Nghiên cứu phân lập, tinh chế, thiết lập chất chuẩn để định tính, định lượng một số lignan trong quả của chi Cleistanthus, họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN LÂM HỒNG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, TINH CHẾ, THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN ĐỂ ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ LIGNAN TRONG QUẢ CỦA CHI CLEISANTHUS, HỌ THẦU DẦU (EUPHORBIACEAE) TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI, NĂM 2019 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VIỆN KIỂM NGHIỆM THUỐC TRUNG ƯƠNG VIỆN HÓA SINH BIỂN - VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ VIỆT NAM Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Trần Việt Hùng PGS TS Đoàn Thị Mai Hương Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Trường họp Vào hồi .phút .ngày tháng năm 2019 Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc gia Việt Nam Thư viện Trường Đại học Dược Hà Nội MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Trong khuôn khổ dự án “Nghiên cứu sàng lọc chất có hoạt tính sinh học từ thảm thực vật Việt Nam”, Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam phối hợp với Viện Hóa học hợp chất tự nhiên– Cộng hòa Pháp thu hái, định danh khoa học thử sàng lọc hoạt tính sinh học dịch chiết ethyl acetat 2,500 loài thực vật nước ta, bật dịch chiết từ Cách hoa Đông Dương (C indochinensis Merr ex Croiz), Chà chôi (C tonkinensis Jabl.) Cách hoa eberhardt (C eberhardtii Gagn) có phần trăm ức chế mạnh dịng tế bào ung thư biểu mơ KB từ 88,40 đến 95,17% Từ loài phân lập xác định cấu trúc nhiều hợp chất tinh khiết như: cleistantoxin, cleisindoside D…Một điều thú vị là, hợp chất cleistantoxin, cleisindoside D có cấu trúc hoá học gần giống etoposid teniposid dẫn chất glycosid podophyllotoxin sử dụng làm thuốc điều trị ung thư phổi, tinh hoàn, buồng trứng… Nghiên cứu liên quan cấu trúc cleistantoxin, cleisindoside D với tác dụng dược lí, chế gây độc tế bào cho thấy chất có khả ức chế enzym topoisomerase IIB enzym caspase dự đốn có hoạt tính kháng tế bào ung thư phù hợp với kết thử in vitro in vivo, cleistantoxin có hoạt tính kháng ung thư mạnh Từ kết đó, Đề tài độc lập cấp Nhà nước, mã số ĐTĐLCN.14/16 Bộ Khoa học Công nghệ tiến hành thử hoạt tính kháng ung thư cao khô chiết xuất từ Chà chôi chuột Nude cấy tế bào ung thư phổi người với liều 100mg/kg cân nặng, cho thấy 100% chuột sống kéo dài thời gian sống sau tuần điều trị so với nhóm chứng khơng dùng cao Vì vậy, cao khơ tiếp tục nghiên cứu, phát triển thành nguyên liệu thuốc Để xây dựng tiêu chuẩn cho cao khơ này, cần có chất chuẩn cleistantoxin cleisindoside D Tuy nhiên, chất nghiên cứu, phát triển thuốc nên giới chưa có chất chuẩn đối chiếu Vì vậy, cleistantoxin cleisindoside D phải thiết lập thành chất chuẩn gốc Đây lĩnh vực nghiên cứu mới, Việt Nam cịn chưa có cơng trình cơng bố thiết lập chuẩn gốc, chủ yếu thiết lập chuẩn thứ cấp Xuất phát từ nhu cầu thực tế, luận án “Nghiên cứu phân lập, tinh chế, thiết lập chất chuẩn để định tính, định lượng số lignan chi Cleistanthus, họ Thầu dầu (Euphorbiaceae)” cơng trình thiết lập hai chất chuẩn gốc định lượng cleistantoxin cleisindoside D từ Chà chơi (có hàm lượng chất cao nhất) với mục tiêu sau: - Mục tiêu 1: Phân lập, tinh chế khẳng định cấu trúc cleistantoxin cleisindoside D từ Chà chôi làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn xác định cấu trúc chất tinh khiết phân lập - Mục tiêu 2: Thiết lập hai chất chuẩn gốc định lượng cleistantoxin cleisindoside D - Mục tiêu 3: Xây dựng thẩm định phương pháp định tính định lượng số lignan chi Cách hoa (Cleistanthus) Những đóng góp luận án - Về mặt hoá học Lần phân lập, tinh chế xác định cấu trúc chất từ Chà chôi là: 7′,8′-dehydrocleistantoxin (CT1), cleistonkiside