Nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc captopril của màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường chuẩn

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH - KTNN ====== NGUYỄN THỊ DINH NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC CAPTOPRIL CỦA MÀNG CELLULOSE VI KHUẨN LÊN MEN TỪ MƠI TRƯỜNG CHUẨN KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học người động vật Người hướng dẫn khoa học ThS HÀ THỊ MINH TÂM HÀ NỘI, 2018 LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS Hà Thị Minh Tâm hướng dẫn, bảo tận tình, giúp đỡ tạo điều kiện cho em thực hoàn thành tốt khoá luận Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trường ĐHSP Hà Nội 2, khoa Sinh- KTNN, Viện NCKH&ƯD Trường ĐHSP Hà Nội 2, thầy cô tổ môn Động vật, ban bảo vệ tạo điều kiện giúp đỡ em Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ, quan tâm động viên bạn bè, gia đình suốt trình hồn thành khố luận Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2018 SINH VIÊN Nguyễn Thị Dinh LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, số liệu, kết khoá luận trung thực, khơng trùng lặp với cơng trình cơng trình nghiên cứu khác Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2018 SINH VIÊN Nguyễn Thị Dinh DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt A xylinum CAP Tên đầy đủ Acetobacter xylinum Captopril CVK Cellulose vi khuẩn C Nồng độ E coli Escherichia coli h Giờ OD Optical Density HS Môi trường chuẩn Hestrin – Schramm g Gam MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Lí chọn đề tài Mục đích nghiên cứu Đối tượng phạm vi nghiên cứu Nhiệm vụ nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn NỘI DUNG CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu VCK 1.1.1 Vi khuẩn sản sinh VCK 1.1.2 Cấu trúc đặc điểm màng CVK 1.2 Captopril 1.2.1 Một số tính chất lí hố 1.2.2 Dược tính 1.2.3 Tác dụng không mong muốn 1.3 Môi trường chuẩn Hestrin – Schramm (HS) 1.4 Tình hình nghiên cứu nước 1.4.1 Cellulose vi khuẩn (CVK) 1.4.2 Captopril CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu trang thiết bị 2.1.1 Giống vi khuẩn 2.1.2 Nguyên liệu hoá chất 2.1.3 Thiết bị dụng cụ 2.2 Nội dung nghiên cứu 2.3 Phương pháp nghiên cứu 10 2.3.1 Phương pháp tạo màng xử lí màng CVK trước hấp thụ thuốc Captopril10 2.3.2 Thử độ màng 10 2.3.3 Phương pháp chế tạo màng CVK nạp thuốc CAP 11 2.3.3 Phương pháp tạo màng CVK nạp thuốc CAP 12 2.3.4 Phương pháp xác định lượng CAP nạp vào màng CVK 12 2.3.5 Phương pháp thống kê xử lí kết 13 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 14 3.1 Phổ hấp thụ đường chuẩn thuốc CAP 14 3.2 Tạo màng CVK A xylinum môi trường chuẩn 16 3.3 Thu màng VCK thô từ môi trường chuẩn 18 3.4 Tinh chế màng CVK 19 3.5 Màng CVK hấp thụ thuốc CAP 21 3.6 Lượng thuốc CAP hấp thụ vào màng CVK 21 