Biểu hiện gen mã hóa nhân tố phiên mã dehydration responsive element binding của đậu tương (GmDREB) để tăng khả năng chịu hạn ở cây chuyển gen

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ĐỖ THANH KIM HƯỜNG TÁCH DÒNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN GmDREB7 PHÂN LẬP TỪ CÂY ĐẬU TƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên - 2019 Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thơng tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ĐỖ THANH KIM HƯỜNG TÁCH DÒNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN GmDREB7 PHÂN LẬP TỪ CÂY ĐẬU TƯƠNG Ngành: Di truyền học Mã số: 42 01 21 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Cán hướng dẫn khoa học: GS.TS Chu Hoàng Mậu Thái Nguyên - 2019 Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan nội dung luận văn kết nghiên cứu hướng dẫn trực tiếp GS.TS Chu Hoàng Mậu Các số liệu, kết sử dụng luận văn trung thực đồng ý cán hướng dẫn nhóm nghiên cứu Tác giả luận văn Đỗ Thanh Kim Hường Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Chu Hoàng Mậu trực tiếp hướng dẫn, bảo tạo điều kiện tốt để tơi thực nghiên cứu hồn thành luận văn thạc sĩ Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Lê Văn Sơn - Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam TS Nguyễn Thị Hải Yến - Khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên tận tình giúp đỡ tạo điều kiện để tiến hành thi nghiệm đề tài luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ thầy cô cán Bộ môn Sinh học đại & Giáo dục Sinh học; cảm ơn thầy cô Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành khố học Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình bạn bè động viên, chia sẻ giúp đỡ để tơi hồn thành luận văn Thái Nguyên, tháng năm 2019 Tác giả luận văn Đỗ Thanh Kim Hường Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn TÀI TRỢ Đề tài nghiên cứu luận văn thạc sĩ tài trợ Quỹ Phát triển khoa học công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) đề tài mã số 106.012018.27" với tên đề tài là: “Biểu gen mã hóa nhân tố phiên mã dehydration responsive element binding đậu tương (GmDREB) để tăng khả chịu hạn chuyển gen” GS.TS Chu Hoàng Mậu làm chủ nhiệm Tác giả luận văn Đỗ Thanh Kim Hường Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN………………………………………………… i LỜI CẢM ƠN……………………………………………………… ii TÀI TRỢ…………………………………………………………… iii MỤC LỤC………………………………………………………… iv DANH MỤC CÁC BẢNG………………………………………… v DANH MỤC CÁC HÌNH………………………………………… vi DANH MỤC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT…………………………… vii MỞ ĐẦU………………………………………………………… 1 Đặt vấn đề……………………………………………………… Mục tiêu nghiên cứu…………………………………………… Nội dung nghiên cứu…………………………………………… Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài……………………… Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU…………………………… 1.1 Đặc tinh chống chịu thực vật……………………………… 1.1.1 Tác động nhân tố phi sinh học đến thực vật………… 1.1.2 Cơ chế phân tử đặc tinh chống chịu yếu tố bất lợi thực vật………………………………………………………… 1.2 Họ nhân tố phiên mã AP2…………………………………… Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 1.2.1 Cây đậu tương……………………………………………… 1.2.2 Nhân tố phiên mã DREB đậu tương………………… 1.3 Vector biểu gen thực vật đánh giá hoạt động vector chuyển gen thuốc mơ hình……………………………… 12 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU… 16 2.1 Vật liệu nghiên cứu…………………………………………… 16 2.1.1 Vật liệu thực vật…………………………………………… 16 2.1.2 Các loại vector chủng vi khuẩn sử dụng nghiên cứu………………………………………………………………… 16 2.2 Hóa chất, thiết bị địa điểm nghiên cứu…………………… 16 2.2.1 Hóa chất, thiết bị nghiên cứu……………………………… 16 2.2.2 Địa điểm nghiên cứu………………………………………… 17 2.3 Phương pháp nghiên cứu……………………………………… 17 2.3.1 Nhóm phương pháp phân lập xác định trình tự nucleotide gen GmDREB7………………………………………………… 18 2.3.1.1 Tách chiết RNA tổng số nhân gen GmDREB7 từ cDNA……………………………………… …………………… 18 2.3.1.2 Tách dòng gen GmDREB7………………………………… 19 2.3.1.3 Xác định trình tự nucleotide……………………………… 21 2.3.2 Nhóm phương pháp thiết kế gen GmDREB7, vector chuyển gen tạo dòng vi khuẩn A tumefaciens CV58 mang vector chuyển gen chứa gen GmDREB7………………………………… Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 21 2.3.3 Phương pháp tạo chuyển gen thông qua A tumefaciens 22 2.3.4 Nhóm phương pháp phân tich, xử lý số liệu………………… 24 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN…… 25 3.1 Đặc điểm gen GmDREB7 phân lập từ giống đậu tương DT2008… 25 3.1.1 Kết nhân bản, tách dòng giải trình tự gen GmDREB7 25 3.1.2 Mối quan hệ di truyền giống đậu tương DT2008 mẫu đậu tương mang mã số BT092314, BT089389, NM001249580, NM001248527, AY244760 GenBank……… 31 3.2 Thiết kế gen vector chuyển gen thực vật mang gen GmDREB7………………………………………………………… 33 3.2.1 Thiết kế gen GmDREB7 nhân tạo…………………………… 33 3.2.2 Tạo vector chuyển gen mang cấu trúc chứa gen GmDREB7 34 3.3 Chuyển gen phân tich biểu gen GmDREB7 thuốc lá………………………………………………………… 36 3.3.1 Kết chuyển cấu trúc mang gen GmDREB7 vào thuốc thông qua A tumefaciens……………………………………… 36 3.3.2 Phân tich có mặt biểu mức phiên mã gen chuyển GmDREB7 thuốc chuyển gen Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN 39 http://lrc.tnu.edu.vn KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 41 Kết luận 41 Đề nghị 41 CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Trình tự nucleotide cặp mồi PCR……… 19 Bảng 2.2 Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn……… 20 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng gắn gen GmDREB7 vào vector tách dòng pBT…………………………………………………………… 20 Bảng 2.4 Thành phần môi trường tái sinh thuốc lá…………… 24 Bảng 3.1 Các vị tri sai khác trình tự nucleotide gen GmDREB7 giống đậu tương DT2008 trình tự nucleotide mang mã số BT092314 GenBank…………………………… 28 Bảng 3.2 Các vị tri sai khác trình tự amino acid suy diễn từ gen GmDREB7 giống đậu tương DT2008 trình tự nucleotide mang mã số BT092314 GenBank………………… 30 Bảng 3.3 Kết biến nạp cấu trúc pBI121_GmDREB7 vào thuốc giống K326………………………………………… …… Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN 38 http://lrc.tnu.edu.vn GmDREB7 thiết kế vector pUC18 có kich thước 2,69 kb (đã trình bày hình 2.1) 3.2.2 Tạo vector chuyển gen mang cấu trúc chứa gen GmDREB7 Tạo vector chuyển gen pBI121_GmDREB7 thực theo sơ đồ trình bày hình 2.1 (Chương 2) Sử dụng cặp enzyme XbaI/SacI để loại gen GUS từ vector pBI121_GUS; đồng thời sử dụng cặp enzyme XbaI/SacI để cắt thu nhận gen GmDREB7 (609 bp) từ vector pUC18 (Hình 3.10) Sử dụng enzyme nối T4 DNA ligase nối gen GmDREB7 vào vector chuyển gen