,40 19,20 8/4 32 24,00 - - - - - K Σ=6 mi n - mi 11 mi n - mi 0/12 11/11 4/8 6/6 Σ = 19 mi ( n-mi ) zi mi - zi 11 32 36 7 20 18 Σ = 111 Σ = 53 Kết bảng cho thấy giá trị LD50 = 19,00 ± 2,01 g/kg thể trọng chuột nhắt trắng theo đường uống (16,99 tới 21,01) 4.7.2.2 Nghiên cứu độc tính bán trường diễn liều thấp chễ phẩm OF27 a Nghiên cứu ảnh hưởng OF27 theo đường uống trường diễn lượng thể, gan, lách, thận động vật với liều 0,02 g/kg (bảng 4.6) Kết bảng 4.6 cho thấy số tăng trọng lượng so sánh theo nhóm sau tuần tỷ số nhóm trắng, chứng, OF27 thuốc tham chiếu khác khơng có ý nghĩa thống kê (p > 0,05), chứng tỏ chế phẩm OF27 nghiên cứu không làm ảnh hưởng đến 18 trọng lượng thể chuột nghiên cứu Đây số quan trọng đánh giá thuốc nghiên cứu trường diễn Bảng 4.6: Chỉ số tăng trọng lượng nhóm trắng, nhóm chứng, thuốc nghiên cứu thuốc tham chiếu cho chuột nhắt trắng uống OF27 mức liều 0,02 g/kg Nhóm N/C Thời gian N/C Tuần thứ I Tuần thứ II Tuần thứ III Tuần thứ IV Tuần thứ V Trắng Chứng CMC 2% (0,1ml/10g) Thuốc tham chiếu EBS1 0,5 g/kg n 12 12 12 10 ⎯x 17,43 17,39 18,29 20,35 SD 4,11 5,15 1,12 1,70 n 12 12 12 10 ⎯x 23,05 22,86 22,5 23,4 SD 3,90 2,82 3,23 2,00 n 12 12 12 10 ⎯x 23,67 22,96 22,29 25,35 SD 1,90 2,20 2,00 3,20 n 12 12 12 10 ⎯x 24,05 23,45 22,33 26,60 SD 2,92 2,74 3,11 2,60 n 12 12 11 ⎯x 25,12 24,5 25,91 SD 1,7 2,80 3,78 p1,2 P Thuốc n/c OF27 0,02 g/kg p2,3 p3,4 Không thử > 0,05 > 0,05 > 0,05 b Kết nghiên cứu trọng lượng thể dùng OF27 trường diễn theo đường uống chuột nhắt trắng với liều 0,03 g/kg (bảng 4.7) So sánh nhóm chứng, thuốc OF27 thuốc tham chiếu tiêu trọng lượng thể, khác khơng có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Chế phẩm OF27 không làm ảnh hưởng đến trọng lượng thể trọng lượng tạng quan trọng trình chuyển hóa thuốc q trình thải trừ thuốc với mức liều sử dụng 0,02 0,03 g/kg/24 19 Bảng 4.7: Trọng lượng thể cho uống trường diễn OF27 liều 0,03 g/kg Thời gian Nhóm N/C Tuần thứ I Tuần thứ II Tuần thứ III Tuần thứ IV Tuần thứ V Chứng dung môi 2% ( 0,1 ml/10g ) Thử chế phẩm OF27 0,03g/kg TLCT n ⎯x SD n ⎯x SD n ⎯x SD n ⎯x SD n ⎯x 12 17,83 1,84 12 23,82 1,54 12 28,00 2,54 12 26,21 3,07 12 32,23 12 16,00 0,83 12 19,08 1,72 12 25,13 3,66 12 25,67 5,08 12 27,92 SD 2,14 4,79 P - P(1,2) > 0,05 Tham chiếu EBS1 0,5 g/kg TLCT 10 20,35 1,70 10 23,40 2,00 10 25,35 2,00 10 26,60 2,60 Không thử p(3,2) > 0,05 p(3,1) > 0,05 c Kết nghiên cứu trọng lượng thể, gan, lách, thận tỷ số trọng lượng tạng so với trọng lượng thể dùng mức liều 0,02 g/kg (bảng 4.8) Bảng 