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 25 Kết luận 25 Kiến nghị 25 TÀI LIỆU THAM KHẢO 26 PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần môi trường chuẩn Bảng 2.1 Các trường hợp thí nghiệm 12 Bảng 3.1 Bước sóng hấp thụ cực đại thuốc CAP 14 Bảng 3.2 Mật độ quang dung dịch CAP nồng độ khác (n=3) 15 Bảng 3.3 Giá trị OD trung bình dung dịch CAP sau ngâm màng CVK 120 phút (n=3) 22 Bảng 3.4 Lượng thuốc CAP hấp thụ vào màng CVK (n=3) 22 DANH MỤC HÌNH Hình 3.1 Phổ hấp thụ cực đại CAP với dung môi nước cất 14 Hình 3.2 Đồ thị đường chuẩn CAP OD200nm với dung mơi nước cất 15 Hình 3.3 Màng CVK sau ngày nuôi cấy tĩnh mơi trường chuẩn 16 Hình 3.4 Màng CVK có độ dày 0,5cm sau ngày ni cấy 17 Hình 3.5 Màng CVK có độ dày 1cm sau 14 ngày nuôi cấy 17 Hình 3.6 Màng CVK thơ thu từ môi trường chuẩn 18 Hình 3.7 Màng CVK thơ thu từ mơi trường chuẩn có kích thước d1,5cm 19 Hình 3.8 Màng CVK tinh khiết sau xử lý NaOH 20 Hình 3.9 Màng CVK tinh khiết độ dày 0,5cm 20 Hình 3.10 Màng CVK tinh thiết độ dày 1cm 21 Hình 3.11 Hiệu suất hấp thụ CAP độ dày màng trường hợp 23 Hình 3.12 Hiệu suất hấp thụ CAP độ dày màng trường hợp 23 MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài Captopril (CAP) chất ức chế men chuyển angiotensin hoạt tính đường uống Captopril dùng để điều trị tăng huyết áp, giúp ngăn ngừa đột quỵ, đau tim vấn đề thận Captopril không gây độc tế bào bình thường Ngồi ra, captopril khơng gây trầm cảm thần kinh trung ương không gây rối loạn giấc ngủ Captopril cho thấy hoạt tính chống trầm cảm Captopril điều tra để sử dụng điều trị ung thư phổi Các đồng phân lập thể captopril báo cáo có khả ức chế số metallo-β-lactamase [12,14] Mặc dù captopril cho thấy khả chống lại số bệnh hiệu điều trị có số hạn chế Captopril có thời gian bán thải ngắn (1-3h), dễ bị oxy hoá làm giảm tác dụng thuốc [9] Vì gây ảnh hưởng khơng nhỏ đến hiệu điều trị lâm sàng đặc tính an tồn captopril bệnh nhân Trong q trình điều trị thuốc CAP, bệnh nhân gặp số tác dụng phụ không mong muốn như: Hạ huyết áp (Thường gặp liều đầu tiên), ho, suy thận cấp, dị ứng, phù mạch thần kinh nước ngồi mao mạch, thay đổi vị giác, viêm tuỵ, viêm lưỡi, thiếu máu, bệnh vàng da, Vì vậy, có nhiều nỗ lực thực để cải thiện hạn chế captopril cách thay đổi tính Việc sử dụng vật liệu sinh học sản phẩm chăm sóc sức khỏe năm gần có ý đặc biệt như: Khả tái tạo, tương thích sinh học phân hủy sinh học Trong đáng ý cellulose, vật liệu vượt trội so với polyme tự nhiên tổng hợp khác [16] Cellulose vi khuẩn (Viết tắt CVK) sản phẩm loài vi khuẩn, đặc biệt chủng Acetobacter xylinum Màng CVK có cấu trúc đặc tính giống với cellulose thực vật Màng CVK có nhiều đặc tính vật lí, hố học ưu việt so với cellulose thực vật như: độ bền học cao, khả thấm hút nước cao, cấu trúc từ sợi nhỏ tinh vi, có độ tinh khiết cao khả