A (CT2), cleistonkinin A (CT3), cleistonkinin B (CT4), cleistonkiside B (CT5), cleistonkinen (CT6), cleistonkinin E (CT7), cleistonkinin C (CT8) - Về mặt thiết lập chất chuẩn Lần công bố: Tiêu chuẩn chất lượng nguyên liệu thiết lập chuẩn gốc định lượng cleistantoxin cleisindoside D theo hướng dẫn tổ chức y tế giới (WHO) thiết lập chất chuẩn theo hướng dẫn ISO GUIDE 35 Đóng 96 ống chất chuẩn gốc định lượng cleistantoxin có giá trị COA 99,3%, độ khơng đảm bảo đo 0,1%, nghiên cứu độ ổn định 18 tháng 76 ống chất chuẩn gốc định lượng cleisindoside D có giá trị COA 94,2%, độ không đảm bảo đo 0,4%, nghiên cứu độ ổn định 12 tháng Tiêu chuẩn chất lượng cho nguyên liệu thiết lập chất chuẩn gốc định tính 7’,8’-dehydrocleistantoxin (CT1) cleisindoside A Trong đó, có chất 7′,8′dehydrocleistantoxin chất phân lập từ Chà chôi phần xây dựng liệu nhận dạng chất 7′,8′-dehydrocleistantoxin cơng bố hồn tồn luận án Đóng ống chuẩn phân giải gồm chất chuẩn: cleisindoside A, cleisindoside D, cleistntoxin 7’,8’-dehydrocleistantoxin để đánh giá độ phù hợp hệ thống sắc kí - Về mặt kiểm nghiệm dược liệu thuốc dược liệu Lần ứng dụng chất chuẩn gốc định lượng chất chuẩn gốc định tính để xây dựng thẩm định phương pháp định lượng đồng thời cleisindoside D cleistantoxin định tính lignan: cleisindoside A, cleisindoside D, cleistntoxin 7’,8’-dehydrocleistantoxin chi Cách hoa chưa có cơng trình cơng bố kết Cấu trúc luận án Luận án gồm 148 trang, 76 hình 45 bảng Bố cục gồm phần: Đặt vấn đề (2 trang); Tổng quan (29 trang); đối tượng nội dung phương pháp nghiên cứu (14 trang); Kết nghiên cứu (80 trang); Bàn luận (22 trang); Kết luận kiến nghị (2 trang); Danh mục cơng trình cơng bố liên quan điến luận án (1 trang); Luận án có 96 tài liệu tham khảo 240 trang phụ lục NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN CHƯƠNG TỔNG QUAN Đã tổng quan nội dung liên quan đến luận án gồm có: - Tổng quan chi Cách hoa (Cleistanthus), tình hình nghiên cứu thành phần hố học hoạt tính kháng ung thư chi Cleistanthus giới Việt Nam - Tổng quan nhóm chất lignan: khái niệm, phân loại, số aryltetralin lignan phát triển thành thuốc điều trị ung thư, số hoạt chất nhóm aryltetralin lignan phân lập từ thuộc chi Cleistanthus số phương pháp phân tích hoạt chất nhóm aryltetralin lignan thực vật - Tổng quan chất chuẩn: khái niệm phân loại chất chuẩn gồm: chất chuẩn gốc (PCRS) chất chuẩn thứ cấp (SCRS), tổng quan số hướng dẫn thiết lập chất chuẩn Theo ISO 17034 ISO GUIDE 35 quy trình thiết lập chất chuẩn gồm bước: xác định nhu cầu thiết lập chất chuẩn, thu thập nguồn nguyên liệu, chuẩn bị nguyên liệu thiết lập chuẩn, đóng ống chuẩn, đánh giá độ đồng nhất, xác định đặc tính, xác định giá trị ấn định COA, dán nhãn, bảo quản nghiên cứu độ ổn định - Tổng quan xác định đặc tính chất chuẩn gốc: Theo hướng dẫn IP, USP, WHO tiêu xác định đặc tính (characterization) chất chuẩn gốc gồm liệu nhận dạng chất chuẩn gốc: cảm quan, nhiệt độ nóng chảy, góc quay cực riêng, phổ IR, NMR, MS, UV…và xác định độ tinh khiết chất chuẩn gốc phương pháp cân khối lượng: xác định tạp chất liên quan tạp chất phân huỷ kỹ thuật: HPLC/DAD, xác định tạp chất vô phương pháp cắn sau nung (residue on ignition-ROI) hay tro sulfat, xác định hàm lượng tạp chất bay khối lượng làm khơ phân tích nhiệt lượng TGA; xác định độ tinh khiết trực tiếp kỹ thuật: DSC… CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU  Đối tượng để phân lập, tinh chế cleistantoxin cleisindoside D làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn Hình 2.1 Sơ đồ qui trình chiết xuất cao cồn khơ từ Chà chôi 168 g cao cồn khô chiết xuất theo sơ đồ (Hình 2.1) từ Chà chôi hay Cọc rào (Cleistanthus tonkinensis, Jabl;) thu hái ngày 06/06/2016, Đại từ-La Bằng-Thái Nguyên, kí hiệu VN 0308 (LB-TN) để phân lập, tinh