4.8: Kết nghiên cứu trọng lượng thể, trọng lượng tạng mức liều 0,02 g/kg/24 Chỉ tiêu Các tạng Gan (n=12) Lách (n=12) Chứng Chế phẩm OF27 Chứng Chế phẩm OF27 Chứng Thận (n=12) Chế phẩm OF27 ⎯x SD ⎯x SD ⎯x SD ⎯x SD ⎯x SD ⎯x SD TLCT (g) TL tạng (g) 24,50 2,80 22,25 3,23 24,50 2,80 22,35 3,23 24,50 2,80 22,25 3,23 1,84 0,42 1,62 0,26 1,61 0,37 1,72 0,64 2,67 0,87 2,29 0,61 TL tạng/10g TLCT p 0,75 - 0,72 >0,05 0,66 - 0.77 >0,05 1,09 - 1,12 >0,05 20 Khi so sánh tỷ số trọng lượng ba tạng quan trọng qúa trình chuyển hóa thải thuốc là: gan, lách, thận tính theo 10 gam trọng lượng thể chuột nhắt trắng thí nghiệm, tỷ lệ khơng có khác biệt nhóm chứng nhóm thuốc nghiên cứu (p chứng thử> 0,05) Như dùng OF27 mức liều 0,02 g/kg/24 giờ, không ảnh hưởng đến trọng lượng thể trọng lượng quan gan, lách thận d Nghiên cứu ảnh hưởng chế phẩm OF27 với tiêu huyết học động vật thí nghiệm cho uống bán trường diễn Một tiêu có ý nghĩa hàng đầu xem xét ảnh hưởng chất nghiên cứu thể sinh vật thông số phân tử hữu hình máu Vì chúng tơi tiến hành so sánh số lượng hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu định lượng hemoglobin chuột nhắt trắng uống dài ngày chế phẩm OF27.Với mức liều sử dụng kết cho thấy OF27 không làm ảnh hưởng đến số lượng tế bào máu ngoại vi, không ảnh hưởng đến chức tạo máu động vật thí nghiệm (p > 0,05) (bảng 4.9) Bảng 4.9: thông số hóa sinh động vật cho uống trường diễn chế phẩm OF27 Nhóm N/C OF27 ( n = 12) Chỉ tiêu N/C Chứng CMC ( n= 12) Trước thí nghiệm Sau thí nghiệm Trước thí nghiệm Sau thí nghiệm Số lượng ⎯x 5,12 5,36 4,35 3,96 Hồng cầu SD 0,67 0,84 0,77 0,33 P - < 0,05 - < 0,05 ⎯x 150,83 148,46 123,33 111,45 SD P 21,58 - 24,01 >0,05 23,49 - 8,68 >0,05 ⎯x 3,10 3,15 3,20 3,13 SD P 0,64 - 0,45 >0,05 0,25 - 0,26 >0,05 ⎯x 478,00 492,81 430,66 454,00 SD P 56,53 - 68,40 >0,05 58,40 - 75,67 >0,05 12 ( × 10 /L ) Hemoglobin (g/L) Bạch cầu ( × 109/L ) Tiểu cầu ( × 109/L ) e Nghiên cứu ảnh hưởng chế phẩm OF27 đến thông số hóa sinh động vật cho uống trường diễn So sánh nhóm chứng, thuốc OF27 thuốc tham chiếu tiêu trọng lượng thể, khác khơng có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) 21 Chế phẩm OF27 không làm ảnh hưởng đến trọng lượng thể trọng lượng tạng quan trọng q trình chuyển hóa thuốc trình thải trừ thuốc với mức liều sử dụng 0,02 0,03 g/kg/24 Bảng 4.10: Ảnh hưởng chế phẩm OF27 đến thông số hóa sinh động vật cho uống trường diễn Nhóm N/C Chế phẩm OF27 (n = 12) Chỉ tiêu N/C SGOT ( UI/L ) SGPT ( UI/L ) Creatinin ( μmol/L ) ⎯x SD p ⎯x SD p ⎯x SD p