pBI121 thành vector pBI121_GmDREB7 (Hình 3.11) gctctagaATGTTAGCGAAAACCCATAACAAAGGGGATGGATCTAAGTCCCTGGCTAAGAT ACTGGCAAAATGGAAAGAATATAATGCCCAGATTGATTCCAGCAGTGATGCGGATAAGCCA GTTCGCAAAGTTCCTGCCAAGGGATCGAAGAAGGGGTGCATGAAAGGTAAAGGGGGCCCTG AGAACTCGCGGTGTAACTACAGAGGTGTTAGGCAAAGGACTTGGGGAAAGTGGGTTGCTGA AATCCGAGAGCCAAACAGAGGCAATAGGCTTTGGCTAGGTACTTTCCCCACTGCCATTGGA GCTGCCCTTGCATATGATGAAGCGGCCAGGGCAATGTACGGTTCCTGTGCCCGTCTCAACT TTCCCAATGTTTCAGTTTCCAGTTTCTCTGAAGAATCTTCCAAAGATTCTCCGGTTGCGAA TCATTGTGGTTCGTCAATGGCAGTGTCTGCAAACGAGTCCATGATTTCACCAAGTAACTCG GGGGTAGGTGCAGAAGATGATGTTGATATGGAGCCCATTTCCTTATCCTTAACTGTAAAGC ATGAGAATGGGGGAAGGGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATTGAgagctcg Hình 3.9 Trình tự đoạn gen GmDREB7 nhân tạo có 609 nucleotide Ở đầu 5‘ có gctctaga vị tri cắt XbaI đầu 3‘ có gagctcg vị tri cắt enzyme SacI Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn Hình 3.10 Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm cắt gen GmDREB7 vector pUC18 sản phẩm cắt vector pBI121 cặp enzyme SacI XbaI Làn điện di số 1: sản phẩm cắt vector pUC18_GmDREB7; Làn điện di số 2: thang DNA kb; Làn điện di số 3: sản phẩm cắt vector pBI121_GUS Hình 3.11 Sơ đồ cấu trúc vector pBI121_GmDREB7 sử dụng cho chuyển gen vào thuốc nhờ A tumefaciens LB: biên T-DNA trái; RB: biên T-DNA phải; nptII: neomycin-phospo-transferase II mã hóa kanamycin; CaMV35S: promoter 35S có nguồn gốc từ virus khảm súp lơ; Gen GmDREB7 có 609 bp Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn Vector chuyển gen pBI121_GmDREB7 biến nạp vào vi khuẩn A tumefaciens chủng CV58 Kết kiểm tra có mặt gen GmDREB7 hai dòng vi kh̉n A tumefaciens phản ứng colony-PCR thu đoạn DNA có kich thước khoảng 0,6 kb tương ứng với kich thước gen GmDREB7 (Hình 3.12) Như vậy, kết phân tich cho thấy, chủng A tumefaciens tái tổ hợp mang gen GmDREB7 sử dụng biến nạp tạo thuốc chuyển gen Hình 3.12 Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm colony-PCR từ khuẩn lạc A.tumefaciens chủng CV58 3.3 CHUYỂN GEN VÀ PHÂN TÍCH SỰ BIỂU HIỆN CỦA GEN GmDREB7 TRÊN CÂY THUỐC LÁ 3.3.1 Kết chuyển cấu trúc mang gen GmDREB7 vào thuốc thông qua A tumefaciens Thực chuyển cấu trúc 35S-GmDREB7-cmyc vào thuốc N tabacum giống K326 thông qua chủng vi khuẩn A tumefaciens CV58 nhằm Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn mục đich đánh giá hoạt động vector chuyển gen pBI121_GmDREB7 mơ hình Vật liệu nhận gen mảnh có kich thước khoảng 1cm gây tổn thương nuôi cấy môi trường cảm ứng MS 48 trước lây nhiễm đồng nuôi cấy Tiến hành biến nạp gen cách ngâm mảnh cảm ứng vào dịch huyền phù vi khuẩn thời gian 20 phút Quá trình chuyển gen GmDREB7 vào thuốc thể hình 3.13 Hình 3.13 Hình mơ tả q trình biến nạp gen GmDREB7 tái sinh tạo thuốc chuyển gen kỹ thuật lây nhiễm A tumefaciens A: Mảnh ngâm dịch huyền phù vi khuẩn; B: Mảnh môi trường đồng nuôi cấy; C: Mảnh sau rửa khuẩn cấy môi trường chọn lọc; D: Tái sinh đa chồi; E: Các chồi môi trường rễ (RM); F,G: Cây thuốc môi trường rễ sau tuần; H: Ra bầu đất điều kiện nhà lưới Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn Bảng 3.3 trình bày kết biến nạp cấu trúc pBI121_GmDREB7 vào thuốc thông qua A.tumefaciens cho thấy, sau lần biến nạp chọn lọc kháng sinh, với 108 mảnh thuốc giống K326 có 96 mảnh tạo cụm chồi Số chồi tái sinh