polymer hoá lớn,… [7] Vì vậy, màng CVK ứng dụng nhiều thực tiễn lĩnh vực khác thực phẩm, y học, mỹ phẩm, đặc biệt lĩnh vực y tế nhờ khả kháng khuẩn cao [5] Ngoài ra, màng CVK cho thấy khả ứng dụng hệ thống vận chuyển thuốc, dùng qua đường uống, thẩm thấu qua da, số ứng dụng y sinh học khác [6,8], đáng ý kiểm soát hệ thống vận chuyển thuốc Vì vậy, dựa khả ứng dụng màng CVK tương lai tạo hệ thống tăng cường khả hấp thụ thuốc captopril, từ cải thiện số hạn chế thuốc trình sử dụng, giúp tăng hiệu chữa trị Đó lí chúng tơi chọn đề tài: “Nghiên cứu khả hấp thụ thuốc captopril màng Cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường chuẩn” Mục đích nghiên cứu - Tìm hiểu khả hấp thụ thuốc captopril màng CVK lên men từ môi trường chuẩn HS - Nghiên cứu hệ thống CVK hấp thụ thuốc captopril độ dày màng khác từ nhằm tìm trường hợp khả hấp thụ thuốc captopril tối đa vào màng CVK Đối tượng phạm vi nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu: Khả hấp thụ thuốc captopril màng Cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường chuẩn - Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu thực quy mơ phòng thí nghiệm - Địa điểm nghiên cứu: Viện NCKH&ƯD, Trường ĐHSP Hà Nội 2 - Phương trình đường chuẩn: y = 1,0804x + 0,0136 (R² = 0,9992) Trong đó: x - Nồng độ CAP (µg/ml) y - Giá trị OD tương ứng R2 hệ số tương quan 3.2 Tạo màng CVK A xylinum môi trường chuẩn Nuôi cấy tĩnh vi khuẩn A xylinum, lúc mơi trường có đầy đủ chất dinh dưỡng nên tạo điều kiện cho vi khuẩn sinh trưởng phát triển Ngày đầu tiên, vi khuẩn bắt đầu tiếp xúc với môi trường làm cho pH môi trường giảm nhẹ Đến ngày thứ hai, bề mặt dung dịch bình ni cấy bắt đầu xuất lớp màng có màu trắng đục Lớp màng dày dần lên đến môi trường hết chất dinh dưỡng vi khuẩn ngừng sinh trưởng dừng lại Sau – 14 ngày ni cấy tĩnh màng có độ dày khoảng 0,5 – 1cm Thời gian ni cấy định độ dày màng Màng CVK nuôi cấy tĩnh môi trường chuẩn đến ngày thứ thể hình 3.3 Hình 3.3 Màng CVK sau ngày nuôi cấy tĩnh môi trường chuẩn 16 - Theo dõi tạo thành màng CVK sau khoảng thời gian thu màng CVK độ dày sau: + Nuôi cấy thời gian ngày ta thu màng CVK có độ dày 0,5cm thể hình 3.4 Hình 3.4 Màng CVK có độ dày 0,5cm sau ngày nuôi cấy + Nuôi cấy thời gian 14 ngày ta thu màng CVK có độ dày 1cm thể hình 3.5 Hình 3.5 Màng CVK có độ dày 1cm sau 14 ngày nuôi cấy 17 3.3 Thu màng VCK thô từ môi trường chuẩn Màng CVK thu từ mơi trường chuẩn có màu trắng đục, bề mặt phẳng, trơn, dẻo có độ bền cao Thu màng CVK thời gian nuôi cấy khác màng có độ dày mỏng khác Khi thu màng sau ngày ni cấy màng có độ dày khoảng 0,5cm Khi thu màng sau 14 ngày ni cấy màng có độ dày khoảng 1cm Môi trường chứa đầy đủ chất dinh dưỡng giúp cho vi khuẩn A xylinum sinh trưởng liên tục sản sinh lớp màng CVK bề mặt môi trường Do vậy, thời gian nuôi cấy lâu thi lớp màng CVK dày lên Đến môi trường nuôi cấy hết chất dinh dưỡng, vi khuẩn A xylinum khơng sinh trưởng độ dày màng ngừng tăng Màng CVK thô thu từ mơi trường chuẩn thể hình 3.6 Hình 3.6 Màng CVK thô thu từ môi trường chuẩn 18 Sau đục màng khn có đường kính 1,5cm ta thu màng CVK thơ kích thước d1,5cm thể hình 3.7 Hình 3.7 Màng CVK thơ thu từ mơi trường chuẩn có kích thước d1,5cm 3.4 Tinh chế màng CVK - Để loại bỏ tạp chất chứa màng CVK ta tiến hành tinh chế màng CVK, đồng thời giúp trung hoà độc tố vi khuẩn Trước màng sử dụng để nạp thuốc ta cần tinh chế màng, trình giúp cho màng hấp thu lượng thuốc tối đa Màng CVK sau tách từ môi trường nuôi cấy rửa với nước cất, sau màng xử lý NaOH 3M, đem hấp nhiệt độ 121oC 20 phút 19 Sau mang xả nước đến pH trung tính, ta thu màng CVK tinh chế có màu trắng sáng thể hình 3.8 Hình 3.8 Màng CVK tinh khiết sau xử lý NaOH - Màng CVK tinh chế độ dày 0,5cm thể hình 3.9 Hình 3.9 Màng CVK tinh khiết độ dày 0,5cm 20 - Màng CVK tinh chế độ dày 1cm thể hình 3.10 Hình 3.10 Màng CVK tinh thiết độ dày 1cm 3.5 Màng CVK hấp thụ thuốc CAP Cho màng CVK tinh khiết sau tinh chế vào bình tam giác chứa dung dịch thuốc captopril Khi cho màng CVK vào dung dịch thuốc CAP, thuốc từ dung dịch hấp thụ vào bên màng chênh lệch nồng độ thuốc bên bên màng 3.6 Lượng thuốc CAP hấp thụ vào màng CVK Lượng thuốc hấp thụ vào màng tính theo nghiên cứu TS Nguyễn Xuân Thành cộng Ta tính giá trị OD trung bình dung dịch thuốc CAP cách sử dụng máy đo quang phổ UV – Vis 2450 Giá trị OD200nm thuốc CAP dung dịch giảm dần sau 120 phút không đổi hai độ dày màng trường hợp Điều chứng tỏ lượng thuốc hấp thụ vào màng đạt cực đại Kết thể bảng 3.3 21 Bảng 3.3 Giá trị OD trung bình dung dịch CAP sau ngâm màng CVK 120 phút (n=3) Trường hợp Độ dày màng (cm) Giá trị OD200nm 0,5 0,867 ± 0,001 0,836 ± 0,002 0,5 0,732 ± 0,0015 0,672 ± 0,0016 Từ giá trị OD thu bảng 3.1 thay vào phương trình đường chuẩn thuốc CAP ta thu nồng độ CAP dung dịch xác định khối lượng CAP lại dung dịch Lấy khối lượng CAP dung dịch ban đầu trừ lượng thuốc lại dung dịch ta thu lượng CAP hấp thụ vào màng CVK Lượng thuốc CAP hấp thụ vào màng CVK thể bảng 3.4 Bảng 3.4 Lượng thuốc CAP hấp thụ vào màng CVK (n=3) Trường Độ dày OD sau hấp hợp màng thụ mht EE% (cm) 0,5 0,867 ± 0,0012 13,409 ± 0,0025 4,471 ± 0,0053 0,836 ± 0,0023 15,369 ± 0,005 5,123 ± 0,004 0,5 0,732 ± 0,002 21,703 ± 0,003 7,22 ± 0,0027 0,672 ± 0,001 25,619 ± 0,0025 8,99 ± 0,0031 22 Hiệu suất hấp thụ thuốc CAP màng CVK (Kích thước d1,5cm) độ dày khác trường hợp trường hợp thể biểu đồ hình 3.11 3.12 Trường hợp Tỷ lệ thuốc hấp thụ (%) 5.2 4.8 4.6 0.5 4.4 4.2 0.5 Độ dày màng (cm) Hình 3.11 Hiệu suất hấp thụ CAP độ dày màng trường hợp Tỷ lệ thuốc hấp thụ (%) Trường hợp 10 0.5 0.5 Độ dày màng (cm) Hình 3.12 Hiệu suất hấp thụ CAP độ dày màng