chế chất tinh khiết làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn  Đối tượng để phân tích định tính, định lượng số lignan chi Cách hoa (Cleistanthus) Quả Chà chôi hay Cọc rào (Cleistanthus tonkinensis, Jabl.) thu hái ngày 16/06/2018, Đại từ-La Bằng-Thái Nguyên, kí hiệu ĐL 2338 (LB-TN) Quả Cách hoa eberhardt (Cleistanthus eberhardtii, Gagn), thu hái ngày 08/06/2018 Phú lộc-Thừa Thiên Huế, kí hiệu ĐL 2151 (PL-TTH) Xác định tên loài lưu giữ mẫu Viện Tài nguyên sinh tháiViện hàn lâm khoa học cơng nghệ Việt Nam 2.2 HỐ CHẤT VÀ TRANG THIẾT BỊ - Chất tinh khiết cleistantoxin cleisindoside D phân lập từ Cách hoa Đông dương Hai chất đo phổ xác định cấu trúc cleistantoxin cleisindoside D (Phòng tổng hợp hữu cơ-Viện Hoá sinh biển- Viện HL KH&CN VN) 2.2.1 Hoá chất - Hố chất, dung mơi để chiết xuất, phân lập, tinh chế đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích Hố chất, dung mơi chạy HPLC đo phổ NMR (Merck) 2.2.2 Thiết bị nghiên cứu - Thiết bị nghiên cứu phân lập, xác định cấu trúc phân tích Viện Hoá học Viện Hoá sinh biển-Viện HL KH & CN VN, Bộ mơn Hố Phân tích Độc chất, ĐH Dược HN, Viện KNT TƯ, Viện KNT TPHCM 2.3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Các nội dung nghiên cứu luận án bao gồm: - Phân lập, tinh chế khẳng định cấu trúc chất cleistantoxin, cleisindoside D từ Chà chôi làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn - Xây dựng liệu phổ nhận dạng các chất cleistantoxin, cleisindoside D nhiệt độ nóng chảy, góc quay cực riêng, phổ UV, IR, MS, NMR - Xây dựng phương pháp xác định tạp chất hữu cơ, vô tạp chất bay chất cleistantoxin, cleisindoside D - Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho nguyên liệu thiết lập chất chuẩn gốc định lượng cleistantoxin, cleisindoside D - Thiết lập chất chuẩn gốc định lượng cleistantoxin, cleisindoside D - Xây dựng thẩm định phương pháp định tính, định lượng số lignan chi Cách hoa - Áp dụng phương pháp xây dựng bước đầu định tính, định lượng số lignan chi Cách hoa 2.3.1 Phương pháp phân lập, tinh chế khẳng định cấu trúc chất tinh khiết - Phân lập chất sắc ký cột cổ điển nhồi silica gel, sephadex LH-20, SK lớp mỏng bán điều chế silica gel 60 GF254 silica gel 60 RP-18 GF254 (Merck) - Tinh chế chất tinh khiết bằng: kết tinh cột cổ điển nhồi hạt Silica gel pha đảo YMC-GEL ODS-A có cỡ hạt 75 μm (YMC) - Xác định độ tinh khiết nguyên liệu thiết lập chất chuẩn HPLC/DAD sử dụng phương pháp chuẩn hoá diện tích - Khẳng định cấu trúc số chất tinh khiết nhóm lignan làm NLTLCC: phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) chiều (HSQC, HMBC, COSY, NOESY), phổ khối lượng phân giải cao (HR-MS), phổ hồng ngoại (IR), phổ lưỡng sắc trịn (CD), góc quay cực riêng ([α]D20) 2.3.2 Thiết lập chất chuẩn gốc Thiết lập chất chuẩn gốc định lượng - Xây dựng liệu nhận dạng chất tinh khiết làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn: Phổ 1H NMR, 13C NMR, HR-MS, IR, UV-VIS, nhiệt độ nóng chảy, góc quay cực riêng ([α]D20)… - Xây dựng thẩm định phương pháp xác định độ tinh khiết sắc kí hàm lượng tạp chất liên quan HPLC/DAD, phương pháp xác định hàm lượng tạp chất vô phép thử tro sulfat tạp chất bay TGA - Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho chất chuẩn gốc định lượng Bảng 2.1 Tóm tắt tiêu chuẩn chất lượng chất chuẩn gốc định lượng STT Mức chất Phương Yêu cầu lượng đề nghị pháp thử Tính chất Dạng thù hình, màu sắc, mùi vị, độ tan DĐVN V Nhiệt độ nóng Nhiệt độ nóng chảy phải phù hợp với điểm chảy DSC chảy TL công bố Góc quay cực Giá trị GQC phải phù hợp với GQC TL phụ lục 6.4 riêng công bố DĐVN V Bộ liệu phổ chuẩn Dữ liệu phổ HR-MS phải có số khối đặc trưng Phổ HR-MS HR-MS phù hợp với TL công bố Dữ liệu phổ NMR phải phù hợp với phổ chất Phổ NMR NMR tinh khiết TL công bố Phải có dao động đặc trưng