Chứng (n = 12) Trước TN Sau TN Trước TN Sau TN 178,55 12,35 67,39 15,18 56,21 7,75 - 181,96 17,34 >0,05 65,18 9,46 >0,05 59,22 10,04 >0,05 223,28 50,23 58,50 13,17 50,83 14,83 - 245,10 41,70 >0,05 65,84 12,64 >0,0, 54,50 14,44 >0,05 Chức gan đánh giá qua tiêu enzym chuyển amin cho thấy OF27 chưa gây ảnh hưởng bất lợi cho chức gan Chức thận đánh giá qua tiêu định lượng creatinin cho thấy OF27 không gây độc cho thận f Nghiên cứu ảnh hưởng OF27 đến thông số mô bệnh học dùng trường diễn.Về cấu trúc vi thể, tiêu gan, lách, thận xử lý chuyên gia giải phẫu bệnh lý kết luận OF27 không làm ảnh hưởng đến hình thái chức quan trọng q trình chuyển hóa thải trừ thuốc nghiên cứu 4.7.3 Kết nghiên cứu hiệu lực chế phẩm OF27 4.7.3.1 Ảnh hưởng chế phẩm OF27 đến trình sinh tổng hợp protein động vật thực nghiệm Bảng 4.11:Kết nghiên cứu ảnh hưởng chế phẩm OF 27 đến lượng protein huyết động vật thực nghiệm (thỏ n=10) Xuất phát diểm Sau tuần dùng chế phẩm OF 27 N 10 10 x 53,53 64,04 SD P 5,05 2,44 Mức tăng (%) 19,63 < 0,05 22 Chế phẩm OF27 làm tăng tổng hợp protein động vật, điều có ý nghĩa việc nghiên cứu tác dụng chế phẩm lên trung ương thần kinh 4.7.3.2 Tác dụng OF27 liều thấp (0,02g/kg) cho uống bán trường diễn lực tâm thần kinh động vật thực nghiệm: làm cho lực tâm thần kinh động vật thực nghiệm tăng lên rõ rệt Nhóm Chứng (a) RES (b) RES+ OF27 (c) 8,42 1,16 50,50 43,75 100% 1,75 1,08 10,50 24,25 20,78% 5,33 0,82 32,00 174,00 63,30% Số nhóm ⎯x SD Σx Σx2 % 4.7 3.3 Tác dụng OF27 lên điều biến miễn dịch a Tác dụng điều biến miễn dịch chế phẩm OF27 theo hướng đáp ứng miễn dịch tế bào sử dụng chế phẩm OF27 tăng khả tăng sinh tuyến ức có liên quan chặt chẽ đến tác dụng kích thích hệ thống miễn dịch tế bào lympho T tuyến ức động vật non Bảng 4.12: Tác dụng điều biến miễn dịch chế phẩm OF27 theo hướng đáp ứng miễn dịch tế bào Nhóm nghiên cứu Mức liều n Mức liều I (0,02g/kg TLCT) Mức liều II (0,03g/kg TLCT) Mức liều III (0,04g/kg TLCT) x SD P n x SD P n x SD P Chứng mg/10g TLCT Chuẩn mg/10g TLCT Thử mg/10g TLCT 10 14,87 1,04 - 10 6,72 0,42 < 0,01 10 9,50 0,37 < 0,05 10 12,39 0,48 - 10 6,56 0,30 < 0,01 10 9,64 0,95 < 0,05 10 13,37 0,52 - 10 6,52 0,54 < 0,01 10 8,80 1,25 < 0,05 b Tác dụng điều biến miễn dịch chế phẩm OF27 theo hướng đáp ứng miễn dịch dịch thể dùng chế phẩm OF27 trường diễn cho kết loại kháng thể miễn dịch IgA(ImmunoglobulinA) kháng thể bảo vệ IgG (Immunoglobulin G) tăng, tức đáp ứng 23 theo chiều hướng kích thích Riêng IgE (Immunoglobulin E) so sánh trước sau thí nghiệm khác