trường hợp 23 Từ bảng 3.1; bảng 3.2 hình 3.8; hình 3.9 ta thấy: - Xét độ dày màng khác điều kiện hấp thu màng trường hợp hấp thụ tốt màng trường hợp + Cùng độ dày màng 0,5cm hiệu suất hấp thụ thuốc trường hợp đạt 7,22% cao hiệu suất hấp thụ trường hợp 4,471 % + Cùng độ dày 1cm hiệu suất hấp thụ thuốc trường hợp đạt 8,99% cao hiệu suất hấp thụ trường hợp 5,123% Như vậy, coi điều kiện nhiệt độ 80oC màng hấp thụ thuốc CAP tốt nhiệt độ phòng, với giá trị kiểm định p < 0,05 Có thể giải thích rằng: Nhiệt độ 80oC tạo động lực cho thuốc khuếch tán vào màng CVK tăng lên, làm cho lượng thuốc trường hợp vào màng nhiều trường hợp - Xét khác độ dày màng điều kiện hấp thụ thì: Màng có độ dày 1cm có hiệu suất hấp thụ thuốc CAP đạt 8,99% cao màng độ dày 0,5cm có hiệu suất hấp thụ 7,22% Như coi độ dày màng lớn lượng thuốc hấp thụ vào màng tốt Có thể giải thích rằng: Diện tích bề mặt tiếp xúc màng CVK độ dày 1cm lớn màng CVK độ dày 0,5cm nên lượng thuốc hấp thụ vào màng 1cm nhiều - Sự hấp thụ Captopril vật liệu CVK đạt hiệu suất nạp thuốc 8,99% với điều kiện: Nồng độ thuốc: 75mg/ml; nhiệt độ: 800C; thời gian hấp thụ thuốc: 120 phút - Màng CVK (Kích thước d1,5cm) lên men từ mơi trường chuẩn có độ dày 1cm hấp thụ thuốc tốt màng CVK có độ dày 0,5cm điều kiện thí nghiệm thời gian 120 phút 24 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Quá trình nghiên cứu đề tài thu số kết sau: - Đã xử lý thu màng CVK tinh khiết Màng CVK thu tinh khiết, khơng mùi, khơng bị biến tính nhiệt độ cao, chất lượng màng CVK phù hợp với nhu cầu làm thí nghiệm - Điều chỉnh lượng thuốc CAP hấp thụ qua màng dựa vào việc điều chỉnh độ dày màng (Thu màng thời điểm nuôi cấy khác nhau) nhiệt độ - Sự hấp thụ CAP vật liệu CVK đạt hiệu suất nạp thuốc 8,99% với điều kiện: Nồng độ thuốc: 75mg/ml; nhiệt độ: 800C; thời gian hấp thụ thuốc: 120 phút - Màng CVK (Kích thước d1,5cm) lên men từ mơi trường chuẩn có độ dày 1cm hấp thụ thuốc tốt màng CVK có độ dày 0,5cm điều kiện thí nghiệm thời gian 120 phút Kiến nghị - Tiếp tục khảo sát khả hấp thụ thuốc Captopril màng CVK lên men từ môi trường khác - Tiếp tục nghiên cứu đề tài động vật thí nghiệm để đánh giá sinh khả dụng thuốc từ hệ thồng CVK hấp thụ thuốc 25 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Dương Minh Tâm, Đỗ Thanh Sinh, “Một số kết nghiên cứu triển khai công nghệ vật liệu nano Khu công nghệ cao TP Hồ Chí Minh Định hướng phát triển 2013 – 2015”, hội thảo khao học “Định hướng phát triển khoa học công nghệ vật liệu tiên tiến Đại học Quốc gia Hồ Chí Minh” [2] Dương Minh Lam, Nguyễn Thị Thuỳ Vân, Đinh Thị Kim Nhung, (2013), “ Phân lập, tuyển chọn định loại chủng vi khuẩn BHN2 sinh màng Cellulose vi khuẩn”, Tạp chí sinh học [3] Đinh Thị Kim Nhung, Trần Như Quỳnh, Nguyễn Thị Thùy Vân (2009), “Nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter xylinum tạo màng Bacterial cellulose ứng dụng điều trị bỏng”, báo cáo khoa học [4] Nguyễn Bình Nguyên, Đào Thị Kim Oanh, Nguyễn Hải Nam, (3/2017), “Bước đầu nghiên cứu tổng hợp thiết lập tạp chuẩn captopril disulfid”, Tạp chí Dược học số 491, trang 41-47 [5] Nguyễn Thị Nguyệt, Đinh Thị Kim Nhung , (2008), “Nghiên cứu Aceto bacteria xylinum cho màng bacterial cellulose mặt nạ dưỡng da.”, Tạp chí SP2 số [6] Nguyễn Văn Thanh (2006), “Nghiên cứu chế tạo màng cellulose trị bỏng từ Acetobacter xylium”, đề tài cấp Bộ, Bộ Y tế [7] Nguyễn Xuân Thành, Triệu Nguyên Trung, Phan Thị Huyền Vy, Bùi Minh Thy, Phùng Thị Kim Huệ, (1/2018), Tối ưu hoá hiệu suất nạp thuốc famotidin vật liệu cellulose vi khuẩn lên men từ dịch trà xanh theo phương pháp đáp ứng bề mặt mơ hình Box-Behnken, Tạp chí Dược học, Số 105 năm 58 26 [8] Nguyễn Xuân Thành, Triệu Nguyên Trung, Phan Thị Huyền Vy, Bùi Minh Thy, Phùng Thị Kim Huệ, (1/2018), Thẩm định phương pháp phân tích định lượng famotidin huyết tương thỏ, Tạp chí Y học thực hành [9] Phạm Thị Minh Huệ, Nguyễn Trà Giang, Phạm Bảo Tùng, (5/2009), “Nghiên cứu bào chế viên nén captopril giải phóng theo nhịp”, Tạp chí Dược học số 397, trang 23 [10] Sách Dược điển Việt Nam IV, (2009), Nhà xuất Y học, trang 124127 [11] Võ Công Danh, Nguyễn Thúy Hương, (2013), “Lọc nước uống nhiễm khuẩn màng Bacterial celluose cố định bạc Nano”, Tạp chí Đại học Cơng Nghiệp, 22– 30 Tài liệu nước ngồi [12] Attoub S; Gaben AM; Al-Salam S; et al (9/2008), "Captopril as a potential inhibitor of lung tumor growth and metastasis", Ann N Y Acad.Sci 1138:65-72 PMID 837885 doi:10.1196/annals.1414.011 [13] Brown E Bacterial cellulose/Themoplastic polymer nanocomposites Master of sience in chemical engineering Washington state university, 2007 [14] Bryan, Jenny, (2009), "From snake venom to ACE inhibitor the discovery and rise of captopril", Pharmaceutical Journal, Retrieved 2015-01-08 [15] Hestrin, S.; Schramm, M (1954) "Synthesis of cellulose by Acetobacter xylinum: II Preparation of freeze– dried cells capable of polymerizing glucose tocellulose" Biochem J 58 (2): 345–352 [16] Klemm D et al (2009), “Nanocellulose materials – different cellulose, different functionality”, Macromol Symp, 280, 60–71 27 [17] Pavaloiu R.D et al (2014), “Use of Bacterial Cellulose as Reinforcement Agent and as Coating Agent in Drug Release Applications”, REV CHIM (Bucharest), 65(7): 852 – 855 [18] P.A Harris, IM Leigh and HA Navsaria The future for cultured Skin Replacements Burns, 24(7),453-457 (1998) 28 PHỤ LỤC Bảng So sánh cường độ hấp thụ thuốc CAP trung bình màng CVK độ dày 0,5cm trường hợp t-Test: Two-Sample Assuming Unequal Variances Mean TH1 TH2 0,866 0,732 0,867 0,7315 0,000002 4,50E-06 Observations 2 Hypothesized Mean Difference df Variance t Stat 75,16187659 P(T