theo cấu trúc hố học Phổ IR IR chất tinh khiết TL cơng bố Dữ liệu phổ UV-VIS phải có max trùng với Phổ UV-VIS UV-VIS phổ chất tinh khiết TL công bố Độ tinh khiết HPLC/DAD Không nhỏ 95% sắc kí tính chuẩn hố Tạp chất liên Khơng lớn 5% diện tích quan Tạp chất bay Không thấp giới hạn cho phép (tuỳ TGA thuộc vào nguyên liệu thiết lập chuẩn) Tạp chất vô Không lớn 0,1% Tro sulfat Độ tinh khiết Không thấp giới hạn cho phép (tuỳ DSC DSC thuộc vào nguyên liệu thiết lập chuẩn) - Thiết lập chất chuẩn gốc định lượng • Đóng ống chất chuẩn, dán nhãn bảo quản ống chuẩn, nghiên cứu độ ổn định chất chuẩn theo hướng dẫn ISO GUIDE 35 • Đánh giá độ đồng q trình đóng ống • Xác định giá trị ấn định COA từ PTN: Xác định độ tinh khiết sắc kí HPLC/DAD hàm lượng tạp chất bay TGA PTN đạt tiêu chuẩn GLP ISO 17025 Mỗi PTN nhận ống chất chuẩn lấy ngẫu nhiên tiêu chuẩn sở để tiến hành phân tích Tập hợp kết ba PTN tham gia (n = 18), đánh giá kết test ANOVA yếu tố, so sánh giá trị Ftn Flt Khi Ftn > Flt kết trung bình phịng thí nghiệm khác có ý nghĩa, giá trị độ tinh khiết sắc kí hàm lượng tạp chất bay lấy từ kết trung bình PTN • Xác định giá trị ấn định công bố phiếu kiểm nghiệm COA phương pháp cân khối lượng (mass-balance): Độ tinh khiết = Độ tinh khiết sắc kí × (100- % tạp bay - % tạp vơ cơ)/100 • Xác định độ không đảm bảo đo: Độ không đảm bảo đo hàm lượng tạp chất liên quan HPLC/DAD tạp chất bay TGA Mỗi chất chuẩn gửi đến PKN, phòng ống, tiến hành phân tích mẫu cho tiêu độ tinh khiết sắc kí hàm lượng tạp chất bay txS Độ không đảm đo chuẩn PKN : us = √N Trong đó: N : Số lần lặp lại thí nghiệm t : Giá trị tra bảng test Student S : Độ lệch chuẩn Độ không đảm bảo đo kết hợp PKN (U combined-Uc) Uc = √u2s1 + u2s2 + u2s3 Độ không đảm bảo đo lan truyền kết tro sulfat theo công thức: UKhối lượng Tro sulfat = Uchế phẩm = √u2s1 + u2s2 Uchế phẩm UTro sulfat ) + ( ) UHàm lượng tro sulfat mTro sulfat mchế phẩm Tiến hành phép thử tro sulfat lần lấy giá trị trung bình, nên: = HLTro sulfat x √( Uc kết hợp tro sulfat = √u2thử + u2thử Độ khơng đảm bảo đo mở rộng tính cho tổng kết phép thử tạp chất liên quan, tạp chất bay tro sulfat theo công thức: 𝐔𝐦𝐫 = √𝐮𝟐𝐜𝟏 + 𝐮𝟐𝐜𝟐 + 𝐮𝟐𝐜â𝐧 Giá trị cơng bố chứng phân tích: X  Umr Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho chất chuẩn định tính Bảng 2.2 Tóm tắt tiêu chuẩn chất lượng chất chuẩn định tính STT Mức chất Phương Yêu cầu lượng đề nghị pháp thử Tính chất Dạng thù hình, màu sắc, mùi vị, độ tan DĐVN V Nhiệt độ nóng Nhiệt độ nóng chảy phải phù hợp với điểm chảy DSC chảy TL cơng bố Góc quay cực Giá trị GQC phải phù hợp với GQC TL phụ lục 6.4 riêng công bố DĐVN V Bộ liệu phổ chuẩn Dữ liệu phổ HR-MS phải có số khối đặc trưng Phổ HR-MS HR-MS phù hợp với TL công bố Dữ liệu phổ NMR phải phù hợp với phổ chất Phổ NMR NMR tinh khiết TL cơng bố Phải có dao động đặc trưng theo cấu trúc hoá học Phổ IR IR chất tinh khiết TL công bố Dữ liệu phổ UV-VIS phải có max đặc trưng Phổ UV-VIS phù hợp với phổ chất tinh khiết TL UV-VIS công bố Độ tinh khiết HPLC/DAD Không nhỏ 90% sắc kí tính chuẩn hố Tạp chất liên Khơng lớn 10% diện tích quan 2.3.3 Xây dựng phương pháp định tính định lượng đồng thời số lignan chi Cách hoa Xác định độ ẩm bột chi Cleistanthus Xác định độ ẩm dược liệu phương pháp khối lượng làm khô (Phụ lục 9.6, DĐVN V) Xây dựng phương pháp định tính đồng thời số lignan chi Cách hoa HPLC/DAD - Khảo sát chương trình sắc kí: pha tĩnh, pha động, chương trình gradient, bước sóng phát Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời cleistantoxin cleisindoside D Chà chôi HPLC/DAD - Xây dựng qui trình chiết xuất đồng thời cleistantoxin cleisindoside D Chà chôi: khảo sát dung môi, kĩ thuật chiết, thời gian chiết… - Tính hàm lượng hoạt chất ST x Cc x DT x 100% HL% = SC x M x (100 − X) x 100 x 1000 Thẩm