từ cụm chồi 265 chồi Số chồi đưa sang môi trường chọn lọc kéo dài chồi Số sống sót đưa vào môi trường rễ 202 Số rễ sống sót in vitro đưa bầu đất lựa chọn 45 sinh trưởng tốt để trồng nhà lưới Trong đó, lơ ĐC0*, 30 mảnh khơng có mẫu sống sót mơi trường chọn lọc kháng sinh Còn lơ ĐC1* khơng chuyển gen từ 30 mảnh có 92 chồi tái sinh, số rễ sống sót in vitro 86 đưa bầu đất lựa chọn 20 sinh trưởng tốt trồng nhà lưới làm đối chứng Bảng 3.3 Kết biến nạp cấu trúc pBI121_GmDREB7 vào thuốc Số mẫu Số chồi Số Số trồng tạo cụm tái rễ chồi sinh nhà lưới Thí nghiệm đối chứng Số mẫu biến nạp ĐC0* 30 0 0 ĐC1* 30 24 92 86 20 36 32 88 68 15 36 34 95 74 15 36 30 82 60 15 108 96 265 202 45 Lần Thi Lần nghiệm Lần Tổng Ghi chú: ĐC0*: Mẫu thuốc không chuyển gen cấy môi trường tái sinh có bổ sung kháng sinh; ĐC1*: Mẫu thuốc không chuyển gen cấy môi trường tái sinh khơng bổ sung kháng sinh Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 3.3.2 Phân tích có mặt biểu mức phiên mã gen chuyển GmDREB7 thuốc chuyển gen Thu non từ số 45 thuốc chuyển gen hệ T0 nhà lưới, tách chiết DNA tổng số Phân tich DNA tổng số điện di gel 0,8% cho kết DNA tổng số thu đảm bảo chất lượng để thực PCR Xác định có mặt gen chuyển GmDREB7 kỹ thuật PCR với cặp mồi XbaI-DREB7F/ DREB7-SacI-R, kết thể hình 3.14 0,6 kb Hình 3.14 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen GmDREB7 thuốc chuyển gen M: thang DNA kb; (+): đối chứng dương-sản phẩm nhân gen GmDREB7 từ vector chuyển gen PBI121_GmDREB7; (-): kết nhân gen GmDREB7 từ không chuyển gen; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9: kết nhân gen GmDREB7 từ thuốc chuyển gen Kết hình 3.14 cho thấy, thuốc chuyển gen phân tich có cho kết dương tinh với PCR, số 2, 4, 5, 6, 7, 8, ký hiệu T0-2; T0-4; T0-5; T0-6; T0-7; T0-8; T0-9 Như bước đầu nhận xét gen chuyển GmDREB7 có mặt hệ gen thuốc chuyển gen Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn Tiến hành thu non từ dương tinh với PCR, T0-2; T0-4; T0-5; T06; T0-7; T0-8; T0-9 để tách chiết RNA tổng số, tạo cDNA phân tich biểu gen GmDREB7 thơng qua q trình phiên mã kỹ thuật RT-PCR với cặp mồi XbaI-DREB7-F/ DREB7-R-SacI, kết thu thể hình 3.15 0,6 kb Hình 3.15 Kết điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR thuốc chuyển gen M: thang DNA kb; (+): đối chứng dương-sản phẩm nhân gen GmDREB7 từ vector chuyển gen PBI121_GmDREB7; (-): kết nhân gen GmDREB7 từ không chuyển gen; 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9: kết nhân cDNA GmDREB7 từ thuốc chuyển gen dương tính với PCR, tương ứng với T0-2; T0-4; T05; T0-6; T0-7; T0-8; T0-9 Kết hình 3.15 cho thấy dương tinh với PCR có cho sản phẩm RT-PCR, T0-2; T0-5; T0-6; T0-8; T0-9 Như vậy, ... (NAFOSTED) đề tài mã số 106.012018.27" với tên đề tài là: Biểu gen mã hóa nhân tố phiên mã dehydration responsive element binding đậu tương (GmDREB) để tăng khả chịu hạn chuyển gen GS.TS Chu Hoàng... thấy chuyển gen có khả chống chịu stress tốt khơng chuyển gen Gen DREB1A biểu tốt nhiều trồng khác Sự biểu mạnh AtDREB1A thuốc lá, lúa mì, lúa, lạc chứng minh khả chịu hạn tốt tăng cường biểu gen. .. AP2…………………………………… Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 1.2.1 Cây đậu tương …………………………………………… 1.2.2 Nhân tố phiên mã DREB đậu tương ……………… 1.3 Vector biểu gen thực vật