biệt khơng có ý nghĩa với p > 0,05 4.7.3.4 Tác dụng chế phẩm OF27 mơ hình micronucleus test ức chế khả đột biến (antimutagenicity) Bảng 4.13: Tác dụng chế phẩm OF27 mơ hình micronucleus test ức chế khả đột biến (antimutagenicity) Nhóm nghiên cứu Chỉ tiêu N Giá trị MN- PCE/1000 PCE x ± SD Tỷ lệ % P Chứng Thử 20 20 270,00 ± 29,30 100,00 - 148,20 ± 15,30 54,81 < 0,05 4.7.3.5 Tác dụng làm giảm tần suất xuất khối u da chế phẩm OF27 mơ hình thực nghiệm dùng DMBA (gây khối u da): Kết nghiên cứu mối liên quan hoạt tính chống oxy hóa tác dụng giảm tần xuất xuất khối u da chế phẩm OF27 mơ hình thực nghiệm với mức liều dùng có tác dụng làm giảm tần suất xuất khối u chuột nhắt trắng chế phẩm OF27 (n = 10 nhóm) Như kết nghiên cứu tác dụng dược lý độc tính cấp bán trường diễn động vật thực nghiệm cho thấy chế phẩm OF27 độc theo đường uống không ảnh hưởng lên gan, lách, thận số sinh hoá, huyết học thể sống Mặt khác thí nghiệm hiệu l ực cho thấy chế phẩm OF27 làm tăng lượng tâm thần kinh, tăng sinh tổng hợp protein, tăng cường đáp ứng miễn dịch dạng tế bào dịch thể Điều đáng quan tâm chế phẩm OF27 có khả ức chế đột biến antimutagennicity giảm tần suất xuất khối u da Như mở triển vọng ứng dụng chế phẩm OF27 thực phẩm chức tương lai, phần củng cố thêm chứng lâm sàng liên quan tỉ lệ n-3/n-6 axit béo khả phòng ngừa bệnh tật chúng thể sống KẾT LUẬN Hai tám loài Việt Nam thuộc họ thực vật: Brassicaceae (cải), Cucurbitacaea (bí), Sapindaceae (bồ hịn), Rutaceae (cam), họ Malvaceae (bông) nghiên cứu hệ thống hàm lượng lipid, thành phần tocopherol axit béo hạt Các lồi thuộc ba họ: cải, bí, cam có hàm lượng dầu cao (trung bình 35%) hàm lượng 24 tocols tổng dao động khoảng từ 2,56mg/100g đến 276,8mg/100g (chủ yếu hai dạng α-tocopherol, γ-tocopherol) Hạt vải Litchi chinensis Sonn có dầu béo thấp (1,4%) hàm lượng tocols phong phú, tocopherol tổng cao (276,8mg/100g) dạng δtocotrienol (181,5mg/100g) Đã phát có mặt axit: axit malvalic (1,33g/100g), axit sterculic (0,5g/100g), axit vernolic, axit coronanic 2,73g/100g hạt dâm bụt giấm Hibiscus sabdraffi L Việt Nam chứng minh cấu trúc hoá học chúng dựa vào phản ứng hoá học đặc hiệu kết hợp phương pháp GC-MS Đã khẳng định dầu hạt thuộc bốn họ Cải, Cam, Bí, Bồ hịn có axit béo đặc trưng ‘fingerprinter” C22:1 (họ cải), C16:0 C18:3 (họ cam), C18:2 C18:3 liên hợp (họ bí), C18:1 (họ bồ hịn) sử dụng chúng mã khóa phân loại hóa học Bằng phương pháp PCA phân tích theo thống kê học xác định mối tương quan di truyền axit béo C18:3 với γ-tocopherol (r = 0,51 P