định phương pháp phân tích HPLC/DAD Thẩm định phương pháp theo hướng dẫn ICH: độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ lặp lại, độ giới hạn định lượng (LOQ) Áp dụng Xây dựng phương pháp định tính, định lượng đồng thời số lignan chi Cách hoa HPLC/DAD Quả Chà chôi Cách hoa eberhardt CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 PHÂN LẬP, TINH CHẾ VÀ KHẲNG ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA CLEISTANTOXIN VÀ CLEISINDOSIDE D Qua khảo sát hàm lượng số hoạt chất cao khơ có hoạt tính kháng ung thư chuột Nude chi Cách hoa (Cleistanthus), tìm thấy hoạt chất cleistantoxin, cleisindoside D (glycosid cleistantoxin) có hoạt tính sinh học, hàm lượng cao chất đặc trưng chi Vì vậy, lựa chọn hai chất tinh khiết để thiết lập chất chuẩn định lượng Bên cạnh đó, tìm thấy Chà chơi có hàm lượng cleistantoxin, cleisindoside D cao nhất, nên sử dụng nguồn thực vật để phân lập, tinh chế cleistantoxin, cleisindoside D làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn 3.1.1 Phân lập thô cleistantoxin cleisindoside D cột silica gel Để phân lập chất cleistantoxin cleisindoside D làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn sử dụng cột thuỷ tinh trung tính (80x10 cm) nhồi silica gel 60 (40-63 m) Dùng hệ dung mơi rửa giải CH2Cl2 sau thêm MeOH với tỉ lệ tăng dần từ 2, 5, 10 100% Kiểm tra bình giống SKLM, gom bình giống vào thành phân đoạn, thu 23 phân đoạn (Phụ lục 1.2) Các phân đoạn chấm lên mỏng với chất tinh khiết cleistantoxin cleisindoside D để tìm phân đoạn có chứa cleistantoxin cleisindoside D (Hình 3.1 3.2) Trên SKĐ nhận thấy phân đoạn PĐ 7, 8, 9, 10 xuất vết có màu soi đèn UV 254 nm màu thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc, tương ứng với vết chất cleistantoxin tinh khiết (Hình 3.1), gom PĐ7, 8, 9, 10 có chứa chất cleistantoxin, đem cô chân không 10,6916 g cắn A (a): Phát 254 nm (c): Hiện màu TT valinin/H2SO4 đặc Hình 3.1 SKĐ phát cleistantoxin phân đoạn từ PĐ1-14 hợp chất từ tự nhiên, cơng trình lần cơng bố phân lập hợp chất nhóm aryltetralin lignan phân lập từ Chà chơi Trong đó, phân lập khoảng 0,5 g CT1 làm nguyên liệu thiết lập chuẩn định tính Vì phần xác định cấu trúc CT1 liệu để xây dựng liệu nhận dạng chất chuẩn định tính Cleisindoside D (Chuẩn định lượng) Cleisindoside A (Chuẩn định tính) 7’,8’-dehydrocleistantoxin (CT1- Chuẩn định tính) CT2 (Cleistonkiside A) CT3 (Cleistonkinin A) CT4 (Cleistonkinin B) CT5 (Cleistonkiside D) CT6 (Cleistonkinen) CT7 (Cleistonkinin E) CT8 (Cleistonkinin C) Cleistantoxin (Chuẩn định lượng) Hình 4.1 Cơng thức cấu tạo chất chuẩn chất phân lập Chà chôi 3.2 THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN GỐC 3.2.1 Thiết lập chất chuẩn gốc định lượng cleistantoxin cleisindoside D Xây dựng liệu nhận dạng cleistantoxin cleisindoside D Kết khẳng định cấu trúc chất cleistantoxin cleisindoside D 1D 2D-NMR, HR-MS, IR, UV-VIS, CD…cho thấy phổ chất phân lập trùng với liệu công bố chất cleistantoxin cleisindoside D Từ đó, xây dựng liệu nhận dạng chất chuẩn gốc định lượng cleistantoxin cleisindoside D gồm: tính chất, nhiệt độ nóng chảy, góc quay cực riêng, phổ 1H, 13C-NMR, HR-MS, IR UV-VIS dựa tài liệu công bố kết thực nghiệm luận án (phụ lục 1.3 1.4) Xây dựng thẩm định phương pháp xác định độ tinh khiết sắc kí cleistantoxin cleisindoside D HPLC/DAD - Xây dựng phương pháp xác định độ tinh khiết sắc kí tạp chất liên quan cleistantoxin cleisindoside D Cột: Inertsil® ODS-3 (250 x 4,6 mm; m) 11 Chương trình sắc kí trình bày bảng 3.12 Bảng 3.12 Chương trình sắc kí định lượng TCLQ Chương trình gradient cleistantoxin % %H2O Thời gian (phút) ACN 30 70 20 50 50 50 70 30 55 30 70 Thời gian phân tích 60 phút Tốc độ dịng 1,5 ml/phút Thể tích tiêm: 30 µL Nhiệt độ cột: nhiệt độ phịng Chương trình gradient cleisindoside D % ACN %H2O Thời gian (phút) 27 40 50 45 73 50 27 Thời gian phân tích 55 phút Tốc độ dịng 1,0 ml/phút Thể tích tiêm: 20 µL Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng 73 50 27 73 - Thẩm định phương pháp xác định độ tinh khiết sắc kí tạp chất liên quan cleistantoxin cleisindosid D theo hướng dẫn ICH Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho chất chuẩn gốc định lượng cleistantoxin cleisindoside D Bảng 3.21 Tóm tắt tiêu chuẩn chất lượng chất chuẩn gốc định lượng cleistantoxin Chỉ tiêu tiêu chuẩn áp dụng Định tính Yêu cầu Phương pháp thử Bột kết tinh màu trắng, dễ tan dicloromethan, ACN aceton, khó tan Phương pháp thử độ tan MeOH, ethanol 960 nước Mao quản Nhiệt độ 199OC đến 202OC quét nóng chảy nhiệt vi sai Xác định góc O O Góc quay [𝛼]20 𝐷 = -130,0 đến -135,0 quay cực cực riêng (dung dịch 0,5% chloroform) riêng Phổ hấp thụ tử ngoại dung dịch thử 0,02 Phổ hấp thụ Phổ UV- mg/ml ACN có hai cực đại hấp thụ buớc sóng tử ngoại khả VIS 203 286 nm  nm kiến Phổ IR khoảng số sóng từ 4000 đến 400 Phổ hồng cm-1 có đỉnh đặc trưng khoảng: Phổ hồng ngoại (IR) 3565, 3466, 2931, 1773, 1617, 1483, 1297, ngoại 1230, 1142, 1047  20 cm-1 Phổ cộng Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR có Phổ 1Hhưởng từ độ chuyển dịch hoá học đặc trưng: 6,72; 6,66; NMR hạt nhân 6,64; 6,22; 5,91; 5,88; 5,87; 5,86; 4,99; 4,59; (CDCl3, 500 H-NMR 4,47; 4,12; 4,02; 2,84; 2,71  0,5 ppm MHz) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR có Phổ cộng độ chuyển dịch đặc trưng: 38,7; 43,9; 44,6; Phổ 13Chưởng từ 59,8; 70,4; 71,8; 101,2; 100,9; 104,1; 107,6; NMR hạt nhân 111,1; 124,1; 124,7; 132,9; 133,0; 134,9; (CDCl3, 125 13 C-NMR MHz) 141,5; 146,5; 147,2; 149,4; 174,2  0,5 ppm Tính chất 12 Phổ HRMS Tạp chất bay m/z 421,0888 [M+Na]+ (tính tốn lí thuyết cho cơng thức phân tử C21H18O8Na, 421,0899) Phổ HR-MS Phương pháp TGA Phương pháp Tro sulfat Không lớn 0,1% tro sulfat Tạp chất Từng tạp đơn: Không lớn 0,1% Phương pháp liên quan Tổng tạp: Khơng lớn 0,5% HPLC (Tính Độ tinh chuẩn hố khiết sắc Độ tinh khiết sắc ký khơng nhỏ 99,5% diện tích) kí Độ tinh Độ tinh khiết DSC nguyên liệu thiết lập Quét nhiệt vi khiết DSC chuẩn không nhỏ 99,0% sai Không lớn 1,0% Bảng 3.22 Tiêu chuẩn chất lượng chất chuẩn gốc định lượng cleisindoside D Chỉ tiêu tiêu chuẩn áp dụng Tính chất Nhiệt độ nóng chảy Góc quay cực riêng Phổ UV-VIS Phổ hồng ngoại IR (KBr) Phổ cộng hưởng từ hạt Định nhân 1Htính NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13CNMR Phương pháp thử Bột kết tinh màu trắng, dễ tan Phương pháp dicloromethan, ACN aceton, MeOH thử độ tan Quét nhiệt vi o o 225 C đến 228 C sai o Xác định góc [𝛼]20 𝐷 = -150,0 đến -157,0 quay cực riêng (dung dịch 0,5% methanol) Phổ hấp thụ tử ngoại dung dịch thử 0,02 Phổ hấp thụ tử mg/ml ACN-H2O (1-1) có hai cực đại ngoại khả kiến hấp thụ bước sóng 203 286 nm  nm Phổ IR có đỉnh đặc trưng khoảng: 1035; 1073; 1235; 1475; 1619; 1772; 2932; Phổ hồng ngoại 3419 cm-1 + 20 cm-1 Phổ 1H-NMR có độ chuyển dịch đặc trưng: 2,70; 3,04; 3,18; 3,28; 3,39; 3,41; 3,67; 3,99; Phổ 1H-NMR 4,07; 4,34; 4,45; 4,64; 5,28 5,83; 5,84; 5,89; 5,93; 6,26; 6,65; 6,69  0,5 ppm Phổ 13C-NMR có độ chuyển dịch đặc trưng: 38,4; 44,0; 45,5; 59,9; 61,5; 69,8; 72; 73,5; 75,2; 76,0; 76,3; 99,4; 100,9; 101,5; 13 104,8; 107,6; 110,7; 122; 123,8; 132,8; 135,3; Phổ C-NMR 136,8; 142,1; 146,6; 147,3; 149,9; 174,2  0,5 ppm Mảnh đặc trưng m/z = 583,1409 (M+Na)+ Phổ HR-MS Phương pháp Không lớn 5,0% TGA Không lớn 0,1% Tro sulfat Từng tạp đơn: Không lớn 3,0% HPLC (Tính Tổng tạp: Khơng lớn 5,0% chuẩn hố diện tích) Khơng nhỏ 95,0% Yêu cầu Phổ HR-MS Tạp chất bay Tro sulfat Tạp chất liên quan Độ tinh khiết sắc kí Độ tinh khiết Độ tinh khiết DSC chất chuẩn không DSC nhỏ 95,0% 13 Quét nhiệt vi sai Thiết lập chất chuẩn gốc định lượng cleistantoxin clesindoside D Đã đóng 96 ống chất chuẩn gốc cleistantoxin, xác định giá trị COA 99,3%, độ không đảm bảo đo 0,1% nghiên cứu độ ổn định 18 tháng 76 ống chất chuẩn gốc cleisindoside D, xác định giá trị COA 94,2%, độ không đảm bảo đo 0,4% nghiên cứu độ ổn định 12 tháng Hàm lượng ghi ống chuẩn giá trị ấn định  2.Umr (Hình 3.46) 99,3  0,2 % (a) 94,2  0,8 % (b) Hình 3.46 Hàm lượng cơng bố ống chuẩn cleistantoxin (a) cleisindoside D (b) 3.2.2 Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho chất chuẩn định tính cleisindoside A 7’,8’-dehydrocleistantoxin (chất mới-CT1) Bảng 3.34 Tiêu chuẩn chất lượng chất chuẩn định tính cleisindoside A Chỉ tiêu tiêu chuẩn áp dụng Tính chất Nhiệt độ nóng chảy Góc quay cực riêng Phổ UVVIS Phổ hồng ngoại (IR) Định tính Phổ cộng hưởng từ hạt nhân H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13 C-NMR Phổ HRESI-MS Tạp chất liên quan Độ tinh khiết sắc kí Phương pháp thử Bột kết tinh màu trắng, dễ tan dicloromethan, Phương pháp ACN MeOH aceton, khó tan nước thử độ tan Quét nhiệt vi 230OC đến 233OC sai Xác định góc O O [𝛼]20 = -48,0 đến -53,0 𝐷 quay cực (dung dịch 0,5% chloroform) riêng Phổ hấp thụ tử ngoại dung dịch thử 0,02 mg/ml Phổ hấp thụ ACN khoảng từ 200 đến 400 nm có hai cực tử ngoại khả kiến đại hấp thụ buớc sóng 203, 251 344  nm Phổ IR khoảng số sóng từ 4000 đến 400 cm-1 có Phổ hồng đỉnh đặc trưng khoảng: 3444, 2910, 1773, ngoại 1626, 1491, 1244, 1382, 1080, 1034  20 cm-1 Phổ H-NMR có độ chuyển dịch hoá học đặc trưng: 7,04; 6,75; 6,54; 6,50; 6,37; 6,01; 6,02; Phổ 1H-NMR 5,95; 5,94; 5,02; 4,97; 4,89; 4,89; 4,63; 4,52 ; 4,36; (DMSO, 500 4,32; 4,25; 3,76; 3,46; 3,39; 3,12; 3,11; 3,03; 3,01; MHz) 2,85  0,5 ppm Phổ 13C-NMR có độ chuyển dịch đặc trưng: 43,1; 13 60,9; 70,8; 73,4; 101,6; 102,5; 104,7; 108,3 110,5; 119,6; Phổ C-NMR (DMSO, 125 123,8; 126,3; 128,4; 130,4; 139,9; 142,5; 145,6; 147,2; MHz), 147,7; 148,5; 168,4  0,5 ppm Có mảnh m/z 553,1323 [M+Na]+ tính tốn cho Phổ HRESIcơng thức phân tử C26H26NaO12 MS Từng tạp đơn: Không lớn 5,0% HPLC Tổng tạp: Khơng lớn 10,0% (Tính Độ tinh khiết sắc ký nguyên liệu thiết lập chất chuẩn hố diện tích) chuẩn khơng nhỏ 90,0% Yêu cầu 14 Bảng 3.35 Tiêu chuẩn chất lượng chuẩn định tính 7’,8’-dehydrocleistantoxin Chỉ tiêu tiêu chuẩn áp dụng Tính chất Phổ 1HNMR Phổ 13CNMR Phương pháp thử Bột kết tinh màu trắng, dễ tan dicloromethan, ACN aceton, khó tan MeOH nước Phương pháp thử độ tan Nhiệt độ 327OC đến 330OC nóng chảy O O Góc quay [𝛼]20 𝐷 = + 85,0 đến + 90,0 cực riêng (dung dịch 0,042% chloroform) Phổ hấp thụ tử ngoại dung dịch thử 0,02 Phổ UV- mg/ml ACN có hai cực đại hấp thụ buớc sóng VIS 203 286  nm Phổ hồng ngoại (IR) Định tính Yêu cầu Phổ HRESIMS Tạp chất liên quan Độ tinh khiết sắc kí Quét nhiệt vi sai Xác định góc quay cực riêng Phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến Phổ IR có đỉnh đặc trưng: 3547, 2912, 1745, 1656, 1602, 1489, 1440, 1396, 1346, 1240, 1195, Phổ hồng ngoại 1114, 1051, 1004, 929, 854, 821 + 20 cm-1 Phổ 1H-NMR có độ chuyển dịch hoá học đặc trưng: 6,87; 6,64; 6,59; 6,07; 5,96; 5,95; 5,29; 5,12; 4,64; 4,12; 3,91; 3,38  0,5 ppm Phổ 13C-NMR có độ chuyển dịch đặc trưng: 38,22; 44,16; 45,60; 60,14; 71,99; 76,33; 101,15; 101,15; 105,16; 107,86; 110,79; 121,61; 123,95; 132,85; 135,7; 136,8; 142,00; 146,79; 147,39; 150,25; 173,97  0,5 ppm m/z 419,0749 [M+Na]+ Phổ 1H-NMR Phổ 13C-NMR Phổ HR-MS Từng tạp đơn: Không lớn 5,0% HPLC Tổng tạp: Khơng lớn 10,0% (Tính Độ tinh khiết sắc ký chất chuẩn khơng chuẩn hố diện tích) nhỏ 90,0% TĨM LẠI: Đã thiết lập chất chuẩn gốc định lượng cleisindoside D (đóng 76 ống chuẩn khối lượng 10 mg, độ tinh khiết 94,2%) cleistantoxin (đóng 96 ống chuẩn khối lượng 10 mg, độ tinh khiết 99,3%) Đã chuẩn bị nguyên liệu thiết lập chuẩn gốc định tính cleisindoside A độ tinh khiết sắc kí 95,8% 7’,8’-dehydrocleistantoxin 94,4% Vì vậy, cần tiến hành xây dựng phương pháp định tính cleisindoside A, cleisindoside D, cleistantoxin, 7’,8’-dehydrocleistantoxin định lượng đồng thời cleisindoside D, cleistantoxin chi Cách hoa 3.3 XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ LIGNAN TRONG QUẢ CỦA CHI CÁCH HOA (CLEISTANTHUS) 3.3.1 Xây dựng phương pháp định tính đồng thời lignan chi Cách hoa HPLC/DAD Lựa chọn điều kiện sắc kí - Lựa chọn cột sắc kí: Inertsil® ODS-3 C18 (250 x 4,6 mm; 5µm) - Pha động: ACN : Nước 15 - Chương trình gradient bảng 3.28 Bảng 3.28 Chương trình gradient tách hỗn hợp chất STT Thời gian (phút) A 30 12 38 13 38 30 50 31 30 Thời gian phân tích 35 phút B 70 62 62 50 70 Tốc độ dòng 1,0 mL/phút 1,5 mL/phút 1,0 mL/phút 1,0 mL/phút 1,0 mL/phút - Bước sóng: 286 nm - Thể tích tiêm: 20 µL Đã định tính chất cleisindoside A, cleisindoside D, cleistantoxin 7’,8’-dehydrocleistantoxin SKĐ mẫu thử Chà chôi Cách hoa eberhardt khơng có chất 7’,8’-dehydrocleistantoxin Quả Chà chơi Quả Cách hoa eberhardt Hình 3.61 SKĐ định tính số lồi thuộc chi Cách hoa 3.3.2 Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời cleisindoside D cleistantoxin Chà chôi HPLC/DAD Xây dựng qui trình chiết xuất cleisindoside D cleistantoxin Hình 3.47 Qui trình chiết cleisindosid D cleistantoxin dược liệu 16 Thẩm định phương pháp định lượng đồng thời cleisindosid D, cleistantoxin HPLC/DAD Thẩm định phương pháp theo hướng dẫn ICH với tiêu sau: độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính (r=0,9997>0,998), độ lặp lại, độ tái lặp (RSD% 95% để làm chuẩn định lượng Cải thiện qui trình phân lập, tinh chế cleisindoside A để thu lượng chất lớn có độ tinh khiết sắc kí >95% đủ điều kiện để làm chuẩn định lượng Áp dụng phương pháp xây dựng để định tính lignan định lượng đồng thời cleisindoside D cleistantoxin khác chi Cách hoa thu hái nhiều địa điểm thời điểm thu hái khác xây dựng tiêu chuẩn cho dược liệu cao khô chiết xuất từ Chà chôi nghiên cứu, phát triển thành thuốc điều trị ung thư 24 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Các cơng trình liên quan đến luận án cơng bố: 03 cơng trình Nguyễn Lâm Hồng, Đào Tú Anh, Lê Công Vinh, Phạm Văn Cường, Đoàn Thị Mai Hương, Trần Việt Hùng (2018), “Nghiên cứu phân lập, nhận dạng cleistantoxin từ Chà chôi (Cleistanthus tonkinensis Jabl., Euphorbiaceae) làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn”, Tạp chí Dược học, Số 512, năm 58, Số 12/2018, 21-24 Nguyễn Lâm Hồng, Đào Tú Anh, Lê Cơng Vinh, Phạm Văn Cường, Đồn Thị Mai Hương, Nguyễn Thị Hằng, Trần Việt Hùng (2019), “Xác định độ tinh khiết nguyên liệu thiết lập chất chuẩn cleistantoxin phân lập từ chà chôi (Cleistanthus tonkinensis Jabl Euphorbiaceae) phương pháp cân khối lượng (Mass-balance)”, Tạp chí Dược học, Số 514, năm 59, Số 2/2019, 69-74 Lam Hong Nguyen, Van Nam Vu, Dao Phi Thi, Viet Hung Tran, Marc Litaudon, Fanny Roussi, Van Hung Nguyen, Minh Chau Van, Huong Doan-Thi-Mai, Van Cuong Pham (2019), “Cytotoxic Lignans from Fruits of Cleistanthus tonkinensis”, Fitoterapia (online) DOI: 10.1016/j.fitote.2019.10443 Impact factor: 2.642 ... định lượng số lignan chi Cách hoa - Áp dụng phương pháp xây dựng bước đầu định tính, định lượng số lignan chi Cách hoa 2.3.1 Phương pháp phân lập, tinh chế khẳng định cấu trúc chất tinh khiết -... cleistantoxin chi Cách hoa 3.3 XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ LIGNAN TRONG QUẢ CỦA CHI CÁCH HOA (CLEISTANTHUS) 3.3.1 Xây dựng phương pháp định tính đồng thời lignan chi. .. chi? ??t xuất đồng thời cleisindoside D cleistantoxin Chà chôi, kết cho thấy chi? ??t Shoxlet 2,5 có hiệu xuất chi? ??t cao Luận án tiến hành kiểm tra sau 2,5 chi? ??t Soxhlet chi? ??t kiệt chất Qui trình chi? ??t